一種產(chǎn)脂肪酶的芽孢桿菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種芽孢桿菌<i>Bacillus </i>sp. HFE722及其應(yīng)用，該菌株已于2015年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC NO:M 2015735。本發(fā)明所選育的菌株可高產(chǎn)脂肪酶，以地溝油為原料，使得廢物再利用，保護(hù)了環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了可持續(xù)發(fā)展；該菌株作為飼料添加劑能顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善牲畜生長性能、調(diào)節(jié)腸道微生物群系并降低料重比等，為降低畜禽養(yǎng)殖成本、提高經(jīng)濟(jì)效益提供了重要的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。CCTCC NO:M 201573520151210
【專利說明】
一種產(chǎn)脂肪酶的芽孢桿菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一株產(chǎn)脂肪酶能力較強(qiáng)的芽孢桿菌(Bacillus sp.)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶是一類特殊酯鍵水解酶，是目前緊俏的生物催化劑之一，一般用于催化水解和合成反應(yīng)。脂肪酶的催化活性主要在于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯鍵的水解，水解生成甘油一酯、二酯或者直接生成甘油和脂肪酸。
[0003]微生物來源的脂肪酶含量最為豐富，包括細(xì)菌、霉菌和酵母來源的。由于微生物種類多、繁殖快，產(chǎn)生的脂肪酶具有比動(dòng)植物脂肪酶作用更廣的PH值，而且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和樣品提純，因此，微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，是生物技術(shù)和有機(jī)化學(xué)應(yīng)用中使用最為廣泛的酶類之一。
[0004]微生物脂肪酶大致可分為3大類:S卩非特異性、特異選擇性和底物特異性基礎(chǔ)上的脂肪酶。非特異性脂肪酶隨機(jī)作用于甘油三酯分子，甘油三酯被完全水解為脂肪酸和甘油。與此相反，特異性脂肪酶是I，3位特異性脂肪酶，只水解甘油三酯Cl和C3酯鍵，從而產(chǎn)生游離脂肪酸、I，2—甘油二酯、2，3—甘油二酯和2—甘油單酯。細(xì)菌胞外脂肪酶是特異性脂肪酶。第三類脂肪酶包含脂肪酸特異性脂肪酶，它表現(xiàn)為明顯的脂肪酸優(yōu)先水解性。
[0005]脂肪酶在各行各業(yè)均有廣泛的應(yīng)用，在飼料中添加脂肪酶可以提高油脂的消化利用率，為動(dòng)物體提供更多的能量;在食品中利用脂肪酶作用反應(yīng)后釋放出的鏈較短的脂肪酸，可以增加和改進(jìn)食品的風(fēng)味和香味;在造紙工業(yè)中添加脂肪酶能直接分解廢紙上的油墨、涂料及色料，達(dá)成脫墨效果，還能去除紙漿中的樹脂、造紙用白水及冷卻水的黏泥。在皮革加工中，脂肪酶作為一種高效無污染的脫脂劑，尤其在堿性條件下使得脂肪更易從皮中除去;在洗滌工業(yè)中，加入脂肪酶可使甘油三酯分解成容易祛除的脂肪酸和甘油，可大大提高洗滌劑的去污效果，而且脂肪酶是生物產(chǎn)品，易被降解，不污染環(huán)境;在白酒釀造中，脂肪酶可用于促進(jìn)白酒中脂、酸、醇的平衡；另外脂肪酶作用于非水相催化中，可以催化合成脂類物質(zhì)，也就是我們所說的生物柴油，也是當(dāng)前所研究的熱點(diǎn)之一。
[0006]在自然界中產(chǎn)生脂肪酶的微生物資源非常豐富，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，產(chǎn)脂肪酶的微生物多達(dá)65個(gè)屬，其中細(xì)菌占28個(gè)屬，放線菌占4個(gè)屬，酵母菌占10個(gè)屬，真菌占23個(gè)屬。因此，微生物脂肪酶是工業(yè)酶催化劑的重要來源。其中芽孢桿菌具有較強(qiáng)抗逆性、易生產(chǎn)、易保存等優(yōu)點(diǎn)，是一種很好的微生物飼料添加劑，且產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶、抗大腸桿菌等功能菌株已經(jīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，但產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌應(yīng)用研究還比較少。優(yōu)良的微生物制劑必須長期儲(chǔ)藏不失活。普通菌體耐受性差，儲(chǔ)藏期短，易死亡，并不是理想的微生物制劑。芽孢是產(chǎn)芽孢菌在其生長發(fā)育后期細(xì)胞內(nèi)形成的圓形或橢圓形的抗逆性休眠體，具有極強(qiáng)的抗熱、抗輻射、抗化學(xué)藥物和抗靜水壓等一些特殊的性質(zhì)，這些生物學(xué)特征使芽孢桿菌具有非常良好的應(yīng)用前景，特別是在使用活菌制劑的生物制品中表現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明人利用屠宰場廢棄物對產(chǎn)脂肪酶的芽孢桿菌進(jìn)行篩選和優(yōu)化，對獲得的芽孢桿菌做進(jìn)一步選育，最終獲得了一株產(chǎn)脂肪酶的芽孢桿菌(Bacillus sp.HFE722)，已于2015年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為= CCTCC Ν0:Μ 2015735。
[0008]BacilIus sp.HFE722以食堂所產(chǎn)生的地溝油為原料，發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶，然后將脂肪酶應(yīng)用于飼料添加劑。地溝油的粗處理過程為:取食堂的廢棄物先過濾除掉廢渣，再離心取上清液備用。通過比較在相同添加量下，上述地溝油與橄欖油、大豆油等對脂肪酶酶活的影響，得出地溝油可以完全取代其它油種，作為培養(yǎng)基添加劑促進(jìn)菌株產(chǎn)脂肪酶。這樣，不僅解決了廢物再利用的問題，而且也促進(jìn)了酶活的大幅度提升，微生物菌體后續(xù)作為飼料添加劑成效也得到了改善。
[0009]本發(fā)明通過篩選獲得的芽孢桿菌Bacillussp.HFE722具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著進(jìn)步:(I)本發(fā)明所選育的菌株通過優(yōu)化，發(fā)酵后所得發(fā)酵液中脂肪酶酶活達(dá)到12.6υ/πιΙ^(2)本發(fā)明所選育的菌株，以地溝油為原料產(chǎn)脂肪酶，使得廢物再利用，保護(hù)了環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了可持續(xù)發(fā)展。(3)本發(fā)明人所獲得的菌株不僅僅能高產(chǎn)脂肪酶，更重要的是菌體作為飼料添加劑能顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善牲畜生長性能、調(diào)節(jié)腸道微生物群系并降低料重比等，為降低畜禽養(yǎng)殖成本、提高經(jīng)濟(jì)效益提供了重要的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0010]圖1為發(fā)酵周期對酶活的影響曲線圖。
[0011 ]圖2為發(fā)酵溫度對酶活的影響柱形圖。
[0012]圖3為接種量對酶活的影響柱形圖。
[0013]圖4為初始pH對酶活的影響柱形圖。
[0014]圖5為裝液量對酶活的影響柱形圖。
[0015]圖6為不同油類對酶活的影響柱形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下通過實(shí)施例形式對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0017]實(shí)施例1:菌種的選育
(I)試驗(yàn)中所用培養(yǎng)基及溶液
每100g富集培養(yǎng)基含有:地溝油10mL、酵母膏2g、NaCl 0.5g,K2HPO4 lg、MgSO4.7H20 O-1g^(NH4)2SO4 lg、余量為水，pH自然;
每100g選擇性分離培養(yǎng)基含有:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、三丁酸甘油酯2mL、瓊脂20g，余量為水，pH自然；
每100g搖瓶種子培養(yǎng)基含有:葡萄糖 20g、K2HP04 lg、MgS04.7H20 0.5g、(NH4)2SO45g、蛋白胨25g、地溝油1mL、余量為水，pH自然； 每100g固體斜面培養(yǎng)基含有:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、瓊脂20g、余量為水，pH自然；
每100g搖瓶上復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基含有:葡萄糖5g、K2HP04 lg、MgS04.7H2O 0.5g、(NH4)2SO4 lg、酵母粉20g、地溝油10mL、余量為水，ρΗ7.0。
[0018]無菌生理鹽水:取8.5g氯化鈉溶于IL的蒸餾水中溶解，0.1MPa滅菌20min。
[0019](2)實(shí)驗(yàn)步驟
從屠宰廠采集土樣15份，首先從每份樣品中取一定樣品，用無菌生理鹽水將樣品打散;再用富集培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)Id;接著用生理鹽水梯度稀釋成不同的土壤懸液，取0.1mL涂布于選擇性分離平板置37°C條件下，培養(yǎng)2-3 d，挑取透明圈大且明顯的菌株作為初篩菌株;挑出平板上的單菌落，接入斜面固體培養(yǎng)基保藏備用。
[0020]通過搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證，獲得了一株產(chǎn)脂肪酶能力較強(qiáng)的芽孢桿菌(Bacillussp.HFE722)，于2015年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2015735ο
[0021]實(shí)施例2:芽孢桿菌BaciIIus sp.HFE722的培養(yǎng)條件優(yōu)化
(I)菌株:實(shí)施例1篩選出的菌種芽孢桿菌BaciIIus sp.HFE722。
[0022](2)方法步驟:
采用單因素試驗(yàn)考察Bacillus sp.HFE722的發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵周期、接種量、裝液量對脂肪酶產(chǎn)量的影響。
[0023]發(fā)酵培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基(葡萄糖5g、K2HP04 lg、MgS04.7H20 0.5g、(NH4)2SO4I g、酵母粉20g、地溝油1mL、余量為水)ο初始發(fā)酵條件為:自然pH，接種量1%( v/v)，裝液量100 mL/250 mL，30°C，160r/min搖瓶發(fā)酵36h。
[0024]a.發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)
其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，每隔6h取樣測量脂肪酶酶活，確定芽孢桿菌Bacillussp.HFE722產(chǎn)脂肪酶的最優(yōu)發(fā)酵周期。由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵到36h時(shí)酶活最高，為4.7U/mL，故選擇發(fā)酵周期為36h。
[0025]b.發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn)
發(fā)酵時(shí)間取上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果，其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，分別在26°C、28°C、30°C、32°C、34°C、36°C和38°C搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后測定脂肪酶酶活，考察溫度對芽孢桿菌Baci I Ius sp.HFE722產(chǎn)脂肪酶的影響。由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30°C時(shí)，酶活最高，為5.2 U/mL，故選擇發(fā)酵溫度為30°C。
[0026]c.接種量的優(yōu)選試驗(yàn)
發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度取上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果，其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，接種量分別為0.5%、1%、I.5%、2%、2.5%和3%( v/v)時(shí)，考察接種量對芽孢桿菌Baci IIus sp.HFE722產(chǎn)脂肪酶的影響。由圖3知，當(dāng)接種量為1%時(shí)，酶活最高，為4.3U/mL，故選擇接種量為1%。
[0027]d.初始pH的優(yōu)選試驗(yàn)
發(fā)酵時(shí)間、溫度、和接種量取上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果，其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，調(diào)整初始口!1分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定脂肪酶酶活，考察pH對芽孢桿菌BaciIIus sp.HFE722產(chǎn)脂肪酶的影響。由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵初始pH為7.0時(shí)，酶活最高4.8U/mL，故選擇初始pH為7.0。
[0028]e.發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn)
發(fā)酵時(shí)間、溫度、和接種量和初始PH取上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果，其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，采用250 mL搖瓶裝液，搖瓶裝液量分別為25mL、50mL、75mL、10mL、125mL時(shí)，考察裝液量對芽孢桿菌Bacillus sp.HFE722產(chǎn)脂肪酶的影響。由圖5可知，當(dāng)搖瓶裝液量為50mL(搖瓶體積250mL)時(shí)，酶活為5.8U/mL，故選擇裝液量為50mL(搖瓶體積250mL)。
[0029]實(shí)施例3:地溝油、橄欖油、大豆油、花生油、棉籽油對菌株HFE722產(chǎn)酶的影響將初始培養(yǎng)基中的地溝油分別換成橄欖油、大豆油、花生油和棉籽油，考察在相同的添加量下，各種油類添加劑對菌株產(chǎn)酶的影響。
[0030]圖6對照組指的是未添加任何油類，由圖可知，地溝油、橄欖油和棉籽油對酶活的影響差別不大，其中當(dāng)添加劑為地溝油時(shí)，酶活最高為6.3U/mL。從成本和環(huán)保的角度考慮，地溝油可以完美取代其它油種，作為培養(yǎng)基的產(chǎn)酶促進(jìn)劑。
[0031]實(shí)施例4:HFE722菌株在飼料添加劑上的應(yīng)用
通過體外模擬的人工胃腸道，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)菌株HFE722對模擬的人工胃腸道耐受性比較強(qiáng)。通過了安全性檢測，說明了它對動(dòng)物沒有毒害作用。然后將HFE722菌劑以蛋雞為作用對象，研究發(fā)現(xiàn)，雞的十二指腸內(nèi)脂肪酶的活性明顯提高，各營養(yǎng)物質(zhì)在糞便中的殘留物降低，同時(shí)能夠顯著提高盲腸中乳桿菌及雙歧桿菌的含量以及降低大腸桿菌的含量。說明了HFE722菌劑作為飼料添加劑能顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善牲畜生長性能、調(diào)節(jié)腸道微生物群系并降低料重比等，為降低畜禽養(yǎng)殖成本、提高經(jīng)濟(jì)效益提供了重要的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。
[0032]實(shí)施例5:發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)
以芽孢桿菌Bacillus sp.HFE722為發(fā)酵菌株;培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間36h，溫度30°C，接種量1%，初始PH7.0，裝液量50mL(搖瓶為250mL);培養(yǎng)基成分為:葡萄糖5g、K2HPO4 Ig、MgSO4.7H20 0.5g, (NH4)2SO4 lg、酵母粉20g、地溝油10mL，進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵后所得發(fā)酵液中脂肪酶酶活為12.6U/mLo
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種產(chǎn)脂肪酶的芽孢桿菌Baci I Ius sp.HFE722，其特征在于:該菌株Baci I Iussp.HFE722已于2015年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物包藏中心，分類命名為Bacillussp.HFE722保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2015735。2.—種產(chǎn)脂肪酶的芽孢桿菌BaciIIussp.HFE722的應(yīng)用，其特征在于:該菌株可以地溝油為原料發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶。3.—種產(chǎn)脂肪酶的芽孢桿菌BaciIIussp.HFE722的應(yīng)用，其特征在于:該菌株可應(yīng)用在飼料添加劑中。
【文檔編號(hào)】C12N9/20GK105820980SQ201610259438
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月25日
【發(fā)明人】蔡俊, 胡珺, 王常高, 杜馨, 林建國
【申請人】湖北工業(yè)大學(xué)