一種三維多孔微流控芯片及其制備方法與應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種三維多孔微流控芯片及其制備方法與應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于生物、化學(xué)及材料科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種三維多孔微流控芯片及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]循環(huán)腫瘤細(xì)胞是由癌癥病灶脫落進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的早期診斷、個(gè)性化治療的評(píng)估、藥物評(píng)價(jià)以及手術(shù)預(yù)后等有重要意義。由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中數(shù)目極少，對(duì)其分離造成了極大挑戰(zhàn)。當(dāng)前亟待開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)單、高效、快速的分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的新方法。
[0004]微流控芯片是近年來(lái)發(fā)展迅速的技術(shù)，具有易集成、分析速度快、高通量、安全等優(yōu)勢(shì)，在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、腫瘤細(xì)胞的分選、基因分析、藥物合成篩選、生物試劑檢測(cè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。但是目前微流控芯片的制備大多步驟繁瑣、技術(shù)復(fù)雜、價(jià)格昂貴等，因此限制了其在生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種三維多孔微流控芯片的制備方法及通過(guò)該方法得到的三維多孔微流控芯片。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種三維多孔微流控檢測(cè)芯片的制備方法及通過(guò)該方法得到的三維多孔微流控檢測(cè)芯片。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供所述三維多孔微流控芯片或檢測(cè)芯片的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種三維多孔微流控芯片的制備方法，包括如下步驟:
(1)將泡沫金屬先后放入有機(jī)溶劑、水中分別超聲清洗1-60分鐘。
[0009](2)將清洗后的泡沫金屬浸入到液體微流控芯片材料中，在1000-8000rpm的轉(zhuǎn)速下離心使微流控芯片材料充分浸潤(rùn)泡沫金屬。
[0010](3)將浸潤(rùn)了微流控芯片材料的泡沫金屬在1000-6000rpm的轉(zhuǎn)速下離心以除去泡沫金屬孔隙中的微流控芯片材料，之后將包被了微流控芯片材料的泡沫金屬加熱使微流控芯片材料固化。
[0011](4)將步驟(3)得到的微流控芯片材料包被的泡沫金屬浸入到5-14mol/L的酸性溶液中1-12小時(shí)以除去泡沫金屬，得到三維多孔材料。
[0012](5)將三維多孔材料Plasma處理1_5分鐘后浸入到濃度為1_50%的硅烷化試劑溶液中1-10小時(shí)，得到硅烷化試劑處理的三維多孔材料。
[0013](6)將硅烷化處理的三維多孔材料浸入到濃度為1-50%的溫敏材料溶液中，使溫敏材料充分浸潤(rùn)多孔結(jié)構(gòu)，變換溫度使溫敏材料凝固，得到溫敏材料封堵的三維多孔材料。
[0014](7)將步驟(6)得到的溫敏材料封堵的三維多孔材料放在潔凈的硅片上，倒入液體微流控芯片材料使其完全浸沒(méi)三維多孔材料，放置1-24小時(shí)使微流控芯片材料充分固化。
[0015](8)將覆蓋固化微流控芯片材料的三維多孔材料的部分切下，打孔器分別在兩端打進(jìn)液口和出液口，Plasma處理1_5分鐘后與載玻片鍵合，得到溫敏材料封閉的微流控芯片。
[0016](9)改變步驟(8)得到的微流控芯片的溫度使溫敏材料溶解，通入超純水1-1000分鐘將溫敏材料沖洗干凈得到三維多孔微流控芯片。
[0017]步驟(1)中所述的泡沫金屬包括泡沫鎳、泡沫銅、泡沫招、泡沫合金等。
[0018]步驟(1)中所述的有機(jī)溶劑包括丙酮、甲苯、乙醇等。
[0019]步驟(2)中所述的微流控芯片材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、環(huán)烯烴共聚物樹(shù)脂(C0C)等。
[0020]步驟(4)中所述的酸性溶液包括硝酸、鹽酸、硫酸溶液等。
[0021]步驟(5)中所述的硅烷化試劑包括羧基乙基硅烷三醇鈉鹽、γ-氨丙基三乙氧基硅烷等可以在芯片表面衍生羧基、氨基等功能基團(tuán)的硅烷化試劑等。
[0022]步驟(6)中所述的溫敏材料包括明膠、溫敏殼聚糖等。
[0023]一種三維多孔微流控芯片，通過(guò)上述方法制備得到。所述的三維多孔微流控芯片的尺寸可調(diào)，孔徑與泡沫金屬材料的孔徑相當(dāng)。
[0024]一種三維多孔微流控檢測(cè)芯片的制備方法，包括如下步驟:將上述三維多孔微流控芯片用化學(xué)交聯(lián)劑活化后，通入1?500mg/mL的生物分子孵育0.5?10小時(shí)，再經(jīng)PBS充分洗滌后得到生物分子修飾的三維多孔微流控芯片，即三維多孔微流控檢測(cè)芯片。
[0025]所述的生物分子優(yōu)選為用于特異性識(shí)別和捕獲生物分子或細(xì)胞的蛋白或核酸，如抗體、鏈霉親和素、凝集素、生長(zhǎng)因子、核酸適配體等。
[0026]一種三維多孔微流控檢測(cè)芯片，通過(guò)上述方法制備得到。
[0027]所述的三維多孔微流控芯片或三維多孔微流控檢測(cè)芯片在生物醫(yī)學(xué)分析中的應(yīng)用，如血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞等特定細(xì)胞的分離、細(xì)胞外泌體的分離、游離RNA的分離、蛋白的分離等。
[0028]—種基于上述三維多孔微流控芯片分離血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
(1)將含1-10%牛血清白蛋白和0.1-10%表面活性劑的溶液通入特異性識(shí)別和捕獲腫瘤細(xì)胞的生物分子(如抗體或者核酸適配體等)修飾的三維多孔微流控芯片中，孵育封閉l-1000min，之后 PBS 沖洗。
[0029](2)取癌癥病人的新鮮血液Ι-lOmL，以1-200 μ L/min的流速通入步驟(1)得到的生物分子修飾的三維多孔微流控芯片中，從而血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞被所述生物分子捕獲。
[0030]步驟(1)中所述的表面活性劑包括吐溫、脫脂奶粉等。
[0031]本發(fā)明利用泡沫金屬作為犧牲模板復(fù)制出三維多孔的材料，再利用溫敏材料作為二次犧牲模板將三維多孔料整合到微流控芯片中，從而得到三維多孔微流控芯片。生物靶向分子通入交聯(lián)劑活化的三維多孔微流控芯片中固定在多孔材料表面，得到生物靶向分子功能化的三維多孔微流控檢測(cè)芯片，并將其成功用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離。
[0032]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:
本發(fā)明制備的三維多孔微流控芯片具有多孔性、高透明性、強(qiáng)韌性、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。修飾了生物分子的三維多孔微流控檢測(cè)芯片，其三維多孔結(jié)構(gòu)可以固定大量的生物分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的高效率、高通量分離。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便易行、成本低、重復(fù)性好，在一般化學(xué)及生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室均能完成。
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1是泡沫鎳的掃描電鏡圖。
[0034]圖2是由泡沫鎳復(fù)制得到的三維多孔PDMS材料的掃描電鏡圖。
[0035]圖3是FITC標(biāo)記的二抗表征抗上皮細(xì)胞粘附因子抗體修飾的三維多孔微流控檢測(cè)芯片的熒光顯微圖。
[0036]圖4是抗上皮細(xì)胞粘附因子抗體修飾的三維多孔微流控檢測(cè)芯片捕獲人乳腺癌細(xì)胞的熒光顯微圖。
[0037]圖5是血液通入到三維多孔微流控檢測(cè)芯片中的結(jié)構(gòu)圖，1-固化的PDMS，2_三維多孔材料，3-進(jìn)液口，4-出液口，5-載玻片，6-進(jìn)液管，7-出液管。
[0038]圖6是抗上皮細(xì)胞粘附因子抗體修飾的三維多孔微流控檢測(cè)芯片從癌癥病人血樣中捕獲到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞的結(jié)果圖；其中，A、B、C、D為捕獲到的癌細(xì)胞，E、F、G、Η為白細(xì)胞，A、E為DAPI染色，B、F為CK-FITC染色，C、G為⑶45-PE染色，D、Η為前述三種染色的疊加圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0040]若未特別說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)中涉及溶液的濃度均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
[0041]實(shí)施例1
(1)將泡沫鎳(0.5mmX4mmX20mm)先后用丙酮、乙醇、超純水分別超聲清洗30分鐘，之后烘箱干燥。圖1為泡沫鎳的掃描電鏡照片，顯示其三維多孔的結(jié)構(gòu)。
[0042](2)將干燥后的泡沫鎳浸入到裝滿未交聯(lián)的PDMS (聚二甲基硅氧烷)液體的2mL離心管中，8000rpm離心5分鐘使PDMS充分浸潤(rùn)泡沫鎳。
[0043](3)將步驟(2)得到的PDMS浸潤(rùn)的泡沫鎳轉(zhuǎn)移到空的2mL離心管中，3000rpm離心3分鐘以除掉泡沫鎳孔隙中的PDMS，之后80°C烘箱加熱3小時(shí)使PDMS固化。
[0044](4)將步驟(3)得到的PDMS包覆的泡沫鎳浸入到7mol/L的硝酸溶液中，刻蝕1小時(shí)以除掉鎳模板，再用超純水清洗掉殘留的硝酸溶液，得到三維多孔材料。圖2為三維多孔材料的掃描電鏡照片，顯示其完整的復(fù)制出了泡沫鎳的三維多孔結(jié)構(gòu)。
[0045](5)將得到的三維多孔材料Plasma處理3分鐘后立刻浸入到含5%羧基乙基硅烷三醇鈉鹽的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，室溫下孵育4小時(shí)，再用超純水清洗多余的羧基乙基硅烷三醇鈉鹽的磷酸鹽緩沖液，得到羧基化的三維多孔材料。
[0046](6)將羧基化的三維多孔材料浸入到15%的明膠溶液中使其完全浸沒(méi)填充孔隙，取出三維多孔材料置于35°C以下待明膠凝固，得到明膠封堵的三維多孔材料。
[0047](7)將步驟(6)得到的明膠封堵的三維多孔材料轉(zhuǎn)移至潔凈的硅片表面，加入未交聯(lián)的PDMS液體使其完全淹沒(méi)覆蓋三維多孔材料，室溫下放置12小時(shí)使PDMS充分交聯(lián)固化。
[0048](8)將覆蓋固化PDMS的三維多孔材料的部分切下，打孔器在兩端分別打進(jìn)液口和出液口，Plasma處理3分鐘后與載玻片鍵合，得到明膠封閉的微流控芯片。
[0049](9)將明膠封閉的微流控芯片加熱至50°C，以100 μ L/min的流速通入溫水(38°C左右)40分鐘充分沖洗掉殘余明膠，得到三維多孔微流控芯片。
[0050](10)將含有10mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和10mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液以50 μ L/min的流速通入三維多孔微流控芯片中活化30分鐘，之后以50 μ L/min的流速通入10 μ g/mL抗上皮細(xì)胞粘附因子抗體(eB1science