一種鉛-白蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，設(shè)及一種鉛-白蛋白馨合物及其制備方法和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清白蛋白化SA)是哺乳動(dòng)物血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，它能夠儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)眾 多的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，該與它特異性結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。血清白蛋白是由肝臟合成的一種 簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)，僅由氨基酸組成，沒(méi)有修飾基團(tuán)和其他附屬物。根據(jù)數(shù)據(jù)資料顯示，牛血清白 蛋白炬SA)分子由583個(gè)氨基酸殘基組成。而人血清白蛋白化SA)比BSA多2個(gè)氨基酸， 良P585個(gè)氨基酸殘基組成。兩者的差異在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的殘 基。白蛋白氨基酸成分最顯著的特征是低含量的色氨酸，HSA和BSA每分子中分別含有1或 2個(gè)殘基。苯丙氨酸和異亮氨酸含量也比較低。半脫氨酸、亮氨酸、谷氨酸和賴氨酸含量都 非常高。大量的離子化殘基提供了白蛋白非常高的電荷，在PH7的條件下，每分子白蛋白帶 有185個(gè)離子，該樣就形成白蛋白易溶性。
[0003] 白蛋白最獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是二硫鍵模式。BSA序列包含35個(gè)半脫氨酸殘基，形成 17個(gè)二硫橋，相鄰的半脫氨酸對(duì)與鏈上最近的殘基連結(jié)，形成10-47個(gè)殘基長(zhǎng)度的一對(duì)環(huán)。 S-S鍵交迭增加了白蛋白結(jié)構(gòu)的剛性和穩(wěn)定性。
[0004] 白蛋白的S級(jí)結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是一種高度螺旋的分子，通過(guò)X射線衍射得知HPB晶體 中大約67%的殘基參與形成了 28個(gè)a-螺旋體，10%殘基參與形成P轉(zhuǎn)角，23%殘基形 成伸展鏈。
[0005] 生理機(jī)制上，白蛋白維持人體血漿膠體滲透壓的80%。另外，白蛋白也是血液中各 種大分子物質(zhì)的主要載體，在代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)、生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要作用。它同時(shí)也是調(diào)節(jié)凝 血功能和炎性反應(yīng)的組分。人血清白蛋白主要應(yīng)用于臨床、新陳代謝和遺傳方面的研究。
[0006] 鉛（Pb)是一種常見(jiàn)的有毒金屬及環(huán)境污染物，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中，包括 冶煉鍛造、鉛電池生產(chǎn)、汽油添加劑的生產(chǎn)過(guò)濾中等，與人們生活息息相關(guān)。對(duì)于普通人群， 主要是通過(guò)吸入鉛污染的空氣，或飲用W鉛壺或鉛錫壺盛裝的酒，甚至使用或?yàn)E用含鉛的 藥物治療慢性疾病而攝入鉛。越來(lái)越多的研究證明鉛可W對(duì)機(jī)體造成急性、慢性損傷，甚至 導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。美國(guó)毒物與疾病登記署公布研究表明，鉛是一種全身性毒物，可W影響神 經(jīng)、造血、內(nèi)分泌、免疫、生殖、肝臟、腎臟等組織器官，國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)（IARC)也將鉛及 其化合物列為第2B類人致癌物?？梢?jiàn)鉛對(duì)機(jī)體的影響及其重要，不可忽視。
[0007] 鉛與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密化可W與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對(duì)鉛毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到鉛與蛋白的相互作用在其致毒過(guò)程中扮演著重 要的角色，被認(rèn)為是了解鉛的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對(duì)鉛和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于鉛與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與鉛之 間的關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)對(duì)于鉛與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引針對(duì)鉛污染嚴(yán)重的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉛-白蛋白馨合物及其制備 方法，并建立鉛-白蛋白馨合物的定性、定量檢測(cè)方法，W便定量檢測(cè)鉛-白蛋白馨合物在 評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉛污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鉛-白蛋白馨合物可 W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受鉛污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū)鉛污染程度。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是；提供一種鉛-白蛋白馨合物，鉛離 子與白蛋白通過(guò)琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0010] 本發(fā)明還提供一種上述的鉛-白蛋白馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0011] A)鉛與白蛋白的馨合反應(yīng)：在提純?cè)从谌梭w的白蛋白或按照生物學(xué)方法重組的 白蛋白中加入鉛離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0012] B)純化鉛-白蛋白馨合物的提??；采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng) 的白蛋白W及多余的鉛離子，即得鉛-白蛋白馨合物。
[0013] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0014] (1)溶解樣品；向經(jīng)過(guò)步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使鉛-白蛋白馨合 物復(fù)溶；
[0015] (2)平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與白蛋 白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0016] (3)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，白蛋白 與填料特異性結(jié)合；
[0017] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I;
[001引 妨收集：收集洗脫液I;
[0019] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本；
[0020] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉛特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[002U做上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟做中樣本，然后上柱；
[0022] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II;
[002引 （10)收集；收集洗脫液II;
[0024] (11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本，即得鉛-白蛋白馨合物。
[0025] 其中，上述鉛-白蛋白馨合物的制備方法，還包括步驟C);對(duì)鉛-白蛋白馨合物的 鑒定；
[0026] 其中，步驟C)中具體如下；
[0027](1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[002引 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的鉛-白蛋白馨合物，加入稀釋緩沖液，并混 勻，然后加樣于樣品槽中；
[0029]做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0030] (4)檢測(cè)；在膠床上找出含鉛的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測(cè)是否含有鉛W及檢測(cè)鉛的含量。
[0031] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉛-白蛋白馨合物在制備檢測(cè)人體內(nèi)鉛-白蛋白馨合 物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉛-白蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。
[0033] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲白蛋白的物質(zhì)或捕獲鉛的 物質(zhì)。
[0034] 本發(fā)明還提供一種定量檢測(cè)鉛-白蛋白馨合物的方法，W已知含量的上述的 鉛-白蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫 與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鉛-白蛋白馨合 物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鉛-白蛋白馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鉛-白蛋白馨合 物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法。
[0035] 實(shí)施本發(fā)明的鉛-白蛋白馨合物及其制備方法和應(yīng)用，具有W下有益效果：
[0036] 1.本發(fā)明首次體外合成鉛-白蛋白馨合物；
[0037] 2.本發(fā)明首次提出鉛-白蛋白馨合物可用于制備檢測(cè)血樣中鉛-白蛋白馨合物的 試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[003引 3.本發(fā)明建立了鉛-白蛋白馨合物的定性定量檢測(cè)方法，W便定量檢測(cè)鉛-白蛋 白馨合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉛污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鉛-白 蛋白馨合物可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受鉛污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū)鉛污染程 度。本發(fā)明建立的鉛-白蛋白馨合物定量檢測(cè)方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測(cè)的重復(fù) 性得到大大提高。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為本發(fā)明所述的鉛-白蛋白馨合物的電泳條帶圖；
[0040] 圖2為本發(fā)明所述的鉛-白蛋白馨合物的電泳條的巧光分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0042] 本發(fā)明除特別說(shuō)明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒(méi)有列舉出來(lái)的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可W通過(guò)市購(gòu)方式 獲得：
[0043] 磯酸鹽溶液為0. 05-0.Imol/L化2冊(cè)〇4溶液或0. 5-lmol/L化2冊(cè)〇4溶液；
[0044] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0045] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0046] 捕獲白蛋白的物質(zhì)為Abeam公司生產(chǎn)的型號(hào)為油106349的Anti-人類Serum A化umin抗體；其中，本發(fā)明所述與白蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗HSA抗體、抗白蛋白抗體均 為捕獲白蛋白的物質(zhì)；
[0047] 捕獲鉛的物質(zhì)購(gòu)買自己傲得生物科技有限公司的型號(hào)為AP7019的鼠抗PbmAb; 其中，本發(fā)明所述與鉛特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗Pb抗體、抗鉛抗體、鉛抗均為捕獲鉛的物質(zhì)； [004引酶標(biāo)抗體為含有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0049] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[00加]洗漆液為含有KH2PO4O. 2mg/ml、化2冊(cè)〇4?1甜2〇 2.9〇mg/ml、化CIS.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑為 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[0051] 封閉液為1% -5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[005引 稀釋緩沖液為含1. 5mg/mL化20)3、2. 93mg/mlNaHC03的PH為9.6的0. 05M碳酸 鹽緩沖液；
[0化3] 酶標(biāo)抗體為HRP酶標(biāo)抗體；
[0054] 終止液為：將21. 7ml的2