一株枯草芽孢桿菌、發(fā)酵方法、粉劑和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌，同時還涉及該枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法、含有該 枯草芽孢桿菌的粉劑和應用，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 海濱錦葵(Kosteletzkya virginica)是一種耐鹽、能利用鹽堿地和干旱土壤的抗 逆植物，原生長于美國東、南海岸，1992年以后陸續(xù)被科學家引入中國。海濱錦葵的種子含 有較高的不飽和脂肪酸和較高的蛋白質，其塊根含有多糖、皂苷等成分和抗癌活性成分，能 提高動物的生產性能和免疫力，具有作為飼料、藥等的開發(fā)潛力。
[0003] 枯草芽孢桿菌是我國允作料添加的兩種芽孢桿菌之一，能夠產生氨基糖類、磷脂 類、肽類和脂肽類等多種抗生素，已被越來越多的研制成微生物制劑(無毒、無殘留、無染色 的添加）?？莶菅挎邨U菌具有以下優(yōu)點：（1)枯草芽孢桿菌具有蛋白、脂肪和淀粉等活性，能 產生抗菌素，其中脂肽類抗生素(包括伊枯草菌素、泛革素和表面活性素)是枯草芽孢桿菌 最重要的抗菌物質。（2)枯草芽孢桿菌在動物腸道內具有較強的生物奪氧能力，這些特性對 促進動物營養(yǎng)的消化吸收，提高動物的飼料轉化率和疾病防治都有著重要作用，從抗菌機 理上看，既可以干擾病原菌的生物合成系統(tǒng)，也可以對病原菌的細胞壁、細胞膜、核酸和蛋 白質等直接作用，從而達到促進動物生長的目的。（3)枯草芽孢桿菌對致病性大腸桿菌和沙 門氏菌都有一定的抑制作用。（4)枯草芽孢桿菌能夠通過增強機體的谷胱甘肽過氧化物酶 活性等總抗氧化能力，降低血清及肝臟中丙二醛等氧化終產物的含量，提高畜禽的抗氧化 性能。但是，目前在枯草芽孢桿菌的工業(yè)化生產中，仍然存在發(fā)酵周期長、芽孢形成率低、成 本高等問題。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一株枯草芽孢桿菌，同時還涉及該枯草芽孢桿 菌的發(fā)酵方法、含有該枯草芽孢桿菌的粉劑和應用，該枯草芽孢桿菌能夠提高仔豬的生產 性能和吸收性能，調節(jié)豬腸道微生物菌群，該枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法簡單、活菌數(shù)多且芽 孢形成率高。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是:一株枯草芽孢桿菌，所述枯草芽 孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Baci 1 lus subti 1 is)Gv-l，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏地址：中國武漢武漢大學，保藏號:CCTCC N0:M2015766,保藏日期:2015年12月21日。
[0006] -種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法，將枯草芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，恒溫振 蕩培養(yǎng)，至〇D_達到1.0，得到枯草芽孢桿菌菌液，再將枯草芽孢桿菌菌液以1 %的接種量接 種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 °C發(fā)酵24-72h。
[0007] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為:將海冰錦葵塊根提取液和普通肉湯培養(yǎng)基按照體 積比4-0.5:1的比例混合，得到混合培養(yǎng)液，再加入混合培養(yǎng)液總重量0.02 %的(NH4)2S〇4和 0.04% 的 NaOH，調節(jié) pH 至 9.0，121°〇高壓滅菌3〇111；!_11。
[0008] 所述的海冰錦葵塊根提取液的制備方法為:將海濱錦葵塊根清洗、干燥并切塊，加 水煮沸3次，每次30min，過濾，合并三次煮沸濾液即得;其中，每次加水量為海濱錦葵塊根重 量3倍。
[0009] -種含有枯草芽孢桿菌的粉劑，所述的粉劑的制備方法包括以下步驟：
[0010] (1)將枯草芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)，至OD600達到1.0，得到 枯草芽孢桿菌菌液，再將枯草芽孢桿菌菌液以1 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C發(fā)酵 24-72h；
[0011] (2)將步驟(1)的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液以12-18%的接種量接種于擴大培養(yǎng)培養(yǎng)基 中，35-39 °C、150-250r/min發(fā)酵48h;
[0012] (3)將步驟(2)的發(fā)酵液加入自動排渣碟式分離機中離心，得到菌泥，將菌泥和菌 泥載體按照質量比1:2混合，再送入高效沸騰干燥機中烘干，最后用粉碎機粉碎即得。
[0013] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為:將海冰錦葵塊根提取液和普通肉湯培養(yǎng)基按照體 積比4-0.5:1的比例混合，得到混合培養(yǎng)液，再加入混合培養(yǎng)液總重量0.02 %的(NH4)2S〇4和 0 · 04% 的 NaOH，調節(jié) pH至9 · 0，121 °C 高壓滅菌 30min;
[0014] 所述的海冰錦葵塊根提取液的制備方法為:將海濱錦葵塊根清洗、干燥并切塊，加 水煮沸3次，每次30min，過濾，合并三次煮沸濾液即得;其中，每次加水量為海濱錦葵塊根重 量3倍。
[0015] 所述擴大培養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法為:將海冰錦葵塊根提取液、普通肉湯培養(yǎng)基和 玉米粉按照體積比8:1:1的比例混合，得到混合培養(yǎng)液，再加入混合培養(yǎng)液總重量0.02 %的 (順4) 2S〇4和0 · 04 % 的 NaOH，調節(jié)pH至9 · 0，121°C 高壓滅菌 30min。
[0016] 所述擴大培養(yǎng)培養(yǎng)基中還可加入少許植物油作為消泡劑。
[0017]步驟(3)中發(fā)酵液加入自動排渣碟式分離機的流量為400L/h，高效沸騰干燥機的 進風溫度為70°C，烘干時間為3h。
[0018] -種含有枯草芽孢桿菌粉劑的豬飼料，所述的豬飼料包括以下重量份的原料:玉 米44份、豆柏45份、麥麩10份、枯草芽孢桿菌粉劑0.01-0.03份、預混料1份;所述的預混料為 每 10千克預混料中含有VA 5512U、VD 640U、VK3 2.2U、VE 20U、VB12 27.6yg、VB2 5.5mg、D-泛酸 14.8mg、煙酸30 · 3mg、膽堿500mg、銅50mg、鐵100mg、鋅50mg、猛10mg、碘0 · 85mg、硒 0.25mg〇
[0019] -種枯草芽孢桿菌在促進植物生長和提高植物高鹽濃度下抗逆性方面的應用。
[0020] -種枯草芽孢桿菌在提高豬生產性能、吸收能力和調節(jié)腸道菌群方面的應用。
[0021] 本發(fā)明有益效果
[0022] 1、本發(fā)明首次從海濱錦葵塊根中分離海濱錦葵塊根內生菌，并通過純化，16S rDNA測序以及形態(tài)生理特征分析，確定分離培養(yǎng)得到的菌株Gv-Ι為枯草芽孢桿菌。
[0023] 2、本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Gv-Ι能夠促進植物的生長，提高植物高鹽濃度下的抗逆 性。
[0024] 3、本發(fā)明通過正交實驗，優(yōu)化枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件，最終確定在菌液接種量 1%、發(fā)酵溫度37°C的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)基中海濱錦葵塊根提取液和普通肉湯培養(yǎng)基體積為 4:1，發(fā)酵時間72h，活菌數(shù)最多，達到1.64 X 109cfu/ml，芽孢率達到99 %。
[0025] 4、本發(fā)明通過正交實驗，再次優(yōu)化枯草芽孢桿菌在發(fā)酵罐中的發(fā)酵工藝條件，最 終確定在發(fā)酵時間相同的條件下，菌種接種量15%、發(fā)酵溫度37°C、培養(yǎng)基pH9.0、轉速 250r/min，發(fā)酵液中的活菌量最多，達到9.926Log(cfu/mL)。
[0026] 5、本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵液制備枯草芽孢桿菌粉劑，并添加到豬飼料中， 結果表明，添加了枯草芽孢桿菌粉劑的豬飼料，能夠充分發(fā)揮枯草芽孢桿菌Gv-1的作用，促 進仔豬的生產性能和對蛋白質、Ca、P的消化吸收，改善仔豬腸道的微生態(tài)菌群，使腸道微生 態(tài)系統(tǒng)處于最佳的平衡狀態(tài)。
[0027] 6、本發(fā)明方法具有操作簡單，成本低，周期短和易于實現(xiàn)的優(yōu)點。同時，本發(fā)明原 料來源豐富易取，成本低，無環(huán)境污染，所用設備、試劑價格便宜，便于規(guī)模化生產。
【附圖說明】
[0028] 圖1為菌株Gv-1的菌落形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0029]以下結合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0030] 本發(fā)明所用的部分培養(yǎng)基為常見培養(yǎng)基，具體如下：
[0031] PDA平板(PDA固體培養(yǎng)基）：馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200g馬鈴薯切成小塊，加水煮 爛，過濾，濾液加20g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖20g，攪拌均勻， 再補足水分至l〇〇〇mL，121°C高壓滅菌20min，鋪平板，冷卻即可。
[0032]牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂15-20g，補水至 lL，pH7.4-7.6。
[0033] LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g，補水至lL，pH7.0。
[0034] 實施例1海濱錦葵塊根內生菌的分離、純化、鑒定和保存
[0035] 1、海濱錦葵塊根內生菌的分離、純化
[0036] 海濱錦葵材料取自由美國引進的中國大陸種植的第一年生長的海濱錦葵塊根。海 濱錦葵種植試驗區(qū)位于34° 837 1113° 5(TE，地處河南省鄭州市惠濟區(qū)黃河灘涂。種子種植 的海濱錦葵，在一年生長周期后，冬季進入休眠期，整體取出地下部分塊根，作為實驗材料。 [0037]將田間新鮮挖去的海濱錦葵塊根清洗、通風晾干，無菌條件下使用手術刀片去除 植物表皮。用70 %乙醇浸泡lmin，無菌