一種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基，由培養(yǎng)基經(jīng)菌種發(fā)酵得到，其中，所述培養(yǎng)基中的碳源包括毛葉山桐子粕，氮源包括菜籽粕；所述菌種選自酵母菌和根霉菌中的兩種以上。本發(fā)明以毛葉山桐子粕作為碳源、菜籽粕作為氮源，經(jīng)過(guò)酵母菌和根霉菌中的兩種發(fā)酵以后即可獲得枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基，以該培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌時(shí)能夠獲得較高的活菌數(shù)，同時(shí)采用毛葉山桐子粕和菜籽粕，極大地降低了生產(chǎn)成本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的擴(kuò)繁培養(yǎng)基用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌時(shí)，活菌數(shù)與常規(guī)培養(yǎng)基相當(dāng)，但是成本大幅降低。
【專利說(shuō)明】
一種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于菌種擴(kuò)繁技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代研究及應(yīng)用表明，枯草芽孢桿菌不僅列入飼料添加劑允許種類，其對(duì)養(yǎng)殖動(dòng) 物具有增強(qiáng)免疫力，安全無(wú)殘，且養(yǎng)殖用水修復(fù)上也非常有效。但是應(yīng)用中活菌數(shù)量直接關(guān) 系到效果，因此，規(guī)模化生產(chǎn)對(duì)應(yīng)用尤為重要。而擴(kuò)繁培養(yǎng)基中通常碳源采用葡萄糖、可溶 性淀粉、面粉、米粉等;氮源采用蛋白凍、牛肉浸膏、豆柏粉、酵母粉、魚(yú)粉等，用量大、單價(jià)相 對(duì)高，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，成為枯草芽孢桿菌等益生素廣泛應(yīng)用的瓶頸。
[0003] 目前，枯草芽孢桿菌常用的擴(kuò)繁培養(yǎng)基組成為：
[0004] 碳源:面粉23%~40%、米粉13%~40%組合；
[0005] 氮源:魚(yú)粉7 %~10 %、酵母粉6 %~10 %、豆柏粉6 %~10 %任意兩種組合；
[0006] 無(wú)機(jī)鹽:氯化鈉0.08%~0.25%、氯化鉀0.25%~1.9%、硫酸鎂0.5%~2.3%、碳 酸鈣0.08 %~2.3 %、磷酸二氫鉀0.1 %~0.3 %、碳酸氫鈉0.08 %~1.3 %組合；
[0007] 余量為純化水。
[0008] 但是，該擴(kuò)繁培養(yǎng)基成本較高。
[0009] 毛葉山桐子為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的木本油料，是當(dāng)今大力發(fā)展的油料作物。以山桐子發(fā)展 趨勢(shì)，按每噸山桐子油0.7噸柏計(jì)，10年后，年存山桐子柏將上千萬(wàn)噸。山桐子榨油后得到的 柏中粗蛋白質(zhì)含量6~9.3%、粗纖維含量21.18%，同時(shí)含有豐富的粗脂肪、黃酮類、銅、鐵、 錳、鋅等物質(zhì)，其資源豐富且價(jià)格低廉，無(wú)霉性和副作用。但毛葉山桐子柏直接飼用時(shí)可降 解利用程度低，只能作反芻動(dòng)物飼料原料廉價(jià)出售，或堆埋發(fā)酵做肥料，其附加值低、資源 化浪費(fèi)嚴(yán)重。由于毛葉山桐子是新興發(fā)展作物，其油研究應(yīng)用報(bào)道較多，柏幾乎沒(méi)有報(bào)道。
[0010] 菜籽柏是油菜籽榨油后的副產(chǎn)物，其粗蛋白含量在32%以上，粗纖維含量在12% 以下。但菜籽柏含有較多有毒有害物質(zhì)，如異硫氰酸酯、硫氰酸酯、惡唑烷硫酮、腈、芥子堿、 單寧、植酸等，可引起動(dòng)物甲狀腺腫大，抑制動(dòng)物生長(zhǎng)，極大的限制其增值應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基及其制備方法， 本發(fā)明提供的培養(yǎng)基在保證枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的基礎(chǔ)上極大降低了生產(chǎn)成本。
[0012] 本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基，由培養(yǎng)基經(jīng)菌種發(fā)酵得到，其中，所 述培養(yǎng)基中的碳源包括毛葉山桐子柏，氮源包括菜籽柏；
[0013] 所述菌種選自酵母菌和根霉菌中的兩種以上。
[0014] 本發(fā)明以毛葉山桐子柏作為碳源、菜籽柏作為氮源，經(jīng)過(guò)酵母菌和根霉菌中的兩 種發(fā)酵以后即可獲得枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基，以該培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌時(shí)能夠獲得 較高的活菌數(shù)，同時(shí)采用毛葉山桐子柏和菜籽柏，極大地降低了生產(chǎn)成本。
[0015] 在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基除了包括碳源、氮源，還包括無(wú)機(jī)鹽和水;其中，碳源除了 毛葉山桐子柏，優(yōu)選還包括面粉和米粉;氮源為菜籽柏;無(wú)機(jī)鹽優(yōu)選包括氯化鈉、氯化鉀、硫 酸鎂、碳酸鈣、磷酸二氫鉀和碳酸氫鈉。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基包括：25wt %~35wt %的毛葉山桐子柏；10wt %~ 20wt%的面粉；10wt%~20wt%的米粉；30wt%~45wt %的菜軒柏；0 · 08wt%~0 · 25wt%的 氯化鈉;〇 · 25wt %~1 · 9wt %的氯化鉀；0 · 5wt %~2 · 3wt %的硫酸鎂;0 · 08wt %~2 · 3wt %的 碳酸鈣;〇. lwt %~0.3wt %的磷酸二氫鉀;0.08wt %~1.3wt %的碳酸氫鈉;余量的水。
[0017] 在本發(fā)明中，所述菌種選自酵母菌和根霉菌中的兩種，優(yōu)選選自釀酒酵母、畢赤酵 母、紅酵母、假絲酵母和少孢根霉中的兩種以上，更優(yōu)選選自釀酒酵母和少孢根霉。
[0018] 將上述菌種在上述培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，即可獲得枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基。在本 發(fā)明中，所述發(fā)酵溫度為37°C，所述發(fā)酵時(shí)間為36h~72h。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
[0020] 將作為培養(yǎng)基碳源的毛葉山桐子柏和作為培養(yǎng)基氮源的菜籽柏消毒后加入菌種 和培養(yǎng)基的其他組分混合后進(jìn)行發(fā)酵，獲得枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基；
[0021 ]其中，菌種選自酵母菌和根霉菌中的兩種以上。
[0022] 本發(fā)明首先將毛葉山桐子柏和菜籽柏消毒，具體步驟為:將毛葉山桐子柏和菜籽 柏裝入發(fā)酵罐中，罐體密封后通入121~123°C的飽和蒸汽，當(dāng)罐體壓力達(dá)到0.5~2. OMPa后 維持0.5~lOmin。
[0023] 然后向其中加入菌種和培養(yǎng)基的其他組分混合后進(jìn)行發(fā)酵。其中，所述菌種為液 體菌液，按照以下方法制備:將培養(yǎng)活化的釀酒酵母、畢赤酵母、紅酵母、假絲酵母、少孢根 霉菌種用無(wú)菌生理鹽水制成懸浮液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~24h，分別得到發(fā)酵菌； 將上述任意二種以上發(fā)酵菌混合得到液體菌液。
[0024] 在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基包括：25wt%~35wt%的毛葉山桐子柏；10wt%~20wt% 的面粉；l〇wt %~20wt %的米粉；30wt %~45wt %的菜籽柏；0 · 08wt %~0 · 25wt %的氯化 鈉;0 · 25wt %~1 · 9wt %的氯化鉀;0 · 5wt %~2 · 3wt %的硫酸鎂;0 · 08wt %~2 · 3wt %的碳酸 鈣;0. lwt %~0.3wt %的磷酸二氫鉀;0.08wt %~1.3wt %的碳酸氫鈉;余量的水。
[0025] 在本發(fā)明中，所述發(fā)酵溫度為37°C，所述發(fā)酵時(shí)間為36h~72h。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，包括：
[0027] 將作為培養(yǎng)基碳源的毛葉山桐子柏和作為培養(yǎng)基氮源的菜籽柏消毒后加入菌種 和培養(yǎng)基的其他組分混合后進(jìn)行發(fā)酵，獲得擴(kuò)繁培養(yǎng)基;其中，菌種選自酵母菌和根霉菌中 的兩種以上；
[0028] 向所述擴(kuò)繁培養(yǎng)基中加入枯草芽孢桿菌菌種液進(jìn)行培養(yǎng)。
[0029]按照上述方法獲得擴(kuò)繁培養(yǎng)基后，將其消毒，加入枯草芽孢桿菌菌液進(jìn)行培養(yǎng)。具 體而言，所述消毒具體為：向擴(kuò)繁培養(yǎng)基中通入121~123°C的飽和蒸汽，當(dāng)壓力達(dá)到0.5~ 2. OMpa后維持5~15min，消毒并滅活擴(kuò)繁培養(yǎng)基中的發(fā)酵菌。
[0030] 枯草芽孢桿菌菌液按照以下方法制備:將培養(yǎng)活化的枯草芽孢桿菌菌種用無(wú)菌生 理鹽水制成懸浮液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~24h，得到枯草芽孢桿菌菌液。
[0031] 在本發(fā)明中，枯草芽孢桿菌菌液的加入量為擴(kuò)繁培養(yǎng)基的0.3wt %~5wt %，所述 培養(yǎng)的時(shí)間為24h~36h，所述培養(yǎng)的溫度為26°C~33°C。
[0032] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的擴(kuò)繁培養(yǎng)基用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌時(shí)，活菌數(shù)與常 規(guī)培養(yǎng)基相當(dāng)，但是成本大幅降低。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0034] 實(shí)施例1 [0035]培養(yǎng)基配方：
[0036] 碳源:30%毛葉山桐子柏，13 %面粉，13 %米粉；
[0037]氮源:40%菜籽柏；
[0038] 無(wú)機(jī)鹽:0.2 %氯化鈉、0.5 %氯化鉀、0.8 %硫酸鎂、0.1 %碳酸鈣、0.2 %磷酸二氫 鉀、0.2%碳酸氫鈉；
[0039] 余量水。
[0040]制備方法：
[0041 ]將毛葉山桐子柏、菜籽柏裝入發(fā)酵罐中，罐體密封后通入121~123°C的飽和蒸汽， 當(dāng)罐體壓力達(dá)到1.5MPa后維持lOmin，加入釀酒酵母和少孢根霉的混合菌液、面粉、米粉、氯 化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉，其中，釀酒酵母和少孢根霉的混合菌 液按照以下方法制備：將培養(yǎng)活化的釀酒酵母和少孢根霉菌種用無(wú)菌生理鹽水制成懸浮 液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)20h，分別得到釀酒酵母發(fā)酵液和少孢根霉發(fā)酵液，將二者混合 得到；將上述物料混合均勻后調(diào)節(jié)水分至60 %，制成混合物料，37 °C培養(yǎng)36~72小時(shí)，得到 擴(kuò)繁培養(yǎng)基。
[0042] 比較例1 [0043]培養(yǎng)基配方：
[0044] 碳源:30%毛葉山桐子柏，13 %面粉，13 %米粉；
[0045]氮源:40%菜籽柏；
[0046] 無(wú)機(jī)鹽:0.2 %氯化鈉、0.5 %氯化鉀、0.8 %硫酸鎂、0.1 %碳酸鈣、0.2 %磷酸二氫 鉀、0.2 %碳酸氫鈉 [0047] 余量水。
[0048]制備方法：
[0049] 將毛葉山桐子柏、菜籽柏、面粉和米粉勻漿，獲得漿料;氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、碳 酸鈣分別溶解后再與上述漿料混合，用磷酸二氫鈉和碳酸氫鈉調(diào)pH值為7.5~8.0，獲得培 養(yǎng)基。
[0050] 比較例2 [00511培養(yǎng)基配方：
[0052] 碳源：33%面粉，33 %米粉；
[0053] 氮源：10%魚(yú)粉，10%酵母粉；
[0054] 無(wú)機(jī)鹽:0.2 %氯化鈉、0.5 %氯化鉀、0.8 %硫酸鎂、0.1 %碳酸鈣、0.2 %磷酸二氫 鉀、0.2 %碳酸氫鈉 [0055] 余量水。
[0056] 制備方法：
[0057] 將面粉和米粉勻漿再加入魚(yú)粉和酵母粉進(jìn)行勻漿，獲得漿料;氯化鈉、氯化鉀、硫 酸鎂、碳酸鈣分別溶解后再與上述漿料混合，用磷酸二氫鈉和碳酸氫鈉調(diào)pH值為7.5~8.0， 獲得培養(yǎng)基。
[0058] 實(shí)施例2
[0059] 將實(shí)施例1、比較例1和比較例2制備的培養(yǎng)基導(dǎo)入發(fā)酵罐中，攪拌條件下加熱至 121~123°C消毒45min，冷卻至常溫備用。
[0060] 分別向?qū)嵤├?、比較例1和比較例2制備的培養(yǎng)基中加入2wt %的不同菌株的枯草 芽孢桿菌菌液，混合均勻后調(diào)節(jié)水分至50%制成混合物料，培養(yǎng)36h，得到發(fā)酵物料。
[0061] 分別對(duì)所述發(fā)酵物料進(jìn)行鏡檢形態(tài)觀察，比較例2的發(fā)酵物料中枯草芽孢桿菌已 大部分形成芽孢，且形態(tài)較好;比較例1的發(fā)酵物料中單個(gè)營(yíng)養(yǎng)體、成鏈狀營(yíng)養(yǎng)體、芽孢共同 存在，活菌量少。
[0062] 分別檢測(cè)發(fā)酵物料中活菌數(shù)，結(jié)果參見(jiàn)表1，表1為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的 發(fā)酵物料中的活菌數(shù)。
[0063] 表1本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的發(fā)酵物料中的活菌數(shù)(億/毫克）
[0064]
[0065] 表1中，各菌株購(gòu)于四川省工業(yè)菌種保藏中心。
[0066] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基，其特征在于，由培養(yǎng)基經(jīng)菌種發(fā)酵得到，其中，所述 培養(yǎng)基中的碳源包括毛葉山桐子柏，氮源包括菜籽柏； 所述菌種選自酵母菌和根霉菌中的兩種以上。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)繁培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括：25wt %~35wt % 的毛葉山桐子柏；10wt%~20wt%的面粉；10wt%~20wt%的米粉；30wt%~45wt%的菜籽 柏；0 · 08wt %~0 · 25wt %的氯化鈉；0 · 25wt %~1 · 9wt %的氯化鉀；0 · 5wt %~2 · 3wt %的硫 酸儀;〇·〇8wt%~2·3wt%的碳酸|丐；0· lwt%~0·3wt%的磷酸二氫鉀；0·08wt%~1 ·3wt% 的碳酸氫鈉;余量的水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)繁培養(yǎng)基，其特征在于，所述菌種選自釀酒酵母、畢赤酵母、 紅酵母、假絲酵母和少孢根霉中的兩種以上。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)繁培養(yǎng)基，其特征在于，所述發(fā)酵溫度為37°C，所述發(fā)酵時(shí) 間為36h~72h。5. -種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟： 將作為培養(yǎng)基碳源的毛葉山桐子柏和作為培養(yǎng)基氮源的菜籽柏消毒后加入菌種和培 養(yǎng)基的其他組分混合后進(jìn)行發(fā)酵，獲得枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基； 其中，菌種選自酵母菌和根霉菌中的兩種以上。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括:25wt %~35wt %的 毛葉山桐子柏；l〇wt %~20wt%的面粉；10wt%~20wt %的米粉；30wt%~45wt%的菜籽 柏；0 · 08wt %~0 · 25wt %的氯化鈉；0 · 25wt %~1 · 9wt %的氯化鉀；0 · 5wt %~2 · 3wt %的硫 酸儀;〇·〇8wt%~2·3wt%的碳酸|丐；0· lwt%~0·3wt%的磷酸二氫鉀；0·08wt%~1 ·3wt% 的碳酸氫鈉;余量的水。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述菌種選自釀酒酵母、畢赤酵母、紅 酵母、假絲酵母和少孢根霉中的兩種以上。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵溫度為37°C，所述發(fā)酵時(shí)間 為36h~72h。9. 一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，包括： 將作為培養(yǎng)基碳源的毛葉山桐子柏和作為培養(yǎng)基氮源的菜籽柏消毒后加入菌種和培 養(yǎng)基的其他組分混合后進(jìn)行發(fā)酵，獲得擴(kuò)繁培養(yǎng)基;其中，菌種選自酵母菌和根霉菌中的兩 種以上； 向所述擴(kuò)繁培養(yǎng)基中加入枯草芽孢桿菌菌種液進(jìn)行培養(yǎng)。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的時(shí)間為24h~36h，所述培 養(yǎng)的溫度為26°C~33°C。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK106085917SQ201610595088
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月26日 公開(kāi)號(hào)201610595088.5, CN 106085917 A, CN 106085917A, CN 201610595088, CN-A-106085917, CN106085917 A, CN106085917A, CN201610595088, CN201610595088.5
【發(fā)明人】宋艷
【申請(qǐng)人】宋艷