高純度他克莫司化合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物純化技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種高純度他克莫司化合物及其制備方法。本發(fā)明將預(yù)處理過的他克莫司粗品經(jīng)過含銀離子聚合物樹脂柱層析洗脫，洗脫液濃縮后進(jìn)行重結(jié)晶，獲得高純度他克莫司。本發(fā)明提供的方法規(guī)?；a(chǎn)操作簡單，溶媒耗用量少，生產(chǎn)周期短，成本低，友好環(huán)境，經(jīng)HPLC檢測，他克莫司粗品中最難分離的子囊霉素和二氫他克莫司完全去除。他克莫司歸一化純度為99％以上，并且所獲他克莫司晶體的粒度分布均勻、晶體內(nèi)應(yīng)力和堆密度小，其穩(wěn)定性、流動(dòng)性、分散性和溶解性均較好。提高了他克莫司的質(zhì)量及用藥安全。
【專利說明】
高純度他克莫司化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高純度他克莫司化合物及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 他克莫司是一種新型強(qiáng)效的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，1991年日本開發(fā)的名為普樂 可復(fù)(Prograf)他克莫司膠囊劑和注射劑正式上市，用于原發(fā)性肝移植和腎移植的排斥反 應(yīng)治療，后又被批準(zhǔn)用于骨髓移植。目前他克莫司制劑已在中國、日本、美國等80多個(gè)國家 上市，廣泛應(yīng)用于肝臟、胰腺、腎臟、心臟和肺等實(shí)體器官移植后的抗排異治療。1999年他克 莫司軟膏投放日本市場，用于治療成人的特應(yīng)性皮炎。
[0003] 他克莫司是從鏈霉菌屬（streptomyces tsukubaensis)中分離出的發(fā)酵產(chǎn)物，由 于他克莫司結(jié)構(gòu)復(fù)雜，手性基團(tuán)比較多，而且其發(fā)酵液中有很多異構(gòu)體和類似物，如二氫他 克莫司、子囊霉素等，其中子囊霉素比他克莫司只少1個(gè)亞甲基，二氫他克莫司比他克莫司 多2個(gè)氫原子，因此子囊霉素、二氫他克莫司和他克莫司結(jié)構(gòu)極為相似，在溶劑中的溶解性 和對(duì)溶劑的親和力相近，這些物質(zhì)的存在使得他克莫司采用常規(guī)的分離純化方法無法完全 分離而達(dá)到相應(yīng)的純度，從而難以滿足市場需要。
[0004] 中國發(fā)明專利CN85109492，公開了一種通過大孔吸附樹脂HP20，硅膠，活性炭來制 備FK506粗品的方法:a.浸提:用有機(jī)溶劑來浸泡發(fā)酵液過濾得到的菌絲體，過濾得浸提液， b. 吸附和解吸:浸提液中投入樹脂HP20吸附，有機(jī)溶劑和水的混合溶劑洗脫，收集液濃縮， c. 萃取:濃縮液中加入乙酯等疏水性溶劑萃取，萃取液濃縮，d.硅膠層析:萃取濃縮液通過 硅膠柱，用乙酯正己烷混合液洗脫，收集洗脫液濃縮得粗品。
[0005] 美國發(fā)明專利US2012065393(A1)，公開了一種制備FK506粗品的方法:a.浸提：用 醇，酮，酯類有機(jī)溶劑來浸泡發(fā)酵液過濾得到的菌絲體，過濾得浸提液，b.反萃取:浸提液中 加入鹵代烷類來反萃，萃取液濃縮，c.柱層析:萃取濃縮液稀釋后過硅膠柱或氧化鋁柱除掉 色素和油脂，d.結(jié)晶：收集洗脫液濃縮至一定體積加入去離子水，攪拌降溫結(jié)晶，e.過濾的 濕晶，用烷烴洗滌，烘干得粗品，粗品純度在92-95%之間，收率在70-75%之間。
[0006] 中國發(fā)明專利CN200580043951.6，公開了一種提純大環(huán)內(nèi)酯的方法，其中大環(huán)內(nèi) 酯負(fù)載置與濕吸附樹脂床相鄰放置，負(fù)載和床在大于30°C用有機(jī)溶劑洗脫液洗脫，有機(jī)溶 劑選自THF、乙腈、正丙醇、異丙醇、乙醇和丙酮，收集洗脫液的中間級(jí)分，收集提純的大環(huán)內(nèi) 酯，結(jié)晶采用乙酸乙酯，環(huán)己烷和水的三相系統(tǒng)。
[0007] 中國發(fā)明專利CN200910146378.1，公開了以他克莫司粗品作為原料，經(jīng)過有機(jī)溶 劑溶解，用C18反相制備液相色譜法實(shí)現(xiàn)他克莫司和子囊霉素、二氫他克莫司的分離純化。
[0008] 中國發(fā)明專利CN201210353577,公開了一種他克莫司粗品的純化方法，將他克莫 司粗品經(jīng)第一有機(jī)溶劑溶解并超聲振蕩后，采用快速濾紙抽濾，之后把抽濾所得的濾液即 樣品溶液通過制備型高速逆流色譜儀進(jìn)行連續(xù)純化。
[0009] 中國發(fā)明專利CN201310534184,公開了一種制備高純度他克莫司的工藝，利用四 氫呋喃溶解，加純水，過濾;接著利用C18反相色譜柱純化，純度可達(dá)99.5%以上，單個(gè)雜質(zhì) 含量不大于0.3%，總雜質(zhì)含量不大于0.5%，收率可達(dá)50-80%。
[0010]以上純化方法均采用正相或反相柱層析的方法來獲得粗品，需用特殊的設(shè)備、消 耗大量的有機(jī)溶劑，產(chǎn)生大量的廢水，廢液、廢棄填料如硅膠等，其中洗脫溶劑如乙腈、異丙 醇、正己烷，鹵代烷對(duì)人體毒性大，工藝耗時(shí)長且操作復(fù)雜不安全；
[0011]中國發(fā)明專利CN200480008682.5，公開了一種大環(huán)內(nèi)酯物質(zhì)的結(jié)晶與純化方法， 用極性溶劑如乙酸異丁酯、乙酸乙酯萃取，所得萃取液加入水或甲醇-水-正己烷體系洗滌、 濃縮后獲得油狀物濃縮物，然后與極性溶劑、烴溶劑及其含堿的水溶液混合，重結(jié)晶，獲得 大環(huán)內(nèi)脂如他克莫司的粗品，但是獲得粗品的純度低，最高純度為85.03%;該方法雖然沒 有用到柱層析純化，但需要進(jìn)一步純化才能達(dá)到藥品標(biāo)準(zhǔn)的要求。
[0012] 中國發(fā)明專利CN200580037031.3，公開了一種藤霉素的純化方法，包括4個(gè)步驟： 1)發(fā)酵液萃取-吸附樹脂純化;2)硅膠純化;3)藤霉素-銀-π-絡(luò)合物的溶解和純化;4)乙腈/ 水重結(jié)晶，獲得純度大于99 %的成品。但是該方法步驟2)中用到大量有機(jī)溶劑作為洗脫劑； 步驟3)用到C18反相硅膠純化，成本高;步驟4)用到乙腈重結(jié)晶，毒性大；因此該工藝不利于 工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0013] 中國發(fā)明專利CN200910146385,公開了一種將鏈霉菌發(fā)酵液用板框壓濾得到菌 體，用有機(jī)溶劑多次室溫浸提菌體，得到浸提液，將浸提液濃縮后進(jìn)行大孔樹脂和硅膠柱層 析，柱層析所得他克莫司用混合溶劑進(jìn)行濃縮，采用乙酸乙酯/正己烷或乙酸乙酯/環(huán)己烷 重結(jié)晶，他克莫司的純度最高為95.8%，純度低。
[0014] 中國發(fā)明專利CN2005800439516公開了一種提純他克莫司工藝方法，經(jīng)過3個(gè)層析 柱柱層析、萃取，采用乙酸乙酯、環(huán)己烷和水體系重結(jié)晶，但是該方法重結(jié)晶時(shí)間長，在12小 時(shí)以上，所得晶體40 °C減壓干燥12h，然后25 °C干燥24h，干燥時(shí)間長，此方法重復(fù)結(jié)晶2-4 次，操作復(fù)雜，收率低，最終獲得的產(chǎn)品重量含量為99.84%。
[0015] 因此，提供一種能降低雜質(zhì)及生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品質(zhì)量的更有效的純化方法十分 必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的就是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中純化分離他克莫司發(fā)酵液雜質(zhì)多，分離難 度大，現(xiàn)有純化方法復(fù)雜、耗時(shí)長、純度和收率低的不足，提供了一種高純度他克莫司化合 物及其制備方法，解決了現(xiàn)有純化方法中子囊霉素和二氫他克莫司分離難度大、收率低、耗 時(shí)長、洗脫溶劑用量大、污染高、不利于工業(yè)化大生產(chǎn)的問題。
[0017] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決：
[0018] 本發(fā)明目的之一是提供一種高純度他克莫司，該他克莫司中子囊霉素和二氫他克 莫司含量為〇.〇%、其它單個(gè)雜質(zhì)分別小于0.05%。
[0019]該高純度他克莫司歸一化純度為99%以上，并且該高純度的他克莫司晶體的粒度 分布均勻、晶體內(nèi)應(yīng)力和堆密度小，其穩(wěn)定性、流動(dòng)性、分散性和溶解性均較好，提高了他克 莫司的質(zhì)量及用藥安全。
[0020] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種高純度他克莫司的制備方法，包括如下步驟：
[0021] 1)將含有子囊霉素和二氫他克莫司雜質(zhì)的他克莫司粗品吸附到含銀離子聚合物 樹脂上；
[0022] 2)用中等極性的混合溶媒洗脫，收集含有他克莫司的流份，濃縮后獲得他克莫司 濃縮物；
[0023] 3)用中等極性溶媒溶解他克莫司濃縮物，攪拌條件下溶解完全后加入水，開始析 晶，線性降溫，析晶完全后過濾、干燥，即獲得高純度他克莫司。
[0024] 1)中所述含銀離子聚合物樹脂上是指在市場上購買的常規(guī)含銀離子聚合物樹脂。 [0025]作為優(yōu)選，步驟2)中所述中等極性的混合溶媒為甲醇/乙酸乙酯、乙醇/乙酸乙酯、 丙酮/乙酸乙酯中的任一種混合，所述混合溶媒的體積比為35~65:65~35,更優(yōu)選乙醇/乙 酸乙酯體積比為45:55。
[0026]步驟2)中優(yōu)選了甲醇/乙酸乙酯、乙醇/乙酸乙酯、丙酮/乙酸乙酯中的任一種混 合，毒性小，混合溶媒極性大小剛好將他克莫司與子囊霉素和二氫他克莫司雜質(zhì)充分分開 而交叉的混合液少，減少他克莫司的損失，有利于提高產(chǎn)率。
[0027] 進(jìn)一步的，步驟2)中所述中等極性的混合溶媒洗脫流速為0.6~1 .OBV/h。
[0028]現(xiàn)有技術(shù)中在分離子囊霉素和二氫他克莫司時(shí)，多采用反相色譜柱層析，或是采 用含有銀離子的水溶液與他克莫司粗品先結(jié)合，或者含有銀離子的水溶液與離子交換樹脂 交換，都是在含水的體系中純化，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，他克莫司在含水的溶液 中不穩(wěn)定，容易向異構(gòu)體轉(zhuǎn)化。而本發(fā)明在柱層析整個(gè)純化過程中，均沒有用到含水體系的 溶媒，利于他克莫司的穩(wěn)定性。
[0029]作為優(yōu)選，步驟3)中所述中等極性溶媒是甲醇、乙醇、丙酮中的任一種，優(yōu)選乙醇； 步驟3)中所述他克莫司濃縮物與中等極性溶媒重量體積比為150~160: lmg/ml。
[0030]作為優(yōu)選，步驟3)中所述加入水的方式是流加分批加入，第一批加入水與中等極 性溶媒的體積比為0.7~0.9:1;接著加入晶種，所述晶種占他克莫司粗品重量的2~3%;攪 拌0.5~1.5h，優(yōu)選1. Oh，第二批加入水與中等極性溶媒的體積比為0.3~0.5:1。
[0031] 進(jìn)一步的，所述流加水勻速加入時(shí)間控制在0.5~1.5h，優(yōu)選1 .Oh。
[0032] 作為優(yōu)選，步驟3)中所述開始析晶溫度為30~35°C;所述線性降溫至5~10°C，優(yōu) 選 8。。。
[0033] 作為優(yōu)選，步驟3)中所述線性降溫速率為3~7 °C /h，優(yōu)選6 °C /h。
[0034] 作為優(yōu)選，步驟3)中所述攪拌速度為70~130rpm;所述干燥溫度為40~50°C，干燥 4 ~5h〇
[0035] 本發(fā)明步驟3)提供的重結(jié)晶方法制備的他克莫司晶形顆粒大而分布均勻，晶體內(nèi) 應(yīng)力和堆密度小，其穩(wěn)定性、流動(dòng)性、分散性和溶解性均較好。晶形的光澤度好，空間大，夾 渣的溶劑少，干燥時(shí)間短，由原來干燥2天，縮短到4~5小時(shí)，節(jié)約能源，避免在長時(shí)間干燥 過程中他克莫司水合物晶型轉(zhuǎn)化為他克莫司無水物晶型的情況發(fā)生。
[0036] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，帶來的意料不到的技術(shù)效果如下：
[0037] 1、產(chǎn)品純度高:與他克莫司最接近的兩個(gè)雜質(zhì)子囊霉素和二氫他克莫司可以全部 去除，達(dá)到99%的純度，提高了他克莫司的藥品質(zhì)量，從而用藥安全性能更高。
[0038] 2、工藝簡單且收率高:可以輕松的除去與他克莫司結(jié)構(gòu)最接近的兩個(gè)雜質(zhì)子囊霉 素和二氫他克莫司，并且工藝操作簡單，溶媒耗用量少，生產(chǎn)周期短，成本低，同時(shí)可以達(dá)到 91 %以上的收率。因此本工藝更適宜于工業(yè)化大生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0039]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中含銀離子聚合物樹脂除雜前的HPLC譜圖。
[0040]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中含銀離子聚合物樹脂除雜后的HPLC譜圖。
[0041 ]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1 一次性加完1.2BV水的結(jié)晶晶體掃描圖。
[0042]圖4是本發(fā)明實(shí)施例2分二次加水，第一次加水0.8BV，第二次加水0.4BV水的結(jié)晶 晶體掃描圖。
[0043] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例2重結(jié)晶后獲得他克莫司純品的粒度分布圖。
[0044] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例2重結(jié)晶后獲得他克莫司純品的HPLC譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是， 所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā) 明。
[0046] 本發(fā)明用到的儀器如下：
[0047] 采用日本日立S-4800型掃描電子顯微鏡對(duì)晶型進(jìn)行SEM分析，操作電壓為15.0kV， 電流ΙΟμΑ，工作距離10.3mm。樣品在進(jìn)行觀察之前在真空下進(jìn)行表面噴金處理，真空度 10Pa，噴金時(shí)間60s。
[0048] 粒度儀(PSD分析)所使用的儀器設(shè)備型號(hào)為Microtrac S3500激光粒度儀器。檢測 方法參數(shù)：調(diào)零時(shí)間：30S;檢測時(shí)間：30S;分散劑為水；分散劑流速：55 %，樣品折射率： 1.58，分散劑折射率:1.33，積分方式:體積，激光源波長:780nm。
[0049] 高效液相色譜(HPLC)譜圖數(shù)據(jù)采自于高效液相色譜儀:Agilent 1260;
[0050] 色譜柱:C8柱(4.6X150mm，5ym);
[00511 流動(dòng)相：
[0052] 溶液A: 0 · 02mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)pH至3 · 5。
[0053] 溶液B:乙腈；
[0054] 紫外檢測波長：210nm;
[0055] 柱溫:60 °C;
[0056] 流速：1 .Oml/min;進(jìn)樣量：20ul。
[0057] 在市場上購買的含銀離子聚合物樹脂均適用于本發(fā)明的步驟1)和2)，本發(fā)明的具 體實(shí)施例采用含銀離子聚合物樹脂的孔徑為15~25nm，孔的容積為1.20~1.35cm 3/g，比表 面積 260 ~480m2/g。
[0058] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0059] 實(shí)施例1
[0060] 1)取含銀離子聚合物樹脂280ml，在裝柱前，需先將樹脂置于玻璃燒杯中，加入丙 酮，浸潤及超過樹脂表層2cm左右，浸泡3小時(shí)后，過濾浸泡樹脂，在層析柱內(nèi)加入1/3體積的 丙酮，再加入浸泡過的樹脂，樹脂裝料完畢，徑高比約1:7.8;用甲醇再生樹脂，控制流速 1 BV/h，再生丙酮用量為柱體積的5BV，再用甲醇與乙酸乙酯體積比為49 : 51的混合溶媒平 衡，混合溶媒用量為柱體積的2BV。
[0061] 2)上柱液配制及上樣：按層析樹脂裝量體積計(jì)算上柱總億（每毫升層析樹脂上 9mg)，稱取他克莫司粗品2.8g，該粗品包含了 1.56 %子囊霉素，4.11 %的二氫他克莫司，重 量含量為90%，見圖1，其中2.52g為活性成分。溶于甲醇與乙酸乙酯體積比為51:49的混合 溶媒溶解中，配成200mg/ml的上柱液。上柱前，先將層析上端溶媒移出至柱中樹脂表面上端 溶媒約1 cm，加入上述上柱液，打開柱下出口閥，控制流速0.5BV/h，上柱液吸附完畢。
[0062] 3)洗脫：用甲醇與乙酸乙酯體積比為51:49的混合溶媒洗脫，控制流速1. OBV/h，收 集他克莫司洗脫液流份，洗脫溶劑用量4BV，經(jīng)HPLC檢測，將子囊霉素和二氫他克莫司歸一 化含量均為〇 . 〇 %的洗脫液流份合并，合并液體積410ml，取樣檢測，見圖2，效價(jià):4924ug/ ml，層析收率達(dá)80.1%。
[0063] 4)濃縮:將含有他克莫司組分要求合格的流份在水浴溫度為60°C條件下減壓濃 縮，獲得其濃縮物。
[0064] 5)結(jié)晶：加甲醇溶解，配制成160mg/ml結(jié)晶溶液，置于35°C結(jié)晶恒溫低溫糟中，攪 拌，攪拌速度為80rpm，加入溶解液體積的1.2BV純水，加入2.0%晶種，攪拌lh后，以3°C/h速 率降溫，攪拌線性降溫至10°C，過濾，用15%的甲醇水溶液淋洗晶體，真空抽濾除去淋洗液， 晶體真空干燥，真空度-0. 〇9MPa，50°C干燥5小時(shí)，得1.83g成品，取成品經(jīng)HPLC檢測，歸一化 含量97.2%;重復(fù)結(jié)晶1次，得1.67g成品，該晶體掃描圖見圖3;取成品經(jīng)HPLC檢測，歸一化 含量99.2 % ;子囊霉素:0.00%和二氫他克莫司：0.00 %，總雜質(zhì)歸一化含量0.04%。重結(jié)晶 收率達(dá)91.3%。
[0065] 實(shí)施例2
[0066] 1)取含銀離子聚合物樹脂280ml(層析柱0 3.6cm)，用乙醇再生樹脂，控制流速 1 BV/h，再生溶媒用量為柱體積的2BV，再用乙醇與乙酸乙酯體積比為45 : 55的混合溶媒平 衡，混合溶媒用量為柱體積的2BV。
[0067] 2)上柱液配制及上樣：按層析樹脂裝量體積計(jì)算上柱總億（每毫升層析樹脂上 1 〇mg )，稱取他克莫司中間體粗品3.11 g，該粗品包含了 1.56 %子囊霉素，4.11 %的二氫他克 莫司，重量含量為90%，其中2.8g為活性成分，溶于乙醇與乙酸乙酯的體積比為45:55的混 合溶媒中，配成250mg/ml的上柱液。上柱前，先將層析上端溶媒移出至柱中樹脂表面上端溶 媒約l-2cm，加入上述上柱液，打開柱下出口閥，控制流速0.5BV/h，上柱液吸附完畢。
[0068] 3)洗脫：用乙醇：乙酸乙酯的體積比為45: 55的混合溶媒洗脫，控制流速0.8BV/h， 收集他克莫司洗脫液流份，洗脫溶劑用量4BV，經(jīng)HPLC檢測，將子囊霉素和二氫他克莫司歸 一化含量均為〇 . 〇 %的洗脫液流份合并，合并液體積420ml，取樣檢測，效價(jià):5488ug/ml，層 析收率達(dá)82.3%。
[0069] 4)濃縮:將含有他克莫司組分要求的流份在水浴溫度為60°C條件下減壓濃縮，獲 得其濃縮物。
[0070] 5)結(jié)晶：加乙醇溶解，配制成155mg/ml結(jié)晶溶液，置于32°C結(jié)晶恒溫低溫糟中，攪 拌，攪拌速度為l〇〇rpm，加入溶解液體積的0.8BV純水，加入2.0 %晶種，攪拌lh后，流加溶解 液體積的0.4BV純水，lh加完，以5°C/h速率降溫，攪拌線性降溫至8°C，過濾，用15%的甲醇 水溶液淋洗晶體，真空抽濾除去淋洗液，晶體真空干燥，真空度-〇. 〇9MPa，43°C干燥4.5小 時(shí)，得2.15g成品，取成品經(jīng)HPLC檢測，歸一化含量99.8% ;該晶體掃描圖見圖4、該晶體的粒 度分布圖見圖5 ;見圖6 ;子囊霉素：0.00 %和二氫他克莫司：0.00%，總雜質(zhì)歸一化含量 0.00%。結(jié)晶收率達(dá)91.6%。
[0071] 實(shí)施例3
[0072] 1)取含銀離子聚合物樹脂120L，在裝柱(層析柱0 30cm)前，需先將樹脂置于不銹 鋼桶中，加入乙醇，要求浸潤及超過樹脂表層2cm，浸泡4小時(shí)后，過濾浸泡樹脂，在層析柱內(nèi) 加入1/3中等極性的溶媒，再加入浸泡過的樹脂，樹脂裝料完畢，徑高比約1:5.7;用乙醇再 生樹脂，控制流速1 BV/h，再生溶媒用量為柱體積的5BV，再用乙醇：乙酸乙酯的體積比為45: 55的混合溶媒平衡，混合溶媒用量為柱體積的5BV。
[0073] 2)上柱液配制及上樣：按層析樹脂裝量體積計(jì)算上柱總億（每毫升層析樹脂上 9mg )，稱取他克莫司中間體粗品1220g，該粗品包含了 1.15 %子囊霉素，3.61 %的二氫他克 莫司，重量含量為88.5%，其中1080g為活性成分，用乙醇：乙酸乙酯的體積比為45:55的混 合溶媒溶解中間體粗品，配成230mg/ml的上柱液。上柱前，先將層析上端溶媒移出至柱中樹 脂表面上端溶媒約l-2cm，加入上述上柱液，打開柱下出口閥，控制流速0.5BV/h上柱液吸附 完畢。
[0074] 3)洗脫：用乙醇：乙酸乙酯的體積比為45: 55的混合溶媒洗脫，控制流速0.7BV/h， 打開檢測器，波長:245nm，收集洗脫流份，約每20L收集一桶，至有他克莫司單位的流份，取 樣，HPLC檢測，到洗脫流份他克莫司單位<800ug/ml，結(jié)束洗脫，洗脫溶劑用量4BV，將子囊霉 素和二氫他克莫司歸一化含量均為0.0 %的洗脫液流份合并，合并液體積162L，取樣檢測， 效價(jià):5392ug/ml，層析收率達(dá)80.9 %。
[0075] 4)濃縮:將含有他克莫司組分要求的流份在水浴溫度為60條件下減壓濃縮，獲得 其濃縮物。
[0076] 5)結(jié)晶：加乙醇溶解，配制成155mg/ml結(jié)晶溶液，置于33°C結(jié)晶恒溫低溫糟中，攪 拌，攪拌速度為1 l〇rpm，加入溶解液體積的0.8BV純水，加入2.5 %晶種，攪拌lh后，流加溶解 液體積的0.4BV純水，1.5h加完，以6°C/h速率降溫，攪拌線性降溫至8°C，過濾，用15%的甲 醇水溶液淋洗晶體，真空抽濾除去淋洗液，晶體真空干燥，真空度-〇 . 〇9MPa，45°C干燥5小 時(shí)，得822g成品，取成品經(jīng)HPLC檢測，歸一化含量99.8 % ;子囊霉素：0.00 %和二氫他克莫 司：0.00 %，總雜質(zhì)歸一化含量0.00 %。結(jié)晶收率達(dá)91.8 %。
[0077] 實(shí)施例4
[0078] 1)取本實(shí)施例3已使用過的含銀離子聚合物樹脂280ml (層析柱0 3.6cm)，用甲醇 再生樹脂，控制流速lBV/h，再生溶媒用量為柱體積的2BV，再用甲醇與乙酸乙酯體積比為 35:65的混合溶媒平衡，混合溶媒用量為柱體積的5BV。
[0079] 2)上柱液配制及上樣：按層析樹脂裝量體積計(jì)算上柱總億（每毫升層析樹脂上 12mg)，稱取他克莫司中間體粗品3.95g，該粗品包含了 1.56%子囊霉素，4.11 %的二氫他克 莫司重量含量為85.1%，其中3.36g為活性成分，溶于丙酮與乙酸乙酯的體積比為35:65的 混合溶媒中，配成250mg/ml的上柱液。上柱前，先將層析上端溶媒移出至柱中樹脂表面上端 溶媒約1.5cm，加入上述上柱液，打開柱下出口閥，控制流速0.5BV/h，上柱液吸附完畢。
[0080] 3)洗脫：用丙酮：乙酸乙酯的體積比為35:65的混合溶媒洗脫，控制流速0.7BV/h， 收集洗脫流份，經(jīng)HPLC檢測，合并子囊霉素和二氫他克莫司歸一化含量均為0.0 %的洗脫液 流份，合并液體積470ml，取樣檢測，效價(jià):5756ug/ml，層析收率達(dá)80.5 %。
[0081] 4)濃縮:將含有他克莫司組分要求的流份在水浴溫度為60°C條件下減壓濃縮，獲 得其濃縮物。
[0082] 5)結(jié)晶：加丙酮溶解，配制成150mg/ml結(jié)晶溶液，置于30°C結(jié)晶恒溫低溫糟中，攪 拌，攪拌速度為130rpm，加入溶解液體積的0.9BV純水，加入3 %晶種，攪拌lh后，流加溶解液 體積的0.3BV純水，0.5h加完，以7°C/h速率降溫，攪拌線性降溫至5°C，過濾，用15%的甲醇 水溶液淋洗晶體，真空抽濾除去淋洗液，晶體干燥，真空度-〇. 〇9MPa，溫度40°C，干燥4小時(shí)， 得2.56g成品，取成品經(jīng)HPLC檢測，歸一化含量99.5 % ;子囊霉素:0.00 %和二氫他克莫司： 0.00 %，總雜質(zhì)歸一化含量0.05 %。結(jié)晶收率達(dá)91.6 %。
[0083] 對(duì)比實(shí)施例5
[0084]不同層析方式純化他克莫司粗品
[0085] 具體結(jié)果如下表：
[0086]
[0087]從上表知，現(xiàn)有技術(shù)中分離子囊霉素和二氫他克莫司時(shí)，均在含水體系中進(jìn)行，而 且在保證高收率的情況下，子囊霉素和二氫他克莫司這兩個(gè)雜質(zhì)很難完全分開。然而本發(fā) 明提供的分離方法，采用無水體系溶劑洗脫分離，避免他克莫司向異構(gòu)體轉(zhuǎn)化，使柱層析收 率高達(dá)80%以上，并且，層析周期短，溶劑用量少。本發(fā)明所用的柱層析為常壓層析柱，對(duì)設(shè) 備要求低。
[0088] 對(duì)比實(shí)施例6
[0089]不同結(jié)晶方法，獲得的晶體物理特性具體結(jié)果如下表：
[0090]
[0091] 由上表知，本發(fā)明采用甲醇、乙醇或丙酮溶解他克莫司粗品后，分批流加純化水， 加晶種，線性降溫，降溫速率優(yōu)選6°C/h，結(jié)晶晶體粒度大，分布均勻，堆密度小，流動(dòng)性好， 干燥時(shí)間短，產(chǎn)品含量高。
[0092] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高純度他克莫司，其特征在于，該他克莫司中子囊霉素和二氫他克莫司含量為 0.0%、其它單個(gè)雜質(zhì)分別小于0.05%。2. 如權(quán)利要求1所述高純度他克莫司的制備方法，包括如下步驟： 1) 將含有子囊霉素和二氫他克莫司雜質(zhì)的他克莫司粗品吸附到含銀離子聚合物樹脂 上； 2) 用中等極性的混合溶媒洗脫，收集含有他克莫司的流份，濃縮后獲得他克莫司濃縮 物； 3) 用中等極性溶媒溶解他克莫司濃縮物，攪拌條件下溶解完全后加入水，開始析晶，線 性降溫，析晶完全后過濾、干燥，即獲得高純度他克莫司。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述中等極性的混合溶媒為甲醇/ 乙酸乙酯、乙醇/乙酸乙酯、丙酮/乙酸乙中的任一種混合，所述混合溶媒的體積比為35~ 65:65~35，優(yōu)選乙醇/乙酸乙酯體積比為45:55。4. 如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述中等極性的混合溶媒洗脫 流速為0.6~1.0BV/h。5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述中等極性溶媒是甲醇、乙醇、丙 酮中的任一種，優(yōu)選乙醇;步驟3)中所述他克莫司濃縮物與中等極性溶媒重量體積比為150 ~160:lmg/ml〇6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述加入水的方式是流加分批加 入，第一批加入水與中等極性溶媒的體積比為0.7~0.9:1;接著加入晶種，所述晶種占他克 莫司粗品重量的2~3% ;攪拌0.5~1.5h，優(yōu)選1. Oh，第二批加入水與中等極性溶媒的體積 比為0.3~0.5:1。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述流加水勻速加入時(shí)間控制在0.5~1.5h， 優(yōu)選1 .Oh。8. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述開始析晶溫度為30~35°C;所 述線性降溫至5~10°C，優(yōu)選8°C。9. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述線性降溫速率為3~7°C/h，優(yōu) 選 5°C/h。10. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述攪拌速度為70~130rpm;所述 干燥溫度為40~50°C，干燥4~5h。
【文檔編號(hào)】C07D498/18GK106083892SQ201610410561
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日 公開號(hào)201610410561.8, CN 106083892 A, CN 106083892A, CN 201610410561, CN-A-106083892, CN106083892 A, CN106083892A, CN201610410561, CN201610410561.8
【發(fā)明人】諸敏, 吳萍, 吳文藝, 紀(jì)立君, 高慶峰
【申請(qǐng)人】杭州中美華東制藥有限公司