抗原結(jié)合單元穩(wěn)定的嵌合抗原受體及制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及含有高穩(wěn)定性的抗原結(jié)合單元的嵌合抗原受體，及其制備方法，含有 所述人工嵌合抗原受體的細(xì)胞，W及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 過(guò)繼免疫治療采用的是未經(jīng)基因修改的T細(xì)胞，并且已經(jīng)在治療某些癌癥W及病 毒感染上展示其潛在的能力。例如通過(guò)供體淋己輸入值LI)引發(fā)的移植物抗白血病效應(yīng) (GVL)用于復(fù)發(fā)性白血病的治療W及通過(guò)注射體外擴(kuò)增的腫瘤浸潤(rùn)性淋己細(xì)胞（TIL)結(jié)合 治療前淋己細(xì)胞消除用于治療晚期黑色素瘤。然后無(wú)論是DLI還是TIL治療都具有嚴(yán)重的 副作用W及沒(méi)有特異性而限制了其功效?，F(xiàn)今已經(jīng)嘗試發(fā)現(xiàn)有效的免疫原性抗原用于對(duì)效 應(yīng)T細(xì)胞的修改，其可W有選擇性的針對(duì)白血病或者其他腫瘤。
[0003] T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療是指將自體或者異體腫瘤激活的T細(xì)胞進(jìn)行體外分離并且 擴(kuò)增用于治療腫瘤病人。它對(duì)于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤具有卓越的成效，并且該反應(yīng)W及在 50%的病人身上得到了客觀的驗(yàn)證。
[0004] 含有腫瘤特異性受體的腫瘤浸潤(rùn)淋己細(xì)胞是來(lái)源于一些腫瘤病人的，而過(guò)繼T細(xì) 胞治療則通過(guò)引入循環(huán)淋己細(xì)胞抗原而得到發(fā)展。為了做到該一天，基因編碼的T細(xì)胞受 體可W來(lái)源于活動(dòng)性高，腫瘤特異性T細(xì)胞或者來(lái)源于嵌合型抗原受體，它們包含了類似 于抗體的外部結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞信號(hào)域，例如CD3C，而該些可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒W(wǎng)及慢病 毒進(jìn)行引入。因?yàn)榍逗闲涂乖荏wT細(xì)胞其對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊是不受MHC限制的，因此他 擴(kuò)大了T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的應(yīng)用。目前，多種CART相關(guān)的，用于淋己瘤，慢性淋己細(xì)胞白 血病，黑色素瘤W及成神經(jīng)細(xì)胞瘤的臨床治療研究正在進(jìn)行中。
[0005]B細(xì)胞淋己瘤患者是一個(gè)很大的群體，其中慢性淋己細(xì)胞白血病患者會(huì)死 于該個(gè)疾病。而其中一個(gè)能夠治療該些病人的方法就是通過(guò)基因改造將能夠針對(duì) 腫瘤細(xì)胞上特異性表達(dá)的抗原的嵌合型抗原受體表達(dá)在T細(xì)胞上。嵌合型抗原受 體（CAR)是一種設(shè)計(jì)出來(lái)不依賴于人類白細(xì)胞抗原并且可識(shí)別細(xì)胞膜表面抗原的 抗原受體。人們正在嘗試?yán)迷摲N表達(dá)CAR的基因改造的T細(xì)胞用于治療一些類 型的病人炬rentjensetal., 2010,Molecular"Therapy, 18:4, 666-668;Morganet al. , 2010,MolecularTherapy,publishedonlineFeb.23, 2010,pages1-9 ;and,Tillet al.，2008,Blood, 112:2261-2271)。
[0006] 在許多腫瘤中，腫瘤特異性抗原并沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，但在B細(xì)胞淋己瘤中，CD19是 一個(gè)非常有潛力的腫瘤抗原。CD19僅表達(dá)于正常B細(xì)胞W及B細(xì)胞淋己瘤上，所W CD19是被廣泛接受并且可W安全用于CART的抗原。雖然CARS觸發(fā)T細(xì)胞激活的方 式與內(nèi)源性T細(xì)胞受體激活的方式類似，但該技術(shù)用于臨床應(yīng)用的主要障礙是CART 細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增，W及其注射后細(xì)胞的迅速消失和令人失望的臨床活動(dòng)（Jena,et al.，Blood, 2010, 116:1035-1044 ;化kun,etal.Blood, 1988, 71:13-29)。
[0007] 在許多腫瘤中，腫瘤特異性抗原并沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，但在B細(xì)胞淋己瘤中，得力于淋己 細(xì)胞消除的發(fā)展CART的臨床結(jié)果也得到了提高，通過(guò)抗CD19的嵌合型抗原受體T細(xì)胞在B細(xì)胞淋己瘤的應(yīng)用證明了W基因改造T細(xì)胞為基礎(chǔ)的過(guò)繼免疫治療其在臨床抗腫瘤的許 多問(wèn)題得到了解決。但是，在該個(gè)治療方案被廣泛接受之前還是有許多沒(méi)有解決的問(wèn)題。 其中的一個(gè)問(wèn)題就是單鏈可變區(qū)片段（scFv)作為一個(gè)融合蛋白在細(xì)胞膜表面表達(dá)的穩(wěn)定 性。正如大家所知道的scFv作為抗體的單元是不穩(wěn)定的，W及在早前研究中也發(fā)現(xiàn)CAR的 胞外部分的穩(wěn)定性會(huì)影響T細(xì)胞的功能（gene化erapy, 6, 412)。由于CAR在腫瘤治療使用 中其組分W及方法的穩(wěn)定性將影響其功能，因?qū)τ谄浣M分穩(wěn)定性的研究W及方法的建立是 迫切需要的。本發(fā)明恰好解決了該一需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種抗原結(jié)合單元（antigenbindingunit,Abu)穩(wěn)定的嵌合型抗 原受體（CAR)，其包含胞外的抗原結(jié)合單元、跨膜結(jié)構(gòu)域、W及細(xì)胞內(nèi)共刺激信號(hào)域，其中所 述抗原結(jié)合單元相對(duì)于腫瘤特異性祀點(diǎn)表達(dá)穩(wěn)定，所述抗原結(jié)合單元包含通過(guò)較鏈相連接 的重鏈W及輕鏈，所述較鏈由SEQIDNO. 2氨基酸序列編碼。
[0009] 其中，所述腫瘤特異性祀點(diǎn)為血液學(xué)惡性腫瘤相關(guān)抗原或?qū)嶓w瘤相關(guān) 抗原，更進(jìn)一步的，所述腫瘤特異性祀點(diǎn)選自如下單一抗原或幾個(gè)抗原的組合， CD19，CD20，EGFR or EGFRvIII，CEA，CD22，R0Rl，間皮素，CD33/IL3Ra，c-Met，PSMA,糖脂 巧7, GD-2, NY-ESO-ITCR, MAGE A3TCR。
[0010] 其中，嵌合型抗原受體（CAR)針對(duì)腫瘤特異祀點(diǎn)CD19的穩(wěn)定抗原結(jié)合單元的重鏈 由SEQIDNO. 1氨基酸序列編碼，輕鏈由SEQIDNO. 3的氨基酸序列編碼。
[0011] 其中，嵌合型抗原受體（CAR)針對(duì)腫瘤特異祀點(diǎn)CD20的穩(wěn)定抗原結(jié)合單元的重鏈 由SEQIDNO. 4的氨基酸序列編碼，輕鏈由SEQIDNO. 5的氨基酸序列編碼。
[0012] 其中，嵌合型抗原受體（CAR)針對(duì)腫瘤特異祀點(diǎn)癌胚抗原CEA的穩(wěn)定抗原結(jié)合單 元的重鏈由SEQIDNO. 6的氨基酸序列編碼，輕鏈由SEQIDNO. 7的氨基酸序列編碼。
[0013] 其中，嵌合型抗原受體（CAR)針對(duì)腫瘤特異祀點(diǎn)EGFRvIII的穩(wěn)定抗原結(jié)合單元的 重鏈由SEQIDNO. 8氨基酸序列編碼，輕鏈由SEQIDNO. 9的氨基酸序列編碼。
[0014] 其中，跨膜結(jié)構(gòu)域由SEQIDNO. 10氨基酸序列編碼。
[0015] 其中，所述細(xì)胞內(nèi)共刺激信號(hào)域?yàn)槿诤螩D3C信號(hào)域和CD28及CD137的細(xì)胞內(nèi)結(jié) 構(gòu)域的混合型細(xì)胞內(nèi)共刺激信號(hào)域。
[0016] 其中，所述CAR的共刺激信號(hào)域中包含了細(xì)胞內(nèi)的混合型共刺激結(jié)構(gòu)域，其選擇 可W來(lái)源于CD27,CD28, 4-1BB，0X40,CD30,CD40,PD-1，IC0S，淋己細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LF A-1)，CD2,CD7,LIGHT,NKG2C，B7-冊(cè)，CD83的特異性配基W及其中的任意組合。
[0017] 其中，其中，編碼CAR中細(xì)胞內(nèi)混合型信號(hào)域的氨基酸序列SEQ ID NO. 11中含有 SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13氨基酸序列。
[001引其中，所述CD3C信號(hào)域由SEQIDNO. 14氨基酸序列編碼，所述CD28的信號(hào)域由SEQIDNO. 12氨基酸序列編碼，所述CD137的信號(hào)域由SEQIDNO. 13氨基酸序列編碼。
[0019] 其中，嵌合型抗原受體（CAR)的抗原結(jié)合單元由一個(gè)抗體或者一個(gè)抗原結(jié)合單元 組成，優(yōu)選所述抗原結(jié)合單元是經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性設(shè)計(jì)的單鏈抗體scFv。
[0020] 本發(fā)明還提供一種制備表達(dá)所述CAR的細(xì)胞的方法，其包括如下步驟，（a)獲得外 周血單核細(xì)胞（PBMCs) ;(b)轉(zhuǎn)化或感染PBMC細(xì)胞，將編碼CAR的表達(dá)框DM整合到細(xì)胞染 色體。
[0021] 其中，表達(dá)所述CAR的細(xì)胞選自T細(xì)胞（細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）， NK細(xì)胞，其中T細(xì)胞是自體、同種異體或異種T細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明還提供了含有表達(dá)所述CAR的細(xì)胞在制備抗腫瘤相關(guān)藥物中的用途。
[0023] 其中，患者至少對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生抵抗。
[0024] 其中，所述腫瘤是淋己細(xì)胞白血病，且為CD19+的難治性白血病和淋己瘤。
[0025] 本發(fā)明還提供了含有表達(dá)所述CAR的細(xì)胞在制備刺激T細(xì)胞介導(dǎo)針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞群 或病人組織的免疫反應(yīng)相關(guān)藥物中的用途。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1A顯示PBMC細(xì)胞經(jīng)OKT-3和比-2刺激后的生長(zhǎng)擴(kuò)增曲線；
[0027] 圖1B顯示PBMC細(xì)胞經(jīng)OKT-3和比-2刺激后生長(zhǎng)的細(xì)胞活力變化；
[0028] 圖2顯示用不同MOI值的慢病毒感染T細(xì)胞的感染效率（用FITC-標(biāo)記的蛋白L 檢測(cè)scFv在T細(xì)胞的表達(dá)）；
[0029] 圖3顯示不同E;T比例的CD19特異性的CAR-T細(xì)胞對(duì)祀細(xì)胞的殺傷作用，圖3A 為K562細(xì)