慶大霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種慶大霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慶大霉素（Gentamicin，GM)屬于氨基糖甙類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性細(xì) 菌，由于其具有廣譜抑菌和殺菌作用，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床和動(dòng)物飼料添加劑。但GM的 血清有效濃度與毒性濃度很相近，安全范圍較小，在其應(yīng)用過程中易產(chǎn)生毒副作用，尤其大 劑量不規(guī)范使用，易導(dǎo)致動(dòng)物性食品中GM殘留超標(biāo)，對人體健康構(gòu)成危害，造成腎毒性和 耳毒性。許多國家在動(dòng)物生產(chǎn)中嚴(yán)禁使用GM或規(guī)定有嚴(yán)格的最高殘留限量（MRL)，我國農(nóng) 業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定，動(dòng)物性食品中GM的MRL為100ng/g。
[0003] 目前慶大霉素殘留檢測方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜法、高效毛細(xì)管電泳法和免疫學(xué)檢測法。儀器法檢測價(jià)格昂貴，不適合在基層推廣使 用和大量篩選。免疫學(xué)測定方法靈敏度較高，特異性強(qiáng)，使用方便。因此，大規(guī)模篩選檢測 以免疫學(xué)檢測方法更實(shí)際、更具有應(yīng)用前景。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)以其靈敏度高、特異 性好、操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)適合于大量樣品的快速篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種慶大霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供的慶大霉素半抗原分子結(jié)構(gòu)式如式I所示：
[0006]
[0007]
[0008] 本發(fā)明提供的慶大霉素半抗原的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 在IOOmL兩口燒瓶中加入0.5g對溴甲基苯甲酸及1.05g慶大霉素和IOmL乙醇， 攪拌至溶解，加熱至45°C反應(yīng)6小時(shí)后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結(jié)晶得到對羧芐 基慶大霉素，得到半抗原產(chǎn)物。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述慶大霉素半抗原在免疫檢測中的應(yīng)用，具體包括由所 述慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的慶大霉素抗原，及由所得慶大霉素抗原免疫動(dòng)物 制備得到的慶大霉素抗體，所述抗體為慶大霉素單克隆抗體。
[0011] 其中所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白、鼠血 清蛋白、兔血清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。
[0012] 本發(fā)明還提供由上述慶大霉素半抗原或慶大霉素抗原在檢測慶大霉素或制備檢 測慶大霉素的產(chǎn)品中的應(yīng)用，具體涉及制備的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒在檢測動(dòng)物源性食品中 慶大霉素殘留的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供的慶大霉素半抗原、慶大霉素抗原合成方法簡單，通過免疫動(dòng)物產(chǎn)生 了針對慶大霉素的特異性抗體，抗體的效價(jià)、特異性都比較好；用所得的抗體制備酶聯(lián)免疫 檢測試劑盒，檢測成本低，使用方便，檢測方法準(zhǔn)確、快速、可同時(shí)檢測大批量的樣本，適于 動(dòng)物源性食品中慶大霉素殘留的現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。本發(fā)明的慶大霉素半抗原在 慶大霉素的檢測中發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0014] 圖1 :慶大霉素半抗原合成路線圖
[0015] 圖2 :慶大霉素半抗原核磁共振圖
[0016] 圖3 :慶大霉素 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法、材料、試劑等，如無特殊說明，均為常規(guī)方法和 常規(guī)材料。
[0019] 實(shí)施例1 :慶大霉素半抗原的合成和鑒定（合成路線如圖1)
[0020] 在IOOmL兩口燒瓶中加入0.5g對溴甲基苯甲酸及I. 05g慶大霉素和IOmL乙醇， 攪拌至溶解，加熱至45°C反應(yīng)6小時(shí)后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結(jié)晶得到對羧芐 基慶大霉素，得到半抗原產(chǎn)物。
[0021] 上述慶大霉素半抗原分子結(jié)構(gòu)式如式I所示：
[0022]
[0023] 取上述產(chǎn)物用核磁共振確定結(jié)構(gòu)，如圖2所示，11. Oppm的羧基信號(hào)峰、7. 44ppm及 8. 09ppm的芳環(huán)信號(hào)峰，說明半抗原合成成功。
[0024] 實(shí)施例2 :慶大霉素抗原的制備
[0025] 將慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到慶大霉素抗原，分子結(jié)構(gòu)式如式II所示：
[0026]
[0027]
[0028] -、免疫原制備
[0029] 取14mg慶大霉素半抗原用ImL N, N-二甲基甲酰胺（DMF)溶解，各取30mg碳化 二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)用0.2mL水充分溶解后加入上述溶液中，室 溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ;稱取牛血清白蛋白（BSA) 50mg，使之充分溶解在3. SmL PBS (pH7. 2)溶液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h ;用 0.0 lmol/L PBS溶液在4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝， 于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 二、包被原制備
[0031] 將BSA換為卵清蛋白（OVA)按上述方法制備得到包被原。
[0032] 實(shí)施例3 :慶大霉素單克隆抗體的制備
[0033] 動(dòng)物免疫：將實(shí)施例2中得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為 150 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。
[0034] 細(xì)胞融合和克隆化：小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按8:1比例與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽 性孔進(jìn)行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0035] 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇：將慶大霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成細(xì)胞懸液，在 液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入 培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0036] 單克隆抗體的生產(chǎn)與純化：將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5mL/只，7天后 腹腔注射慶大霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹 水純化，-20°C保存。該單克隆抗體特異性好，檢測靈敏度可達(dá)0. 1 μ g/L。
[0037] 單克隆抗體的特異性
[0038] 抗體特異性是指它同特異性抗原結(jié)合的能力與同該類抗原類似物結(jié)合能力的比 較，常用交叉反應(yīng)率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。交叉反應(yīng)越小，抗體的特異性則越高。
[0039] 將慶大霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素做系列稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析得到 IC50,然后桉下式計(jì)笪奪叉反應(yīng)率，結(jié)果見表1。
[0043] 實(shí)施例4 :由慶大霉素單克隆抗體制備的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒
[0044] 一、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的組成
[0045] (1)包被慶大霉素偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；
[0046] (2)酶標(biāo)二抗或酶標(biāo)二抗?jié)饪s液；
[0047] (3)抗體工作液；
[0048] (4)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：濃度分別為 0 μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 9 μ g/L、2. 7 μ g/L、 8. I μ g/L，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為lmg/L ;
[0049] (5)底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化脲，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液；
[0050] (6)終止液為2mol/L的硫酸溶液；
[0051] (7)濃縮洗滌液為含0· 5%~1. 0%的吐溫-20的0· 1~0· 2mol/L ρΗ7· 2~7. 4 的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；
[0052] (8)濃縮復(fù)溶液為ρΗ7· 2~7. 6,0· 05~0· lmol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為 重量體積百分比。
[0053] 本試劑盒的主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈 敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。
[0054] 二、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測實(shí)際樣本的應(yīng)用
[0055] (一）樣本前處理方法一
[0056] 1、組織（雞肉、雞肝）樣本前處理方法
[0057] 稱取2. 0g±0. 05g去除脂肪的組織樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加入 6mL0. lmol/L PBS溶液（稱取13. 4g十二水合磷酸氫二鈉、20.0 g氯化鈉、0· 32g氫氧化鈉、 0. 5g二水合磷酸二氫鉀、0. 5g氯化鉀加入500mL去離子水溶解混勻），混勻IOmin ;加入 60°C水浴環(huán)境中60min，取出冷卻至室溫并搖勻；3000g以上，室溫（20-25°C /68-77 °F )離 心IOmin ;移取上清液與復(fù)溶工作液（用去離子水將2 X濃縮復(fù)溶液按1:1體積比進(jìn)行稀釋 (1份2X濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4°C (39. 2 °F )環(huán)境 可保存一個(gè)月）以1:9的體積比進(jìn)行稀釋（50 μ L上清液+450 μ L復(fù)溶工作液），取50 μ L 用于分析。
[0058] 2、鮮牛奶樣本前處理方法
[0059] 取20 μ L鮮牛奶樣本至2mL聚苯乙烯離心管中，加入780 μ L復(fù)溶工作液，混勻，取 50 μ L用于分析。
[0060] 3、奶粉樣本前處理方法