一種鉻-低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及重金屬離子的免疫學檢測，具體設及一種銘-低密度脂蛋白馨合物及 其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質與脂質結合所形成的一種脂質-蛋白質復 合物，按密度分為高密度脂蛋白化i曲densitylipoprotein,簡稱皿L)、中間密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein,簡稱IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein,簡稱LDL)、極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,簡稱VLDL)、 乳糜顆粒（chylomicron,簡稱CM)。
[0003] 血液中大約百分之=十的膽固醇是通過高密度脂蛋白從組織細胞中運輸?shù)礁闻K 轉化為膽汁酸或通過膽汁排出體外的。血液中約70%的膽固醇由LDL和VLDL所攜帶，而 LDL所攜帶的膽固醇含量大于VLDL由于LDL富含膽固醇，因而被稱為"壞膽固醇"。其與多 種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，特別是冠屯、病，糖尿病等疾病，研究發(fā)現(xiàn)LDL升高是動脈粥 樣硬化發(fā)生、發(fā)展的必備條件。2014年，CE化REPORTS報道，"壞膽固醇"還可促進癌癥細 胞的發(fā)展和轉移。
[0004]LDL是動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的主要危險因素，其改變在血清蛋白中有很強的 影響動脈粥樣硬化作用，是冠狀動脈疾病的重要危險因子，與屯、血管疾病危險程度呈正相 關。因而定量檢測血清中LDL對于屯、血管疾病具有重要意義，不僅可W用于早期識別動 脈粥樣硬化的危險性，而且可W作為降脂藥物治療過程的檢測W及預后評價的指標之一。 此外，其他一些疾病，諸如：腎病綜合征、慢性腎功能衰竭、肝病及糖尿病等，也可使血清中 LDL含量上升，而定量檢測LDL也可用于該些疾病的早期診斷W及治療效果監(jiān)測，甚至作為 預后好壞的評價指標之一。而對于營養(yǎng)不良、慢性貧血、骨髓瘤、急性屯、肌梗死、創(chuàng)傷和嚴重 肝病等患者，血清LDL的含量將會下降，定量檢測LDL也可用于該些疾病的早期診斷、治療 效果監(jiān)測W及作為預后評價的指標之一。
[0005] 銘（C虹omium，化）是元素周期表VI族中的一種過渡金屬，其質地堅硬，表面具有 光澤，有較高的烙點，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重大的經(jīng)濟價值，一個世紀W來被廣泛應用，每年 全球銘生產(chǎn)量高達107噸，因而銘是一種名副其實的重要金屬污染物。目前，銘廣泛應用于 電鍛、踩革、顏料、油漆、合金、印染等各個方面，與人們的生活息息相關，但是同樣也對人 類的身體健康產(chǎn)生巨大影響。
[0006]自然界中銘主要價和六價的形式存在，而一般認為，=價銘是人類所需的微 量元素，而六價銘才是明顯的毒性物質。由于六價銘易通過細胞膜進入細胞，而且可W通過 一系列反應，產(chǎn)生強烈的細胞毒性及基因毒性，因而普遍認為六價銘的毒性高于=價銘，達 10-100倍。學者認為當水中的六價銘含量超過0.05mg/L即是有毒的。六價銘可W通過皮 膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進入人體，對于職業(yè)性暴露人群主要是 通過呼吸道吸入六價銘灰塵，而對于普通人群則是通過飲入污染水源、食入被污染的食物、 吸入等方式攝入六價銘。六價銘進入體內后，可w引發(fā)氧化應激、顯色體崎變、細胞調亡、多 種DNA損傷（包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質交聯(lián)、DNA-氨基酸交聯(lián)、化-DNA配合物形成等）， 從而造成機體多處組織、器官、系統(tǒng)損傷。
[0007] 如前所述，銘與多種蛋白質之間關系密切，可W與多種蛋白質結合，抑制多種蛋白 酶的活性。隨著對銘毒性研究的深入，人們逐漸認識到銘與蛋白的相互作用在其致毒過程 中扮演著重要的角色，被認為是了解銘的毒性機理的關鍵所在，因此，對銘和蛋白質相互作 用的研究就顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關于銘與蛋白質作用的機理僅是冰山一角，還有很多蛋 白質與銘之間的關系還不清楚，因而加強對于銘與蛋白質之間的關系至關重要。
[0008] 關于銘中毒，特別是慢性銘中毒的評價，通過檢測血銘含量也不能準確評價人體 內的循環(huán)銘含量，無法進一步評估銘對于機體功能的損傷程度，而隨著科學技術的飛速發(fā) 展，銘與人體的關系也日益緊密，因而尋找一種可W從免疫功能角度評價銘中毒，特別是慢 性銘中毒對于機體的損害程度的評價方式日益重要。

【發(fā)明內容】

[0009] 針對銘污染嚴重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種銘-低密度脂蛋白馨合物及 其制備方法，并建立銘-低密度脂蛋白馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測銘-低 密度脂蛋白馨合物在評價一個地區(qū)銘污染程度的應用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中 銘-低密度脂蛋白馨合物，可W間接反映該個地區(qū)人群受銘污染的情況，從而間接反映該 個地區(qū)銘污染程度。
[0010] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是；提供一種銘-低密度脂蛋白馨合 物，該銘-低密度脂蛋白馨合物是銘離子與低密度脂蛋白馨合物通過琉基或/和半脫氨酸 殘基馨合而成。
[0011] 本發(fā)明還提供一種上述的銘-低密度脂蛋白馨合物的制備方法，即體外合成法， 包括W下步驟：
[0012]A)銘-低密度脂蛋白馨合物的合成；在提純源于人體的低密度脂蛋白或按照生物 學方法重組的低密度脂蛋白中加入銘離子進行馨合反應，反應溶液；
[0013] B)銘-低密度脂蛋白馨合物純化；采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應溶液中 未反應的低密度脂蛋白、特異性抗體和銘離子，即得銘-低密度脂蛋白馨合物。
[0014] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括W下步驟：
[0015] (1)溶解樣品；將上述步驟A)的銘-低密度脂蛋白馨合物溶解于生理鹽水中，得 銘-低密度脂蛋白馨合物的溶液；
[0016] (2)平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與低密 度脂蛋白特異性結合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0017]所述能與低密度脂蛋白特異性結合的填料為吸附有可與低密度脂蛋白特異性結 合物質的硅膠或樹脂；
[001引 做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白與填料特異性結合；
[0019] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2冊〇4溶液進行洗脫；
[0020] (5)收集；收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復原；
[0021] (6)透析；將步驟巧）的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次后，4°C透 析過夜，收集樣本；
[0022] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與銘特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0023] 所述能與銘特異性結合的填料為吸附有可與銘特異性結合物質的硅膠或樹脂；
[0024] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[00巧](9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2冊〇4溶液進行洗脫；
[0026] (10)收集；收集步驟巧）的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復原；
[0027] (11)透析；將步驟（10)的洗脫液，裝透析袋，用dd&O透析除鹽，換水立次后，4°C 透析過夜，收集樣本，即得銘-低密度脂蛋白馨合物。
[002引作為優(yōu)選，上述銘-低密度脂蛋白馨合物的制備方法，還包括W下對銘-低密度脂 蛋白馨合物的鑒定步驟，具體包括W下步驟：
[0029] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質制備膠床；
[0030] 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的銘-低密度脂蛋白馨合物，加入上樣緩沖 液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[00引]做電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0032] (4)檢測；在膠床上找出含銘的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS檢測是否含有銘W及檢測銘的含量。
[0033] 本發(fā)明還提供一種如上述的銘-低密度脂蛋白馨合物在制備檢測人體內銘-低密 度脂蛋白馨合物的試劑或試劑盒中的應用。
[0034] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的銘-低密度脂蛋白馨合物作為標準品的試 劑盒。
[00巧]優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲低密度脂蛋白的蛋白或捕 獲金屬銘的物質。
[0036] 本發(fā)明還提供一種定量檢測銘-低密度脂蛋白馨合物的方法，W已知含量的上述 的銘-低密度脂蛋白馨合物作為標準品，采用W下方法之一對樣品進行檢測；酶聯(lián)免疫法、 酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質譜結合法、提純銘-低 密度脂蛋白馨合物與酶聯(lián)免疫結合法、提純銘-低密度脂蛋白馨合物與原子吸收光譜結合 法、提純銘-低密度脂蛋白馨合物與電感禪合等離子體質譜結合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原 子吸收光譜或電感禪合等離子體質譜結合法。
[0037] 相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：
[003引1.本發(fā)明首次合成了銘-低密度脂蛋白馨合物；
[0039] 2.本發(fā)明首次提出銘-低密度脂蛋白馨合物可用于制備檢測血樣中銘-低密度脂 蛋白馨合物的試劑或試劑盒中的應用；
[0040] 3.本發(fā)明實現(xiàn)了馨合型低密度脂蛋白的特異性識別和定量檢測，W便定量檢測人 群血清中銘-低密度脂蛋白馨合物的含量，W評價一個地區(qū)銘污染程度的應用，為工業(yè)地 區(qū)的銘污染水平提供間接指標。本發(fā)明建立的銘-低密度脂蛋白馨合物定量檢測方法的準 確度高、重復性好。
【附圖說明】
[0041]圖1為本發(fā)明所述的銘-低密度脂蛋白馨合物的非變性電泳條帶圖；
[0042]圖2為本發(fā)明所述的銘-低密度脂蛋白馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分 析圖。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0044] 本發(fā)明除特別說明外，設及的實驗操作步驟均為本領域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說明，均視為可從市購方式購得：
[0045] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0046] 捕獲低密度脂蛋白的蛋白為抗低密度脂蛋白抗體，可通過市售獲得，如貨號為 "Abeamabl57795"的anti-LDL抗體，W下實施方式中，所述與低密度脂蛋白特異性結合的 物質、抗低密度脂蛋白抗體、抗LDL抗體均為捕獲低密度脂蛋白的蛋白；
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