一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 芽孢桿菌（Bacillusspp.)是內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，是目前生防細(xì)菌 中研究較多的一類，因其能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子，是理 想的生防菌篩選對象。研究表明，目前應(yīng)用于防治植物病害的芽孢桿菌屬細(xì)菌有枯 草芽孢桿菌（B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌 (B.licheniformis)等。植物根際土壤作為受植物活根影響的土壤微區(qū)，含有大量的微生 物，包括真菌、細(xì)菌、放線菌、藻類、原生動物等。在植物根際微生物中，細(xì)菌生長快，也最常 見，并且種類繁多，在土壤營養(yǎng)元素循環(huán)、有機(jī)物質(zhì)的形成和分解、肥力的保持和提高、生態(tài) 環(huán)境的改善、植物的生長發(fā)育等方面均起著極其重要的作用，被認(rèn)為是良好的有益微生物 資源庫。近些年來，利用土壤中的有益細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物防治植物病害更是成為國內(nèi)外研 究的熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一株枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)及其應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)采集自北京農(nóng)學(xué)院，命名為ZT4-2， 已于2014年10月30日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（地址：北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所），保藏編號為CGMCCNo. 9874。菌株ZT4-2的 菌落形態(tài)為圓形或近圓形，白色，平鋪，邊緣不整齊，表面褶皺較少。
[0005]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌具有針對植物病原真菌的抑菌活性。所述植物病原真菌為 立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、擬盤多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盤菌、葡萄座腔 菌、前病鐮孢菌、蕓薹鏈格孢菌。
[0006]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌可用于制備針對植物病原真菌的生防菌劑或微生物菌肥。
[0007] 其中，所述植物病原真菌為立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、擬盤多毛孢菌、美澳型核果 褐腐病菌、富克葡萄孢盤菌、葡萄座腔菌、茄病鐮孢菌、蕓薹鏈格孢菌。
[0008]本發(fā)明還提供了針對植物病原真菌的生防菌劑或微生物菌肥，其中所述生防菌劑 或微生物菌肥的活性成分為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌。
[0009] 其中，所述植物病原真菌為立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、擬盤多毛孢菌、美澳型核果 褐腐病菌、富克葡萄孢盤菌、葡萄座腔菌、茄病鐮孢菌、蕓薹鏈格孢菌。
[0010] 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌具有對植物病原真菌的抑菌活性并且具有較寬的抑菌譜。
【附圖說明】
[0011] 圖1顯示三株菌的菌落形態(tài)，
[0012] 其中，左：DJ1，中：TR2,右：ZT4-2。
[0013] 圖2顯示淀粉酶檢測結(jié)果，
[0014]其中，左上：ZT4-2,右上：TR2,左下：DJ1，右下：E.coliJM109。
[0015] 圖3顯示蛋白酶檢測結(jié)果，
[0016]其中，左上：ZT4-2,右上：TR2,左下：DJ1，右下：E.coliJM109。
[0017] 圖4顯示纖維素酶檢測結(jié)果，
[0018]其中，上：ZT4-2,中右：TR2,下：DJ1，中左：E.coliJM109。
[0019] 圖5顯示脂肪酶檢測結(jié)果，
[0020] 其中，左：DJ1，中：ZT4-2，右：TR2。
[0021] 圖6顯示葡萄糖發(fā)酵檢測結(jié)果，
[0022] 其中，由左至右依次為對照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0023] 圖7顯示蔗糖發(fā)酵檢測結(jié)果，
[0024] 其中，由左至右依次為對照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0025] 圖8顯示乳糖發(fā)酵檢測結(jié)果，
[0026] 其中，由左至右依次為對照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0027] 圖9顯示甘露醇發(fā)酵檢測結(jié)果，
[0028] 其中，由左至右依次為對照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0029] 圖10顯示肌醇發(fā)酵檢測結(jié)果，
[0030] 其中，由左至右依次為對照、TR2、ZT4-2和DJ1。
[0031] 圖11顯示革蘭氏染色結(jié)果
[0032]其中，由左至右依次為ZT4_2、TR2、DJ1 和E.coliJM109。
[0033] 圖12顯示芽孢染色結(jié)果
[0034] 其中，由左至右依次為ZT4-2、TR2和DJ1。
[0035] 圖13顯示16SrDNA的擴(kuò)增的電泳圖，
[0036]其中，Μ為分子量Marker，1.ZT4-2,2.TR2,3.DJ1。
[0037] 圖14顯示gyrA基因的擴(kuò)增的電泳圖，
[0038]其中，Μ為分子量Marker，1.ZT4-2 ;2·TR2 ;3·DJ1。
[0039] 圖15顯示鞭毛蛋白基因的擴(kuò)增的電泳圖，
[0040]Μ為分子量Marker，1.ZT4-2 ;2·TR2 ;3·DJ1。
【具體實施方式】
[0041] 實施例1.菌株ZT4-2、DJ1、TR2的分離及鑒定
[0042](一）菌株ZT4-2、DJI、TR2 的分離
[0043] 采集來自北京地區(qū)的不同植物根際的土樣，土樣具體信息見表1。土樣采自植物根 際土壤10cm處，樣品采集后置于密封袋中，實驗室4°C冰箱保存。稱取土壤樣品10g，放入 盛有90mL無菌水的三角瓶中，振蕩約20min。取土壤懸浮液lmL逐級稀釋至10 7倍，分別 取10 5、10 6、10 7濃度的土壤懸浮液均勻地涂于NA平板上，每個濃度梯度重復(fù)3皿，在27°C 恒溫下培養(yǎng)1~2d。從平板上挑取不同培養(yǎng)性狀的單菌落，繼續(xù)在ΝΑ平板上劃線純化，獲 得細(xì)菌純培養(yǎng)，給菌株編號并保存。
[0044] 表1 土樣米集?目息
[0045]
[0046] 三株細(xì)菌的菌落形態(tài)如圖1所示，菌株DJ1的菌落為圓形或近圓形，白色，邊緣不 光滑，表面有明顯褶皺。菌株TR2的菌落形態(tài)和DJ1比較相似，菌落為圓形或近圓形，白色， 邊緣不光滑，表面有明顯褶皺。菌株ZT4-2的菌落形態(tài)為圓形或近圓形，白色，平鋪，邊緣不 整齊，表面褶皺較少。
[0047](二）菌株ZT4-2、DJ1、TR2 的鑒定
[0048] 1菌株ZT4-2、DJ1、TR2生理生化鑒定
[0049] 1. 1淀粉酶的檢測
[0050] 檢測培養(yǎng)基：淀粉酶選擇培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基+1. 0%可溶性淀粉）：蛋白胨10g，酵 母膏5g，NaC15g，可溶性淀粉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH7. 8。
[0051]檢測方法：取 10μL搖培的待測菌株（ZT4-2、TR2、DJ1 和E.coliJM109,E.coli JM109為大腸桿菌對照菌株，不具有淀粉水解酶活性）滴加到檢測平板上，晾干后28°C恒溫 培養(yǎng)24-48h，然后用稀碘液覆蓋染色，清水沖洗，觀察透明圈大小。
[0052] 檢測結(jié)果：如圖2所示，可以看出，在三個菌株ZT4_2、TR2和DJ1的周圍都有透明 圈產(chǎn)生，說明它們都能產(chǎn)生淀粉酶，淀粉水解陽性。E.coliJM109的周圍無透明圈產(chǎn)生菌 株，不具有淀粉水解酶活性。
[0053] 1.2蛋白酶檢測
[0054] 檢測平板：含10 %的脫脂牛奶水瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂粉，lg/100mL水），選用三元脫 脂牛奶，先微波爐加熱，如果有脂肪膜則去掉，再用移液槍吸取10mL加到100mL已滅菌冷涼 的水瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)。
[0055] 檢測方法：將待測菌株（ZT4-2、TR2、DJ1和E. coli JM109)在NA培養(yǎng)基中搖培過 夜，取10μL滴加到檢測平板上，晾干后28°C恒溫培養(yǎng)，12h后觀察蛋白降解圈。
[0056] 檢測結(jié)果：如圖3所示，從圖3可以看出，在三個菌株ZT4_2、TR2和DJ1的周圍都 有較明顯的透明圈產(chǎn)生，說明它們都能產(chǎn)生蛋白酶，蛋白酶水解陽性。E.co1iJM109的周圍 也有較明顯的透明圈產(chǎn)生，也具有一定的蛋白水解酶活性。
[0057] L3纖維素酶檢測
[0058] 檢測平板：半LB培養(yǎng)基（碳源、氮源的量減半），加0. 2%的羧甲基纖維素鈉。
[0059] 檢測方法：將待測菌株（ZT4_2、TR2、DJ1和E. coli JM109)在NA培養(yǎng)基中搖培過 夜，取10μL滴加到檢測平板上，晾干后于28°C恒溫培養(yǎng)24h，洗掉菌落，加入lg/L剛果紅 溶液染色lh，然后用1M NaCl溶液浸泡洗滌2次進(jìn)行脫色，每次浸泡30min，觀察菌落周圍 有無纖維素水解圈。
[0060] 檢測結(jié)果：如圖4所示，可以看出，在三個菌株ZT4-2、TR2和DJ1的周圍都能產(chǎn)生 白色透明圈，說明它們都能產(chǎn)生纖維素酶，纖維素酶水解陽性。E.coliJM109菌株的周圍也 能產(chǎn)生白色透明圈，也具有纖維素水解酶活性。
[0061] 1.4脂肪酶檢測
[0062] 檢測培養(yǎng)基：油脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、花生油或香油10g、1.6%中性紅 水溶液lmL、瓊脂15g、蒸餾水1000mL、pH7.2。
[0063] 檢測方法：配制油脂培養(yǎng)基，滅菌后備用。倒平板前，將油脂培養(yǎng)基充分震蕩使油 脂均勻分布，再倒入培養(yǎng)皿