結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本專(zhuān)利申請(qǐng)要求于2013年8月6日提交PCT專(zhuān)利申請(qǐng)（申請(qǐng)?zhí)朠CT/CN2013/080872) 的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)引用并入此處。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于預(yù)測(cè)與微生物群有關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物及方法。特別地， 本發(fā)明涉及用于預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌(CRC)的風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物和方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 在西方國(guó)家，結(jié)直腸癌（CRC)是第二大常見(jiàn)癌癥，也是第二大致死的癌癥 (Schetter AJ1Harris CRC(2011)Alterations of microRNAs contribute to colon carcinogenesis.Semin Oncol 38:734-742,通過(guò)引用并入此處）。在全世界范圍內(nèi)，每年都 有很多人被診斷出患有CRC，也有很多患者死于此病。盡管現(xiàn)有的治療手段(包括手術(shù)、放射 療法、化學(xué)療法)對(duì)CRC具有顯著的臨床治療價(jià)值，然而，手術(shù)后癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移使得這些 治療手段不能成功治愈結(jié)直腸癌。因此，對(duì)CRC早期的診斷不僅可以降低死亡率，還可以減 少手術(shù)治療的費(fèi)用。
[0005] 現(xiàn)在診斷CRC的手段，如可屈性乙狀結(jié)腸鏡檢查和結(jié)腸鏡檢查是侵入式檢查，被檢 查的患者在受檢過(guò)程中可能會(huì)感覺(jué)不舒服甚至厭惡。
[0006] CRC的發(fā)展是受遺傳、生理和環(huán)境因素影響的多因素過(guò)程。對(duì)于環(huán)境因素，生活方 式特別是飲食攝入可能會(huì)影響到CRC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。西方飲食含有豐富的動(dòng)物脂肪但是缺乏 纖維，其通常與CRC的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。因此，據(jù)推測(cè)飲食和CRC之間的關(guān)聯(lián)可能是飲食對(duì)結(jié)腸 微生物群和細(xì)菌代謝的影響，從而使得這兩者均是疾病病因?qū)W中的相關(guān)因素 (McGarr SE， Ridlon JM,Hylemon PB(2005).Diet,anaerobic bacterial metabolism,and colon cancer .J Clin Gastroenterol.39:98-109;Hatakka K,Holma R,El-Nezami H, Suomalainen T1Kuisma M1Saxelin M1Poussa T, MykkaiienHjKorpela R(2008) .The influence of Lactobacillus rhamnosus LC705together with Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii JS on potentially carcinogenic bacterial activity in human colon .Int J Food Microbiol .128:406-410，通過(guò)引用并入此處）。
[0007] 腸道微生物群和免疫系統(tǒng)之間的相互作用在腸道內(nèi)外的很多疾病中發(fā)揮重要作 用（Cho，I·&Blaser，M.J·The human microbiome:at the interface of health and disease .Nature Rev .Genet · 13,260-270(2012)，通過(guò)引用并入此處）。奠便DNA的腸道微生 物群分析具有作為非侵入式檢測(cè)方法的潛力，用來(lái)尋找特異性生物標(biāo)志物，而這些標(biāo)志物 可以作為CRC患者早期診斷的篩選工具，從而延長(zhǎng)壽命，提高生活質(zhì)量。
[0008] 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及其在微生物生態(tài)型和環(huán)境微生物學(xué)中的應(yīng)用，一種新出 現(xiàn)的宏基因組學(xué)(環(huán)境基因組學(xué)或生態(tài)基因組學(xué))領(lǐng)域已快速發(fā)展。宏觀基因組學(xué)包括提取 總的群落DNA、構(gòu)建基因組文庫(kù)以及利用與功能基因組學(xué)相似的策略分析文庫(kù)，其提供了強(qiáng) 力的工具來(lái)研究復(fù)雜生長(zhǎng)環(huán)境中的未培養(yǎng)微生物。在近些年，宏觀基因組學(xué)已應(yīng)用于許多 環(huán)境樣品，如海洋、土壤、河流、熱井、溫泉以及人胃腸道、鼻通道、口腔、皮膚和泌尿生殖道， 在許多領(lǐng)域包括醫(yī)學(xué)、替代能源、環(huán)境補(bǔ)救、生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)和生物防御中顯示顯著的價(jià)值。 為了研究CRC，本發(fā)明人在宏觀基因組學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行了分析。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施例旨在至少在某種程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少一個(gè)問(wèn) 題。
[0011] 本發(fā)明是基于本發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn)作出的：
[0012] 評(píng)估和表征腸道微生物群已經(jīng)成為研究人類(lèi)疾病(包括在所有癌癥類(lèi)型中最常見(jiàn) 的致死癌癥之一的結(jié)直腸癌(CRC))的一個(gè)主要領(lǐng)域。為了分析CRC患者的腸道微生物群，本 發(fā)明人基于對(duì)128個(gè)中國(guó)人的腸道微生物DNA的深度鳥(niǎo)槍法測(cè)序，執(zhí)行了宏基因組關(guān)聯(lián)研究 (MGffAS)(Qin,J.et al.A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2diabetes.Nature 490,55-60(2012)，通過(guò)引用并入此處）的方案。發(fā)明人鑒定并驗(yàn) 證了 140,455個(gè)與CRC關(guān)聯(lián)的基因標(biāo)志物。為了開(kāi)發(fā)利用腸道微生物群進(jìn)行CRC鑒別的潛在 能力，發(fā)明人基于通過(guò)最小冗余-最大關(guān)聯(lián)(mRMR)特征選擇方法定義為最優(yōu)基因集的31個(gè) 基因標(biāo)志物，開(kāi)發(fā)了疾病分類(lèi)系統(tǒng)。為了基于這些31個(gè)腸道微生物群基因標(biāo)志物直觀地評(píng) 估CRC疾病的風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)明人計(jì)算了健康指數(shù)。發(fā)明人的數(shù)據(jù)為表征與CRC風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的腸道宏 基因組提供了具有洞察力的見(jiàn)解，也為以后研究腸道宏基因組在其他相關(guān)疾病的病理生理 學(xué)中的作用提供了一個(gè)范例，同時(shí)還揭示了基于腸道微生物群的方法在評(píng)估處于這樣的疾 病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中的潛在用途。
[0013] 據(jù)信腸道微生物群的基因標(biāo)志物對(duì)于增加癌癥的早期檢測(cè)具有重要的價(jià)值，原因 如下:首先，本發(fā)明的標(biāo)志物相對(duì)于傳統(tǒng)癌癥標(biāo)志物更特異、更靈敏。其次，采用糞便進(jìn)行分 析的結(jié)果準(zhǔn)確、安全、便宜并且患者較易服從。糞便樣品是方便運(yùn)輸?shù)摹Ｅc需要腸道準(zhǔn)備的 結(jié)腸鏡檢查相比，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分析方法是無(wú)創(chuàng)的和舒適的，所以人們將更 容易參與指定的篩選程序。第三，本發(fā)明的標(biāo)志物還可作為治療監(jiān)測(cè)癌癥患者的工具，以檢 測(cè)對(duì)治療的反應(yīng)。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 下面結(jié)合【附圖說(shuō)明】，本發(fā)明公開(kāi)的各個(gè)方面及其優(yōu)勢(shì)將變得顯而易見(jiàn)，從而更容 易被理解。
[0015] 圖1示出了本研究中所有微生物基因的P值關(guān)聯(lián)統(tǒng)計(jì)量的分布。CRC P值分布的關(guān) 聯(lián)分析鑒定了在較低P值下強(qiáng)關(guān)聯(lián)標(biāo)志物不成比例地表達(dá)過(guò)度，其中在零假設(shè)下，大部分基 因符合預(yù)期的P值分布。這表明，顯著的標(biāo)志物可能代表真實(shí)而不是虛假的關(guān)聯(lián)。
[0016] 圖2示出了利用最小冗余-最大關(guān)聯(lián)(mRMR)方法鑒定出從對(duì)照區(qū)分結(jié)直腸癌病例 的31個(gè)基因標(biāo)志物。利用mRMR方法進(jìn)行遞增式查找，得到連續(xù)數(shù)目的子集。對(duì)于每個(gè)子集， 利用留一交叉驗(yàn)證法(L00CV)評(píng)估線性判別分類(lèi)器的錯(cuò)誤率。錯(cuò)誤率最低的最優(yōu)子集包含 31個(gè)基因標(biāo)志物。
[0017] 圖3示出了發(fā)現(xiàn)CRC關(guān)聯(lián)的腸道微生物基因標(biāo)志物。一起示出了對(duì)來(lái)自此研究的 CRC患者及對(duì)照個(gè)體計(jì)算的CRC指數(shù)，對(duì)來(lái)自先前對(duì)II型糖尿病、炎癥性腸病的研究的患者 和對(duì)照個(gè)體計(jì)算的CRC指數(shù)。盒子代表了第一四分位數(shù)和第三四分位數(shù)之間的四分位距，盒 子內(nèi)部的線代表中位數(shù)。表6列出的經(jīng)計(jì)算的腸道健康指數(shù)與群體中CRC患者的比率具有良 好的相關(guān)性。CRC患者微生物群組的CRC指數(shù)與其余受試者的顯著不同（***P〈0.001)。
[0018]圖4示出了對(duì)來(lái)自中國(guó)人第一群體的31個(gè)基因標(biāo)志物的CRC指數(shù)進(jìn)行ROC分析，曲 線下面積為0.9932,表明31個(gè)基因標(biāo)志物具有出色的鑒別潛力。
[0019]圖5示出了從實(shí)施例2中的另外的中國(guó)人群體(包括19個(gè)CRC患者和16個(gè)非CRC對(duì) 照)樣品中計(jì)算得到的CRC指數(shù)。盒子代表了第一四分位數(shù)和第三四分位數(shù)(分別為第25和 第75百分位數(shù))之間的四分位距（IQR)，盒子內(nèi)部的線代表中位數(shù)，點(diǎn)代表每個(gè)樣品的腸道 健康指數(shù)。正方形代表病例組(CRC)，三角形代表對(duì)照組(非CRC)，帶*的三角形代表被診斷 為CRC患者的非CRC個(gè)體。
[0020]圖6示出了在結(jié)直腸癌中與腸道微生態(tài)失調(diào)有關(guān)的物種。使用三種不同方法(MLG、 mOTU和頂G數(shù)據(jù)庫(kù))一致地鑒定兩種CRC關(guān)聯(lián)的微生物物種和一個(gè)對(duì)照關(guān)聯(lián)的微生物物種的 差別相對(duì)豐度。
[0021 ] 圖7示出了莫氏細(xì)小桿菌（Solobacterium moorei)和胃消化鏈球菌 (Peptostreptococcus stomatis)在CRC患者微生物群組中的富集情況。
[0022]圖8示出了利用隨機(jī)森林方法和三種不同物種注釋方法得到的CRC特異性物種標(biāo) 志物選擇的受試者工作特征曲線(ROC)13(A)利用MG 400版本對(duì)高質(zhì)量測(cè)序序列進(jìn)行注釋 得到的MG物種；（B)利用已發(fā)表的方法得到的mOTU物種；（C)利用MLG方法聚類(lèi)的所有顯著 基因和利用IMG 400版本注釋得到的物種。
[0023]圖9示出了利用三種物種注釋方法(MLGUMG和mOTU)得到的在疾病第二階段及以 后各階段富集的三種物種的階段特異性豐度。
[0024] 圖10示出了在結(jié)直腸癌中與腸道微生態(tài)失調(diào)有關(guān)的物種。在CRC的不同階段中，一 種在對(duì)照微生物群組中富集的細(xì)菌物種和三種在CRC關(guān)聯(lián)的微生物群組中富集的細(xì)菌物種 的相對(duì)豐度(利用三種不同的物種注釋方法）。
[0025] 圖11示出了利用宏基因組方法和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)方法對(duì)兩個(gè)基因標(biāo) 志物進(jìn)行的定量之間的相關(guān)性。
[0026] 圖12示出了利用2個(gè)基因評(píng)估中國(guó)人第二群體的CRC指數(shù)。(A)基于2個(gè)基因標(biāo)志物 的CRC指數(shù)鑒別CRC和對(duì)照微生物群組；（B)ROC分析結(jié)果顯示了利用CRC指數(shù)進(jìn)行鑒別的邊 際潛力，曲線下面積為0.73。
[0027] 圖13示出了對(duì)與CRC關(guān)聯(lián)強(qiáng)健的基因標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果。在第二群體（由51個(gè) 病例和113個(gè)健康對(duì)照組成）中測(cè)量三個(gè)基因標(biāo)志物的qPCR豐度(對(duì)數(shù)值取loglO,豐度為0 的以-8進(jìn)行作圖）。其中，兩個(gè)基因（ml704941:來(lái)自F.nucIeatum的丁酰輔酶A脫氫酶； m482585:來(lái)自未知微生物的RNA引導(dǎo)DNA聚合酶)是隨機(jī)選擇的，另外一個(gè)(ml696299:來(lái)自 P.micra的RNA聚合酶β亞基，rpoB)是定向選擇的。（A)基于這三個(gè)基因計(jì)算得到的CRC指數(shù) 可以清楚地鑒別CRC微生物群組和對(duì)照微生物群組；（B)對(duì)CRC指數(shù)利用0.84的受試者工作 特征(ROC)曲線下面積(AUC)進(jìn)行分類(lèi)；（C)相對(duì)于對(duì)照和第一階段微生物群組，P.micra物 種特異性基因 rpoB從CRC第二階段和第三階段開(kāi)始顯示相對(duì)較高的出現(xiàn)率和豐度（P = 2.15x10-15)。
[0028] 發(fā)明詳述
[0029] 本文所用的術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義。術(shù)語(yǔ)如 "一個(gè)"、"一種"和"所述"不旨在僅指單數(shù)的實(shí)體，而是包括可用于說(shuō)明特定實(shí)施例的一般 類(lèi)別。本文的術(shù)語(yǔ)用于描述本發(fā)明的具體實(shí)施例，但它們的使用并不限定本發(fā)明，除非在權(quán) 利要求中指出。
[0030] 本