一種聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化熒光素酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化熒光素酶的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶的固定化（Immobilization of enzymes)是用固體材料將酶束縛或限制于一定 區(qū)域內(nèi)，仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)利用的一類技術(shù)。與游離酶相比， 固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，又克服了游離酶的不足之 處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等一系 列優(yōu)點(diǎn)。固定化酶不僅在化學(xué)、生物學(xué)及生物工程、醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的研宄異常 活躍，得到迅速發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，而且因?yàn)榫哂泄?jié)省資源與能源、減少或防治污染的生 態(tài)環(huán)境效應(yīng)而符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求。
[0003] 固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占 絕大多數(shù)，它和線條這兩種形式主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反 應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)；薄膜主要用于酶電極，應(yīng)用于分析化學(xué)中；酶管機(jī)械強(qiáng)度較大， 宜用于工業(yè)生產(chǎn)。
[0004] 磁性高分子微球是一類性能優(yōu)良的功能高分子材料，是以合成高分子或生物高分 子為載體，通過吸附和包埋Fe2OyFe3O4或其它磁性粒子，形成具有磁性的功能高分子材料。 磁性高分子微球是核殼式結(jié)構(gòu)的微小膠囊，制備磁性微球的磁核主要是Fe3O4等金屬氧化 物，殼層主要由兩類物質(zhì)組成：一類是合成高分子，主要有聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酞胺、 聚乙烯醇、硝化纖維及聚乙烯醉縮丁醛等，不可生物降解；另一類是生物高分子，主要有淀 粉、明膠、白蛋白、聚乳酸、藻酸鈣等，可生物降解。磁性高分子微球的殼層與磁核的結(jié)合主 要是通過范德華力、氫鍵、配位鍵的作用，高分子借助于這些作用力，牢牢地束縛于金屬氧 化物晶體表面，形成堅(jiān)實(shí)的球狀結(jié)構(gòu)，作為固定化酶載體的順磁性高分子微球。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種聚甲基丙烯酸甲酯微球固定化熒光素酶的制備方法，包 括以下步驟： (一）制備四氧化三鐵磁性微球： (1) 將水合物FeSO4 · 7H20和Fe2 (SO4) 3 · 9H20加入反應(yīng)介質(zhì)中，通入氮?dú)?，攪拌至均?體系； (2) 升溫至85°C，加入3mol KOH進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)120分鐘以上，然后降至室溫； (3) 將反應(yīng)得到的Fe3O4以去離子水沖洗10遍以上，然后將其分散于有機(jī)載體中，形成 磁流體； (4) 將步驟（3)得到的磁流體、甲基丙烯酸甲酯、表面活性劑、二乙烯基苯、正己烷、聚乙 烯醇、過氧化苯乙酰和去離子水加入反應(yīng)釜中，在恒溫下不斷攪拌形成乳液； (5) 加入引發(fā)劑反應(yīng)，時(shí)間為200分鐘以上； (6) 熟化； (7) 使用磁力架進(jìn)行磁性分離； (8) 冷卻，篩選，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍以上，得到聚甲基丙烯酸甲酯微 球； (二）焚光素酶的固定： (1) 將熒光素酶加入緩沖液中，使熒光素酶的終濃度為I. 5-3g/L，浸泡1小時(shí)以上； (2) 加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，攪拌； (3) 按體積比加入 0· 1-0. 2%tween80、0. 1-0. 2%tween20、TritonX-IOO 0· 1-0. 2% 和 5-7%固化劑（N-羥基硫代琥珀酰亞胺)，持續(xù)攪拌，固化200分鐘以上； (4) 使用磁力架進(jìn)行磁性分離，倒掉上層清液； (5) 使用緩沖液沖洗； (6) 真空干燥。
[0006] 所述有機(jī)載體為正己烷和異丙醇的混合物，其中正己烷和異丙醇的體積比為2:3。
[0007] 所述表面活性劑為CTAB和苯扎溴銨。
[0008] 所述熟化的溫度為75_80°C，時(shí)間為3小時(shí)以上。
[0009] 所述引發(fā)劑為過硫酸鉀，加入0· 25%〇。
[0010] 步驟(二）（1)中使用磷酸鹽緩沖液，步驟(二）（5)中使用h印es緩沖液沖洗10遍 以上。
[0011] 步驟(二）在溫度4-20°C環(huán)境中進(jìn)行。
[0012] 在步驟(二）過程中加入0· 05-0. 1%的BSA。
[0013] 所述真空干燥時(shí)壓力為30_50Pa。
[0014] 所述固化劑為三聚磷酸鈉、戊二醛和sulfo-NHS ( N-羥基硫代琥珀酰亞胺）中的 一種或幾種。優(yōu)選為2%三聚磷酸鈉和4. 5%sulfo-NHS。
[0015] 本發(fā)明制備的微球生物相容性好，非常適于基因測(cè)序的過程中用于酶的固定。本 發(fā)明的制備方法中的步驟易于操作，原料成本低，能夠適應(yīng)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。以本發(fā)明制 備的微球粒徑較小而均一，能夠順利的進(jìn)行核酸測(cè)序反應(yīng)酶的固定，得到的微球質(zhì)地均勻， 有較好的理化穩(wěn)定性，磁響應(yīng)性高，還可應(yīng)用于生物工程中大分子的連接與分離。聚甲基丙 烯酸甲酯微球透光率大，便于測(cè)序儀的信號(hào)讀取，使噪點(diǎn)更清晰、測(cè)算更精確。經(jīng)過本發(fā)明 的方法處理后，熒光素酶性質(zhì)非常穩(wěn)定，效率提高，催化反應(yīng)過程容易控制，機(jī)械強(qiáng)度高，可 重復(fù)使用，適合應(yīng)用于高通量的基因組測(cè)序過程中。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1 (一）制備四氧化三鐵磁性微球： (1) 將水合物 FeSO4 ·7Η20 0· Imol 和 Fe2(SO4)3 ·9Η20 0· 3mol 加入 IL 去離子水和乙二 醇的混合液中，通入氮?dú)?，攪拌至均相體系； (2) 升溫至 92°C，加入 3mol K0H，0.03mol Fe(0H)2,0.09mol Fe(OH)3,反應(yīng) 120 分鐘， 然后降至室溫； (3) 將反應(yīng)得到的Fe3O4以去離子水沖洗10遍，然后將其分散于正己烷和異丙醇中，其 中正己烷和異丙醇的體積比為2:3,形成磁流體； (4) 將步驟（3)得到的磁流體、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴銨、二乙烯基苯、正己烷、 聚乙烯醇、過氧化苯乙酰和去離子水加入反應(yīng)釜中，在恒溫下不斷攪拌形成乳液； (5) 按體積比加入占乳液體系重量比0. 25%。的過硫酸鉀，時(shí)間為230分鐘； (6) 熟化，75°C，時(shí)間為3小時(shí)； (7) 使用磁力架進(jìn)行磁性分離； (8) 冷卻，篩選，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗6遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球； (二）熒光素酶的固定，于12_18°C環(huán)境中： (1) 將熒光素酶加入磷酸鹽緩沖液中，使熒光素酶的終濃度為2. 5g/L，再加入0. 08%的 BSA，浸泡1小時(shí)； (2) 加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，攪拌； (3) 加入0.15〇/此￥661180、0.159^￥661120、0.2%1'1^〇1^-100、2%三聚磷酸鈉和 4. 5%sulf〇-NHS，持續(xù)攪拌，固化220分鐘； (4) 使用磁力架進(jìn)行磁性分離，倒掉上層清液； (5) 使用hepes緩沖液沖洗10遍； (6) 真空干燥壓力為40Pa。
[0017] 實(shí)施例2 (一） 制備四氧化三鐵磁性微球： (1) 將水合物 FeSO4 · 7H20 0· 22mol 和 Fe2 (SO4) 3 · 9H20 0· 3mol 加入 IL 去離子水，乙醇 和乙二醇的混合液中，通入氮?dú)?，攪拌至均相體系； (2) 升溫至90°C，加入堿溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)130分鐘，然后降至室溫； (3) 將反應(yīng)得到的Fe3O4以去離子水沖洗10遍以上，然后將其分散于正己烷和異丙醇 中，其中正己烷和異丙醇的體積比為2:3,形成磁流體； (4) 將步驟（3)得到的磁流體、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴銨、二乙烯基苯、正己烷、 聚乙烯醇、過氧化苯乙酰和去離子水加入反應(yīng)釜中，在恒溫下不斷攪拌形成乳液； (5) 加入占乳液體系重量比0. 25%。的過硫酸鉀，時(shí)間為210分鐘； (6) 熟化，80°C，時(shí)間為3. 5小時(shí)； (7) 使用磁力架進(jìn)行磁性分離； (8) 冷卻，篩選，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球； (二） 熒光素酶的固定，于8-12°C環(huán)境中： (1) 將熒光素酶加入磷酸鹽緩沖液中，使熒光素酶的終濃度為3g/L，再加入0. 1%的 BSA，浸泡1小時(shí)； (2) 加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，攪拌； (3) 按體積比加入 0· l%tween80、0. 2%tween20、0. 1% TritonX-IOO 和 5%sulf〇-NHS，持 續(xù)攪拌，固化200分鐘； (4) 使用磁力架進(jìn)行磁性分離，倒掉上層清液； (5) 使用h印es緩沖液沖洗15遍； (6) 真空干燥壓力為50Pa。
[0018] 實(shí)施例3 (一） 制備四氧化三鐵磁性微球： (1) 將水合物 FeSO4 · 7H20 0· 15mol 和 Fe2 (SO4) 3 · 9H20 0· 35mol 加入 IL 去離子水，乙 醇和乙二醇的混合液中，通入氮?dú)?，攪拌至均相體系； (2)