一種鎳-低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重金屬離子的免疫學(xué)檢測，具體涉及一種鎳-低密度脂蛋白螯合物及 其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合所形成的一種脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù) 合物，按密度分為高密度脂蛋白（high density lipoprotein，簡稱HDL)、中間密度脂 蛋白（intermediate density lipoprotein，簡稱 IDL)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，簡稱 LDL)、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,簡稱 VLDL)、 乳糜顆粒（chylomicron，簡稱CM) 〇
[0003] 血液中大約百分之三十的膽固醇是通過高密度脂蛋白從組織細(xì)胞中運(yùn)輸?shù)礁闻K 轉(zhuǎn)化為膽汁酸或通過膽汁排出體外的。血液中約70%的膽固醇由LDL和VLDL所攜帶，而 LDL所攜帶的膽固醇含量大于VLDL，由于LDL富含膽固醇，因而被稱為"壞膽固醇"。其與多 種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，特別是冠心病，糖尿病等疾病，研究發(fā)現(xiàn)LDL升高是動脈粥 樣硬化發(fā)生、發(fā)展的必備條件。2014年，CELL REPORTS報道，"壞膽固醇"還可促進(jìn)癌癥細(xì) 胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。
[0004] LDL是動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的主要危險因素，其改變在血清蛋白中有很強(qiáng)的 影響動脈粥樣硬化作用，是冠狀動脈疾病的重要危險因子，與心血管疾病危險程度呈正相 關(guān)。因而定量檢測血清中LDL對于心血管疾病具有重要意義，不僅可以用于早期識別動 脈粥樣硬化的危險性，而且可以作為降脂藥物治療過程的檢測以及預(yù)后評價的指標(biāo)之一。 此外，其他一些疾病，諸如：腎病綜合征、慢性腎功能衰竭、肝病及糖尿病等，也可使血清中 LDL含量上升，而定量檢測LDL也可用于這些疾病的早期診斷以及治療效果監(jiān)測，甚至作為 預(yù)后好壞的評價指標(biāo)之一。而對于營養(yǎng)不良、慢性貧血、骨髓瘤、急性心肌梗死、創(chuàng)傷和嚴(yán)重 肝病等患者，血清LDL的含量將會下降，定量檢測LDL也可用于這些疾病的早期診斷、治療 效果監(jiān)測以及作為預(yù)后評價的指標(biāo)之一。
[0005] 鎳（Nickel，Ni)與人體的健康息息相關(guān)，首先其是人體維持健康所必需的微量元 素，其存在于多種氫化酶中，催化氫的氧化還原反應(yīng)，參與多種酶蛋白的合成和細(xì)胞激素及 色素的代謝，具有促進(jìn)鐵的吸收和紅細(xì)胞的增長、激活酶形成輔酶、增強(qiáng)胰島素、降血糖、保 護(hù)心血管等作用，因此如果人體缺乏鎳，會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。但是，事實(shí)在生活中，由于環(huán)境 污染，人體內(nèi)很少缺乏鎳，相反鎳的含量常常過量，常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至危及生命。
[0006] 然鎳螯合于低密度脂蛋白上的機(jī)制尚不清楚，兩者之間的相互作用及對機(jī)體的影 響也尚待研究。但是可以明確的，低密度脂蛋白和鎳對于機(jī)體的作用都至關(guān)重要，而定量檢 測低密度脂蛋白上螯合鎳是研究兩者相互關(guān)系的第一步，其具有重要科研及臨床價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對鎳污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鎳-低密度脂蛋白螯合物及 其制備方法，并建立鎳-低密度脂蛋白螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測鎳-低 密度脂蛋白螯合物在評價一個地區(qū)鎳污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中 鎳-低密度脂蛋白螯合物，可以間接反映這個地區(qū)人群受鎳污染的情況，從而間接反映這 個地區(qū)鎳污染程度。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鎳-低密度脂蛋白螯合 物，該鎳-低密度脂蛋白螯合物是鎳離子與低密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯 合而成。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的鎳-低密度脂蛋白螯合物的制備方法，即體外合成法， 包括以下步驟：
[0010] A)鎳-低密度脂蛋白螯合物的合成：在提純源于人體的低密度脂蛋白或按照生物 學(xué)方法重組的低密度脂蛋白中加入鎳離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0011] B)鎳-低密度脂蛋白螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中 未反應(yīng)的低密度脂蛋白、特異性抗體和鎳離子，即得鎳-低密度脂蛋白螯合物。
[0012] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括以下步驟：
[0013] (1)溶解樣品：將上述步驟A)的鎳-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水中，得 鎳-低密度脂蛋白螯合物溶液；
[0014] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與低密 度脂蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0015] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白與填料特異性結(jié)合；
[0016] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. 10m〇l/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0017] (5)收集：收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0018] (6)透析：將步驟（5)的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三次后，4°C透 析過夜，收集樣本；
[0019] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鎳特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0020] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱；
[0021] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0022] (10)收集：收集步驟（9)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0023] (11)透析：將步驟（10)的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三次后，4°C 透析過夜，收集樣本，即得鎳-低密度脂蛋白螯合物。
[0024] 作為優(yōu)選，上述鎳-低密度脂蛋白螯合物的制備方法，還包括以下對鎳-低密度脂 蛋白螯合物的鑒定步驟，具體包括以下步驟：
[0025] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0026] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎳_低密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩沖 液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0027] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0028] (4)檢測：在膠床上找出含有鎳的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS檢測是否含有鎳以及檢測鎳的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的鎳-低密度脂蛋白螯合物在制備檢測人體內(nèi)鎳-低密 度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鎳-低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試 劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲低密度脂蛋白的蛋白或捕 獲金屬鎳的物質(zhì)。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鎳-低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述 的鎳-低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免疫法、 酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鎳-低 密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鎳-低密度脂蛋白螯合物與原子吸收光譜結(jié)合 法、提純鎳-低密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原 子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0033] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0034] 1.本發(fā)明首次合成了鎳-低密度脂蛋白螯合物；
[0035] 2.本發(fā)明首次提出鎳-低密度脂蛋白螯合物可用于制備檢測血樣中鎳-低密度脂 蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用；
[0036] 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了螯合型低密度脂蛋白的特異性識別和定量檢測，以便定量檢測人 群血清中鎳-低密度脂蛋白螯合物的含量，以評價一個地區(qū)鎳污染程度的應(yīng)用，為工業(yè)地 區(qū)的鎳污染水平提供間接指標(biāo)。本發(fā)明建立的鎳-低密度脂蛋白螯合物定量檢測方法的 準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明所述的鎳-低密度脂蛋白螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明所述的鎳-低密度脂蛋白螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光分 析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0040] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實(shí)驗操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說明，均視為可從市購方式購得：
[0041] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0042] 捕獲低密度脂蛋白的蛋白為抗低密度脂蛋白抗體，可通過市售獲得，如貨號為 "Abeam abl57795"的anti-LDL抗體，以下實(shí)施方式中，所述與低密度脂蛋白特異性結(jié)合的 物質(zhì)、抗低密度脂蛋白抗體、抗LDL抗體均為捕獲低密度脂蛋白的蛋白；
[0043] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0044] 稀釋緩沖液為pH 9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，配制方法示例：取1. 5g的似20)3和 2. 93g 的 NaHC03溶解加 ddH20 定容至 1000mL ;
[0045] 洗滌緩沖液為pH7. 4的0. 15M PBS溶液，配制方法示例：取0. 2g的KH2P04 2 . 90g 的 Na2HP04 ? 12H20、8. 0g 的 NaCl、0. 2g 的 KC1、0. 5mLTween-20,溶解加 ddH20 定容至 1000mL ;
[0046] 封閉液為牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0. lg牛血清白蛋白，加入洗滌緩 沖液稀釋定容至l〇〇mL ;
[0047] 終止液為2M H2S04，配制方法示例：取178. 3mL的ddH20,加濃H2S04定容至200mL ;
[0048] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液，配制方法示例：取0. 5mL濃度為2g/L的甲基聯(lián)苯 胺乙醇溶液，加底物稀釋液稀釋至10mL ;
[0049]底物緩沖液pH為5. 0，其中Na2HP04的摩爾濃度為0. 2M、檸檬酸的摩爾濃度為 0. 1M，配制方法示例：取