專利名稱：云南紅梨PybHLH基因及其原核表達載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種云南紅梨花青素生物合成、毛狀體發(fā)生發(fā)育及鹽脅迫調(diào)控蛋白基因及其原核表達和原核表達載體在制備PybHLH蛋白和特異性抗體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅色果皮是梨分子育種的重要性狀指標。云南省因其獨特的地理和氣候條件而擁有較多的紅皮梨種質(zhì)資源，1986年以來先后已選育出早白蜜、美人酥、滿天紅和云紅梨I號四個栽培品種。但生產(chǎn)中除云紅梨I號外，其它3個品種都會因氣候變化而導(dǎo)致著色較差甚至不著色，因此需要研究紅梨果皮的著色機理。已有研究表明植物花青素的合成是由轉(zhuǎn)錄復(fù)合物MYB/bHLH/ WD40調(diào)控的。前人對MYB研究較多，而對植物中的bHLH和WD40蛋白研究較少。在擬南芥中LDOX基因啟動子直接包括EGL3和TT8在內(nèi)的不同的MYB-BHLH-TTG1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的調(diào)控，egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突變體試驗也表明了 egl3和tt8是擬南芥幼苗花青素累積的必要條件。在擬南芥中JAZ( Jasmonate ZIM-domain)蛋白與WD-repeat/bHLH/MYB 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的 bHLH (Transparent Testa8, Glabra3 [GL3]和 Enhancer ofGlabra3 [EGL3])和R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子(MYB75和Glabral)互作，抑制了 JA調(diào)控的花青素的累積和毛狀體的發(fā)生，而JA誘導(dǎo)的JAZ蛋白的降解能夠解除這種抑制。在大麗花(DahI iavariabilis)中，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子 DvIVS 通過調(diào)控 DvCHSl, DvF3H, DvDFR 和 DvANS 的轉(zhuǎn)錄來參與其花青素的生物合成。在葡萄中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYCAl可能通過調(diào)控ANR和UFGT基因的表達來調(diào)控其花青素的生物合成。在龍膽花(G.triflora)中，GtMYB3和GtbHLH參與花青素的生物合成。Zhang等人通過酵母雙雜交和植物過表達技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGL3、GL3能夠與TTGl (WD40)和 MYB 蛋白(GLl, PAPl、PAP2、CPC、TRY)組合，形成 MYB/bHLH/WD40 復(fù)合物進行包括花青素生物合成和毛狀體形 成的多功能的調(diào)控。Baudry等人通過遺傳和分子的方法發(fā)現(xiàn)TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能夠形成四元復(fù)合物直接調(diào)控BAN在植物中的表達。Payne等通過酵母雙雜交證實了在擬南芥中GL3/GL1/TTG1復(fù)合物調(diào)控毛狀體的發(fā)育。Bouyer通過克隆分析、誤表達和微注射試驗提出了毛狀體形成的捕獲_耗盡機制:在高濃度的毛狀體促進蛋白GL3細胞中，GL3通過結(jié)合毛狀體形成蛋白TTGl來耗盡臨近細胞中的TTGl，從而導(dǎo)致毛狀體形成，而周圍的細胞因TTGl的減少而不能形成毛狀體。而Zhao等人通過離子轟擊試驗證明了 TTGl，GL3，GLl和GL2并不在鄰近細胞間轉(zhuǎn)移，而R3-MYB，CPC則可在鄰近細胞間轉(zhuǎn)移，提出TTGl復(fù)合物直接調(diào)節(jié)激活子和抑制子，而抑制子的運動影響擬南芥葉上毛狀體的類型。另外，植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子也參與植物抗逆性機制，擬南芥中過表達0rbHLH2或OrbHLHOOl基因增強擬南芥的抗鹽和抗冷的特性。在云南紅梨著色機理研究方面，本實驗室研究了光照對云南紅梨著色的影響、構(gòu)建了光誘導(dǎo)果皮差異表達基因的SSH文庫，進行了著色相關(guān)基因的分離和表達分析。前期研究結(jié)果表明云南紅梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40調(diào)控的。前期分離克隆的基因的部分片段(Λ構(gòu)建的原核表達載體，由于該載體只含有PybHLH基因的一段序列而不是全長序列，獲得的PybHHL抗體特異性不是很理想，不能準確的用于分離與PybHLH蛋白相互作用的蛋白質(zhì)和DNA片段；在前人研究基礎(chǔ)上，針對云南紅梨栽培品種早白蜜、滿天紅、美人酥著色不穩(wěn)定、在國內(nèi)外尚未見有關(guān)云南紅梨果皮紅色著色機理方面研究報道，本研究選擇著色最好且穩(wěn)定的‘云紅梨I號’作為實驗材料，克隆了 ‘云紅梨I號’中基因的全長序列，并且進行了序列分析、原核表達和蛋白純化抗體制備的研究，這將為研究云南紅梨轉(zhuǎn)錄因子PybHLH的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，并為作物花卉育種提供有利的科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種云南紅梨基因，該基因主要是對云南紅梨花青素生物合成、毛狀體發(fā)生發(fā)育及鹽脅迫調(diào)控蛋白起作用，/>況￡//基因來源于云紅梨I號，云南紅梨基因含有兩個相連的基本亞區(qū)，即富含堿性氨基酸BASIC區(qū)域及其下游的HLH區(qū)域，其中堿性氨基酸基序與DNA的結(jié)合有關(guān)，對基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用。本發(fā)明另一目的是提供云南紅梨/基因的原核表達載體V從奶-PybHLH,該載體含有基因，上游有Ptac啟動子和細菌核糖體結(jié)合位點RBS，Ptac啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，基因的N端含有GST標簽。本發(fā)明另一目的是將原核表達載體應(yīng)用在制備云南紅梨色素合成特異性調(diào)控蛋白 PybHLH 中。本發(fā)明另一目的是將原核表達載體應(yīng)用在制備PybHLH特異性抗體中，PybHLH特異性抗體應(yīng)用在檢測其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達情況、PybHLH蛋白的亞細胞定位檢測、PybHLH蛋白的純化并且在蛋白相互作用分析以及用于Far Western Blot和免疫沉淀(IP)及染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
1、原核表達載體的構(gòu)建
(I)根據(jù)蘋果MdbHLH33基因(GenBank登錄號為DQ266451.1)編碼框，設(shè)計I對特異引物 PybHLH-F:5’ -GGATCCatggctcagaatcatgagagggtg-3 和 PybHLH-R:3’:CTCGAGgcacttaccagcaattttccaaagc,在上下游引物的5'端分別加入BamHI和XhoI酶切位點(下劃線部分為酶切位點)。以云紅梨I號總RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后使用PybHLH-F和PybHLH-R進行擴增；
基因全長片段的回收；
基因的T/A克隆和測序；
(4)/>從^7基因的生物信息學(xué)分析及GenBank登錄號的獲得；
(5)構(gòu)建原核表達載體:使用BamHI和XhoI對pMD-lST-Zy/yK"質(zhì)粒和pGEX_4T_l進行雙酶切，分別獲得5’和3’末端帶有分別帶有BamHI和XhoI酶切位點的/基因片段和PGEX-4T-1載體，瓊脂糖凝膠電泳后分別進行回收，然后在16°C連接16 h，獲得原核表達載體認^l-M-PybHLH ；
2、PybHLH基因的原核表達
使用熱刺激法將pGEX-4T-/^^yZ"質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta (DE3)中，在IPTG誘導(dǎo)下摸索最佳表達條件，在最適條件下進行大量表達；3、PybHLH蛋白純化及抗體制備
收集菌體，進行超聲破碎，過GST瓊脂糖親和層吸柱進行純化，收集純化后的蛋白，純化后的蛋白用于制備PybHLH蛋白特異性抗體、PybHLH蛋白表達檢測。本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明獲得了基因的全長序列以及重組原核表達載體pGEX-4T-/y^K仏通過
表達獲得純化蛋白，制備特異性較強的PybHLH抗體，與前期制備的抗體相比，本次發(fā)明獲得載體與抗體的優(yōu)勢更強，減少了在GST pull down和免疫共沉淀實驗中出現(xiàn)的非特異性條帶，使實驗結(jié)果更加精 確，并且得出更好的結(jié)論。本發(fā)明制備的抗體可用于檢測PybHLH蛋白，彌補了目前沒有專門檢測PybHLH蛋白、蛋白相互作用分析的缺陷，另外，本發(fā)明的抗體還含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽,該抗體還可用于GST pull down>Far Western Blot和免疫沉淀(IP)及染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)中，研究與PybHLH蛋白相互作用的蛋白質(zhì)和DNA片段，并且，該抗體含有的GST標簽，也方便了后續(xù)實驗。


圖1為本發(fā)明中云紅梨I號的總RNA電泳示意 圖2為本發(fā)明/基因的PCR結(jié)果示意圖，圖中:1是DNA MarkerIII ;2和3為PybHLH纖PCR的結(jié)果；
圖3為本發(fā)明中原核表達載體pMD18T-/y^K#的酶切結(jié)果示意圖；圖中:1是DNAMarkerIII ;2、4、6 為 pMD18T_/y^K"質(zhì)粒；3、5、7 分別為泳道 2、4、6 中 pMD18T_PybHLH質(zhì)粒的BamHI和XhoI雙酶切結(jié)果；
圖4為本發(fā)明中PybHLH蛋白在16°C、IPTG終濃度為I mM條件誘導(dǎo)下的表達情況示意圖，圖中:1是轉(zhuǎn)化PGEX-4T-1空載體的Rosetta菌體總蛋白；2_6是工程菌在16°C、IPTG終濃度為I mM條件下誘導(dǎo)0、2、4、6和8 h后的表達情況；M是蛋白質(zhì)分子量標準M0431 ;7_8是工程菌在16°C、IPTG終濃度為I mM條件下誘導(dǎo)8 h，總蛋白破碎后目的蛋白在上清和沉淀中的表達情況；
圖5為本發(fā)明中PybHLH蛋白的割膠純化示意圖，圖中:I的割膠回收后的PybHLH蛋白樣品；2是蛋白質(zhì)分子量標準M0441 ；
圖6為本發(fā)明中PybHLH蛋白的Western Blot檢測結(jié)果示意圖；圖中:1是是PybHLH蛋白，2是GST蛋白負對照；
圖7為本發(fā)明中使用PybHLH抗體檢測35S::轉(zhuǎn)基因煙草葉片PybHLH蛋白表
達結(jié)果示意圖，圖中:1，2，3，4是轉(zhuǎn)基因株系，5是野生型對照；
圖8為本發(fā)明中免疫共沉淀分析結(jié)果示意圖，圖中:1-3是免疫沉淀的PybHLH蛋白；4是用ant1-GST進行免疫沉淀的負對照；
圖9為本發(fā)明中Far Western blotting分析結(jié)果示意圖，圖中:1和3是PybHLH蛋白，2是GST為負對照；
圖10為原核表達載體pGEX-4T-/y^K"的構(gòu)建策略示意圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。實施例中使用的試劑主要為分子生物學(xué)試驗試劑:各種限制性內(nèi)切酶、Pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為寶生物工程有限公司(大連，Takara)產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄酶購于Promaga公司的，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司，大腸桿菌辦Miia (DE3)菌株和大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞為北京Transgene公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。使用的儀器為GST瓊脂糖凝膠柱子，其它儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實驗室常用儀器設(shè)備。所有引物序列合成在上海杰瑞生物科技股份有限公司進行，所有基因測序在北京六合華大基因科技股份有限公司進行。實施例1:本發(fā)明云南紅梨/基因的克隆、原核表達、純化和抗體制備，具體步驟如下:
(1)引物設(shè)計
根據(jù)蘋果MdbHLH33基因(GenBank登錄號為DQ266451.1)編碼框，設(shè)計I對特異引物PybHLH-F:5’ -GGATCCatggctcagaatcatgagagggtg-3’ 和 PybHLH-R:5，-CTCGAGgcacttaccagcaattttccaaagc-3’，在上下游引物的5'端分別加入BamHI和XhoI酶切位點(下劃線部分為酶切位點)。(2)總RNA的提取
a、用液氮將0.1 g云紅梨I號紅色果皮充分研磨成粉末以后，加入1 ml RNA提取緩沖液(4 M異硫氰酸胍，25 mM檸檬酸鈉，0.5 % (w/v)十二烷基肌氨酸鈉，2 %(w/v) PVP,β-巰基乙醇)，轉(zhuǎn)入2 ml離心管中，再研磨均勻后，再加入1/10體積2 M醋酸鈉(pH 4.2)；
b、顛倒離心管數(shù)次，混勻之后，接著加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，蓋緊離心管蓋，劇烈搖動5 min,冰上靜置15 min后，4°C離心15 min (12000 g/min)；
C、離心結(jié)束后取上清于新離心管中，加入等體積的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈搖動5min,冰上靜置 15 min 后,4 °C離心 15 min (12000 g/min)；
d、取上清，加入等體積異丙醇，在_20°C沉淀RNA30 min，再次4°C離心15 min (12 000g/min),讓RNA沉淀在管壁；
e、RNA沉淀經(jīng)75%乙醇清洗兩次后抽真空干燥，然后加入20μ l無RNase的DEPC處理水徹底溶解RNA ；
f、使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA (見圖1)。(3) RT-PCR
以云紅梨I號總RNA為模板,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,具體步驟如下:
a、在EP管中加入以下組分:總RNA2 μ g ;oligo (dT) 18 0.5 μ g ;無RNase的水補足15
μ l ;
b、70°C5 min后，迅速冰上靜置2 min ；
C、離心數(shù)秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集離心底部；
d、再向離心管中加入以下組分:5XM-MLV反應(yīng)緩沖液5 μ 1、dNTP (IOmM)U.25 μ 1RNase 抑制劑 0.5 μ 1、RTase M-MLV(200 U) 1 μ 1，無 RNase 的水補足 25 μ 1 ;e、42°C保溫60 min, -20 1:保存?zhèn)溆茫?br> 以反轉(zhuǎn)錄合成的云紅梨I號cDNA后使用PybHLH-F和PybHLH-R進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下:
反應(yīng)體系:ddH20 17.8 μ I, Taq Plus DNA Polymerase IOXBuffer 2.5 μ 1,10 mMdNTP 0.4μ 1，10μΜ 的 5’ 引物 1μ 1，10 μΜ 的 3’ 引物 I yl，cDNA 模板 2 μ 1,5 U/μ I的 Taq Plus DNA Polymerase 0.3 μ I ;反應(yīng)條件為:94 °C 2 min, (94°C 30 s’ 59°C 30s，72°C 2 min) 30 個循環(huán)，72°C 10 min (見圖 2)?；蚱蔚幕厥?對PCR產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段；使用膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書對目的片段進行回收。基因的T/A克隆和測序；將回收的PCR產(chǎn)物，按照pMD18T說明書，進行T/A克??；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α后，涂固體LB + Amp平板，挑取白色菌落，接種到液體LB + Amp培養(yǎng)基中，37°C、200 rpm搖床過夜，提取質(zhì)粒，進行酶切檢測，然后送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序?；驕y序和生物信息學(xué)分析及GenBank登錄號的獲得:PybHLH基因的讀碼框為1947 bp，該基因編碼648個氨基酸，分子量為72925.8 Da，等電點為5.5LDNAMAN比對結(jié)果表明，PybHLH與蘋果、矮牽牛、擬南芥和玉米等調(diào)控花青素生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有很高的同源性，尤其是與蘋果中的MdbHLH33在同一進化枝，故將該序列命名為PybHLH 荖里。 (7 )原核表達載體的構(gòu)建(構(gòu)建策略見圖1O ):使用BamHI和Xho I對pMD \m~PybHLH和載體pGEX-4T-l按照說明書進行雙酶切(見圖3)，分別獲得5’端帶有BamHI和3’端帶有XhoI的/基因片段和PGEX-4T-1載體，跑電泳后分別進行膠回收，按照摩爾比目的基因:載體=3:1加樣,然 后加入Ligation Solution I,16°C連接16 h ;將感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5 α 100 μ I加入6 μ I連接體系中混勻；混合液冰浴30 min, 42°C熱刺激45s后，冰浴2 1^11;加入90(^1液體培養(yǎng)基30(:，371:搖床200 rpm 60min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，常溫8000 rpm離心I min收集菌體；在超凈臺上吸去上清，剩余約0.1 ml時，使用移液槍混勻，接入帶有Amp抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒涂布均勻；37°C過夜培養(yǎng)；挑取白色菌落，接種于LB液體+ Amp的培養(yǎng)基，37°C、180 rpm培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒；進行酶切驗證后，再送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序進行測序驗證插入基因的正確性，最后獲得原核表達載體認&\-M_PybHLH。(8)PybHLH蛋白的原核表達:使用熱刺激法將重組質(zhì)粒ρ6ΕΧ_4Τ-/>/ ^7轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞中，涂LB+Amp固體平板，挑取V-M-PybHLH的重組菌落于LB + Amp液體培養(yǎng)基中37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，按1:100的比例接種于相同的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8，加IPTG至終濃度為I禮，在16°C下培養(yǎng)0、2、4、6和8 h后收集菌液用于分析總蛋白；4°C、12 000 rpm離心I min,棄上清液,沉淀用100 μ ISDS 凝膠加樣緩沖液(Tris-HCl 50 mM,pH 6.8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚藍 0.1 % ;甘油10 %)重懸，煮沸5 min后，12 000 rpm離心I min，取20 μ I上清液進行SDS-PAGE檢測。用考馬斯亮藍R-250染色液(0.1 %考馬斯亮藍R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脫色液(25 %甲醇，6 %冰乙酸)進行脫色后，使用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照；結(jié)果顯示插入有外源片段的重組質(zhì)粒pGEX-4T-PybHLH經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在預(yù)期的蛋白分子量約98.9 kD (包括載體上GST蛋白)左右有I條蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒和PGEX-4T-1對照質(zhì)粒未出現(xiàn)這條蛋白帶(見圖4),表明重組質(zhì)粒pGEX-4T_PybHLH在大腸桿菌Rosetta (DE3)中誘導(dǎo)表達了 PybHLH蛋白，超聲破碎后，SDS-PAGE檢測后，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要在包涵體表達。(9) PybHLH蛋白純化:包涵體蛋白的割膠純化，具體內(nèi)容如下:
1、重組蛋白的大量表達及包涵體的洗滌
a、最優(yōu)條件大量表達重組蛋白，超聲波破碎；
b、離心12000rpm,4°C,30分鐘，收集沉淀；
c、3M尿素洗滌沉淀，離心12000rpm，4°C，20分鐘，加入適量8M尿素冰上溶解沉淀。2、透析袋電洗脫法純化蛋白
a、透析袋的預(yù)處理:剪取適當長度(10-20cm)的透析袋(截留范圍為8 000-12 000Da);置于大體積的2 %(ff/V)碳酸氫鈉和I mM EDTA(pH8.0)中，煮沸10 min ;蒸餾水徹底清洗透析袋；置于ImM EDTA(pH8.0)溶液中再次煮沸10 min ;冷卻后4 °C保存；
b、取已溶解的蛋白沉淀，加1/5體積5X蛋白上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳；
C、電泳結(jié)束后將膠放在0.25 M預(yù)冷的KCl中，4°C浸泡5分鐘使蛋白顯白色，蒸餾水沖洗蛋白膠，用刀片從SDS-PAGE電泳凝膠上切下目的蛋白，切成I mm X I mm X I mm的碎片，放入預(yù)處理好的透析袋中，注入2 ml SDS-PAGE電泳緩沖液，將透析袋前后封口 ；
d、電泳回收:在水平核酸電泳槽中加入適量SDS-PAGE電泳緩沖液，將裝有凝膠的透析袋置入其中，100 V電壓，4 °C電泳4-5 h，直至凝膠變透明，說明目的蛋白從凝膠中洗脫出來；
e、透析:洗脫完畢，吸出透析袋內(nèi)溶液，SDS-PAGE檢測(以10μ I的BSA標準蛋白定量)電泳結(jié)果(見圖5)，鑒定后正確的蛋白溶液裝入干凈的透析袋中，用預(yù)冷的IXPBS溶液(I X PBS (IL)KCl 0.2 g、NaCl 8 g、Na2HP04 1.42 g、KH2P04 0.27 g)添加尿素8M(96 g)、6 M(72 g)、4 M(48 g)、2 M(24 g)、0 Μ于 4 °C下分別透析 3-5 h，其間換透析液2-3次；純化后的蛋白溶液送抗體制備公司制備PybHLH蛋白特異性抗體，可用于PybHLH蛋白表達水平檢測及進行免疫沉淀(IP)、Far Western blotting和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試驗。實施例2 =PybHLH蛋白特異性抗體的Western blotting和轉(zhuǎn)基因煙草的檢測 為檢測PybHLH蛋白特異性抗體的有效性，使用PybHLH蛋白抗體檢測誘導(dǎo)的PybHLH原
核表達蛋白和轉(zhuǎn)基因煙草，具體過程如下:
本實施例使用的儀器為垂直蛋白電泳儀、PVDF膜(millipore), Sem1-Dry TransferCell(BIO-RAD)轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)；
試劑為丙烯酰胺、二甲叉丙烯酰胺，10 %APS，TEMED, I X甘氨酸Buffer，I XPBS,I XPBT,脫脂奶粉，Whitman 3MM濾紙等SDS-PAGE和Western試驗試劑。、
A、PybHLH原核表達蛋白的Western blotting檢測
蛋白樣品制備:蛋白樣品和1/5體積5X蛋白上樣緩沖液(Tris-Cl (pH 6.8)250 mM,SDS 10 %，溴酚藍0.5 %，甘油50 %，β-巰基乙醇5 %)，95°C加熱5 min后置于冰上5_10min,常溫，13 000 rpm 離心 I min ；
一、SDS-PAGE
1、75 %酒精清洗玻璃膠板，組裝電泳裝置；按表I配制分離膠和濃縮膠，倒膠，小心用正丁醇或異丙醇覆蓋；
表1:分離膠和濃縮膠的配方
權(quán)利要求
1.云南紅梨/基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQID N0:3所示或編碼如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述云南紅梨基因的原核表達載體pGEX-4T-/^^yZ仏其特征在于:該載體含有/基因，上游有Ptac啟動子和細菌核糖體結(jié)合位點RBS，Ptac啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，基因的N端含有GST標簽。
3.權(quán)利要求2的所述云南紅梨基因的原核表達載體在制備云南紅梨色素合成特異性調(diào)控蛋白PybHLH中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2的所述云南紅梨PybHLH基因的原核表達載體在制備PybHLH特異性抗體中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種云南紅梨花青素生物合成、毛狀體發(fā)生發(fā)育及鹽脅迫調(diào)控蛋白PybHLH基因及其原核表達載體，本發(fā)明利用RT-PCR技術(shù)從云南紅梨云紅梨1號紅色果皮中克隆PybHLH基因，然后構(gòu)建了原核表達載體pGEX-4T-PybHLH，pGEX-4T-PybHLH載體在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進行表達PybHLH蛋白，純化后，獲得云南紅梨PybHLH純化蛋白，本發(fā)明還將PybHLH基因原核表達載體應(yīng)用在制備PybHLH特異性抗體中，獲得的PybHLH特異性抗體還用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用以及對PybHLH轉(zhuǎn)基因植物的檢測，本發(fā)明獲得的PybHLH特異性抗體中含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，獲得的PybHLH特異性抗體運用于FarWesternblotting和免疫共沉淀實驗研究蛋白質(zhì)相互作用以及準確分離獲得與PybHLH相互作用的蛋白質(zhì)和DNA片段。
文檔編號C07K16/16GK103146709SQ20131008570
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者李昆志, 崔道雷, 張曉東, 樊磊, 陳麗梅, 舒群, 蘇俊 申請人:昆明理工大學(xué)