一種異香豆素類化合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種異香豆素類化合物及其制 備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 曲霉屬真菌廣泛存在于自然界中。其中，米曲霉是一種能產(chǎn)生復(fù)合酶的菌株，該菌 株除可產(chǎn)生蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等多種功能的酶，因而廣泛 應(yīng)用于食品、飼料、釀酒等發(fā)酵工業(yè)。同時(shí)，米曲霉次生代謝產(chǎn)物也被認(rèn)為是一個(gè)亟待開發(fā) 的重要資源。從不同來(lái)源的米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中也分離得到了一系列具有生物活性的天然產(chǎn) 物，包括了生物堿、多肽、萜類化合物以及多酚類化合物。如從海洋生物紅藻 Heterosiphonia japonica中分離得到的米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了一系列新穎的Π 引噪 二砲類化合物asporyzins A-C。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明以百合科重樓屬漬重樓(Paris polyphylla var. yunnanensis)中分離得 到的曲霉屬內(nèi)生真菌米曲霉的固態(tài)發(fā)酵物為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、硅膠柱層析、高壓液相 色譜分離得到一個(gè)新的異香豆素類化合物米曲霉素 B，該化合物是從自然界中發(fā)現(xiàn)的具有 罕見(jiàn)2-羰基-丙基和3-羥基-丙基片段的異香豆素類化合物，并且該化合物具顯著的有抗輪 狀病毒活，應(yīng)用前景突出。
[0004] 本發(fā)明的第一目的是提供一種異香豆素類化合物;第二目的在于提供所述異香豆 素類化合物的制備方法;第三目的在于提供所述異香豆素類化合物的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的異香豆素類化合物是以百合科植物滇重 樓（Paris polyphylla var. yunnanensis)中得到的曲霉屬真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)為基礎(chǔ)，經(jīng)菌種分離、菌種培養(yǎng)、規(guī)模化發(fā)酵、有機(jī)溶劑提取、正反相硅膠柱層析富 集、高壓液相色譜分離獲得，其分子式為C 16H1805,命名為米曲霉素 B，英文名為oryzaeins B， 其結(jié)構(gòu)式為：
[0006] 本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，是以百合科植物滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis)中得到的曲霉屬真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)為基礎(chǔ)，經(jīng)菌種 分離、菌種培養(yǎng)、規(guī)?；l(fā)酵、有機(jī)溶劑提取、正反相硅膠柱層析富集、高壓液相色譜分離步 驟獲得，具體為： A、 內(nèi)生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的分離:將75%乙醇消毒后的百合科重樓屬 滇重樓(Paris polyphylla var. yunnanensis)莖桿和/或葉片放入無(wú)菌的研缽中進(jìn)行研 磨，研磨后轉(zhuǎn)入無(wú)菌的塑料管內(nèi)，1000~3000 rpm離心2~lOmin，吸取1~100微升上清液，涂布 在BL平板上，倒置于培養(yǎng)箱中，25~30攝氏度黑暗培養(yǎng)2~10天，反復(fù)挑取單菌落培養(yǎng)并編號(hào) 保存菌種，直到獲得單一內(nèi)生真菌菌落，經(jīng)ITS測(cè)序（Genbank Accession number
oryzae)，其曲霉屬真菌米曲霉見(jiàn)附圖4; B、 內(nèi)生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)菌種培養(yǎng):A步驟分離得到的米曲霉菌種在 室溫下接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25~30°C培養(yǎng)7~10天，再接種在50~500毫升的三 角瓶中，每個(gè)三角瓶含10~100毫升馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，置于25~30攝氏度下震蕩培養(yǎng)5~10 天得到液體發(fā)酵種子； C、 米曲霉(Aspergi 1 lus oryzae)的規(guī)模化發(fā)酵:將B步驟培養(yǎng)得到的的液體發(fā)酵種子 進(jìn)行規(guī)?；l(fā)酵，規(guī)?；l(fā)酵是在100~1000個(gè)100~500ml的馮巴赫瓶中進(jìn)行，每個(gè)瓶含有10 ~200g大米和10~200ml蒸餾水，每個(gè)瓶中接種1.0~5.0ml步驟B培養(yǎng)得到的液體發(fā)酵種子，于 25~30°C培養(yǎng)15~45天得到米曲霉發(fā)酵物； D、 浸膏提取:將C步驟發(fā)酵得到的米曲霉發(fā)酵物用有機(jī)溶劑超聲提取2~5次，每次30~ 60min，合并提取液后過(guò)濾提取液，減壓濃縮，靜置，濾除沉淀物，濃縮得到浸膏a; E、 硅膠柱層析:將D步驟所得的浸膏a用浸膏a重量的1.5~3倍量的丙酮或者二氯甲烷溶 解，用浸膏a重量的1~1.5倍量的80~100目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析，裝柱硅膠為200~ 300目，用量為浸膏a重量的6~10倍量;用體積配比為20:1~0:1的混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收 集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)TLC或分析型HPLC監(jiān)測(cè)，合并相同的部分； F、 反相柱層析:將E步驟中以7:3配比的混合有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫得到的洗脫液上反相柱 層析，反相柱是用反相材料C-18裝柱；用體積濃度為20~80%的甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集 各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測(cè)，合并相同的部分。
[0007] G、高效液相色譜分離:將以體積濃度50~70%甲醇溶液洗脫得到的洗脫液經(jīng)高效液 相色譜分離純化，即得所述的異香豆素類化合物米曲霉素 B，英文名為oryzaeins B。
[0008] 本發(fā)明制備得到的異香豆素類化合物的結(jié)構(gòu)是用核磁共振結(jié)合其他波譜技術(shù)鑒 定確認(rèn)的，具體為： 化合物的紫外光譜（溶劑為甲醇）為Amax(log〇: 210 (3.78)，270 (3.57)，288 (3.32)，325 (3.36) nm。紅外光譜（溴化鉀壓片）為vmax 3430，3085，2957，2848，1724， 1654，1615，1568，1469，1350，1182，1128，1071 cm-'HRES 頂 S 顯示本發(fā)明化合物準(zhǔn) 分子離子峰m/z 313.1058 [Μ + Na]+ (calcd 313.1052 for Ci6Hi8〇5Na)。結(jié)合 13C 和1Η NMR譜（圖1和圖2,碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1)，推出分子式為C16H18〇5,不飽和度為8</H NMR譜 (圖2)中顯示了 1個(gè)甲氧基，1個(gè)1，2,3,4-四取代苯環(huán)信號(hào)，1個(gè)三取代烯氫信號(hào)，4個(gè)亞甲基 信號(hào)和1個(gè)甲基信號(hào)。在碳譜和DEPT(圖1)中觀測(cè)到了 16個(gè)碳原子信號(hào)，其中2個(gè)甲基(包括 了 1個(gè)甲氧基信號(hào)），4個(gè)亞甲基，3個(gè)芳香次甲基和7個(gè)季碳信號(hào)(包括了 2個(gè)羰基和2個(gè)含氧 季碳信號(hào)）。其中，2個(gè)羰基和4對(duì)雙鍵碳占用了 6個(gè)不飽和度，提示該分子是一個(gè)二環(huán)類化合 物。通過(guò)一維數(shù)據(jù)的仔細(xì)比對(duì)和分析，初步推測(cè)該化合物是一個(gè)含有一個(gè)甲氧基、一個(gè)2-羰 基-丙基和一個(gè)3-羥基-丙基片段的異香豆素類化合物。這些推測(cè)通過(guò)二維核磁共振圖譜得 到確定（圖3)。
[0009] 表1米曲霉素 B的1Η和13C NMR數(shù)據(jù)(溶劑為CDC13)
首先，通過(guò)H-4與C-l，C-3，C-4a，C-5和C-8a的相關(guān)、H-6與C-4a，C-5，C-7和C-8的相關(guān)、 以及H-7與C-5，C-6，C-8和C-8a的相關(guān)確定了化合物的基本骨架為異香豆素。其次，兩個(gè)特 殊的取代基(一個(gè)2-羰基-丙基和一個(gè)3-羥基-丙基）分別通過(guò)H 3-ll與C-9和C-10相關(guān)以及 H2-3 '與C-1 '相關(guān)而確定。最后，通過(guò)H2-9與C_1，C_3和C-4相關(guān)、H3-I '與C_4a和C-6相關(guān)以及 8-0Me與C-8相關(guān)，確定了三個(gè)取代基(一個(gè)羥基、一個(gè)2-羰基-丙基和一個(gè)3-羥基-丙基）的 連接位置分別為C-3，C-5和C-8。因此，該異香豆素類化合物結(jié)構(gòu)得以確定，系統(tǒng)名為8-甲氧 基 _3_( 2-幾基丙基)_5_( 3-羥基丙基)香?素，并命名為米曲霉素 B。其結(jié)構(gòu)式為：
[0010] 本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的異香豆素類化合物在制備抗輪狀病毒藥 物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)YNCA1292,已在中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9716。
[0012]本發(fā)明化合物是首次被分離出來(lái)的，通過(guò)上述核磁共振和質(zhì)譜測(cè)定方法確定了為 苯丙素類化合物，并表征了其具體結(jié)構(gòu)。經(jīng)抗輪狀病毒的實(shí)驗(yàn)，其TC50值為215.2 yg/mU IC50值為8.47 yg/rnL，治療指數(shù)ΤΙ為25.41;其治療指數(shù)超過(guò)對(duì)照病毒唑的治療指數(shù)18.90; 化合物具有很好的抗輪狀病毒活性。以上結(jié)果揭示了本發(fā)明的化合物在制備抗輪狀病毒藥 物中有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單活性較好，可作為抗輪狀病毒藥物研發(fā)的 先導(dǎo)性化合物用于抗輪狀病毒藥物制劑研發(fā)。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為本發(fā)明化合物米曲霉素 Β的核磁共振碳譜(13C NMR); 圖2為本發(fā)明化合物米曲霉素 B的核磁共振氫譜(4 NMR); 圖3為本發(fā)明化合物米曲霉素 B的關(guān)鍵HMBC相關(guān)； 圖4為曲霉屬真囷米曲霉曲霉屬真囷米曲霉不意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]本發(fā)明所述的異香豆素類化合物，是以百合科植物滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis)中得到的曲霉屬真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)為基礎(chǔ)，經(jīng)菌種 分離、菌種培養(yǎng)、規(guī)?；l(fā)酵、有機(jī)溶劑提取、正反相硅膠柱層析富集、高壓液相色譜分離、 波譜分析獲得，其分子式為C 16H1805，命名為米曲霉素 B，英文名為oryzaeins B，其結(jié)構(gòu)式為：
[0016]本發(fā)明所述的異香豆素類化合物的制備方法，是以百合科植物滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis)中得到的曲霉屬真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)為 基礎(chǔ)，經(jīng)菌種分離、菌種培養(yǎng)、規(guī)?；l(fā)酵、有機(jī)溶劑提取、正反相硅膠柱層析富集、高壓液 相色譜分離步驟獲得，具體為： A、內(nèi)生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的分離:將75%乙醇消毒后的百合科重樓屬 滇重樓(Paris polyphylla var. yunnanensis)莖桿和/或葉片放入無(wú)菌的研缽中進(jìn)行研 磨，研磨后轉(zhuǎn)入無(wú)菌的塑料管內(nèi)，1000~3000 rpm離心