嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、工程化cd19靶向性的nkt細胞及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，具體地，涉及過繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體⑶19ScFv-2-⑶8-⑶137-⑶3 ζ及其基因和重組表達載體、工程化⑶19靶向性的NKT細 胞（CAR19-2-NKT細胞）及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細胞（NKT)是一種特殊類型的T淋巴細胞亞群，具有T細胞和NK細胞細 胞兩重性質(zhì)。NKT細胞能表達T細胞的TCR與NK細胞的NKR-Pl兩種受體，在TCR和NKR介導(dǎo) 下，NKT細胞能夠產(chǎn)生大量的IL-4及INF γ，對腫瘤細胞發(fā)揮細胞殺傷作用。NKT細胞通過自 身表面的⑶16與特異性抗體的Fc段結(jié)合，發(fā)揮ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用。但在抗體依賴的細胞介導(dǎo)的殺傷作用過程中，由于抗體能與革El細胞上 的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，NKT細胞可殺傷任何已與抗體結(jié)合的靶細胞，因此抗體與靶細 胞上的抗原結(jié)合是特異性的，但NKT細胞對靶細胞的殺傷作用是非特異性的。另外，通常情 況下，輸注的NKT細胞在患者體內(nèi)半衰期為2周左右，有效期短暫，需要反復(fù)多次輸注。另 外，NKT細胞本身缺少特異性抗體，不足以在腫瘤周圍或者瘤巢中富集，制約了 NKT細胞對 惡性腫瘤的靶向治療。而且，研究表明，NKT細胞不是對所有的腫瘤都有殺傷效果，對部分 腫瘤的殺傷作用比較弱，特異殺傷活性有待提高。
[0003] CD19分子是B淋巴細胞表面發(fā)揮特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，存在于B細胞成熟的各 個階段，在B祖細胞階段出現(xiàn)并穩(wěn)定持續(xù)地表達。CD19作為B細胞系特異的細胞表面分化 抗原，僅表達于前B細胞和成熟B細胞表面，而在造血干細胞、漿細胞和其他正常組織細胞 中不表達。而且，⑶19分子在膜上比較暴露，容易接近，與單克隆抗體結(jié)合后無顯著內(nèi)化及 脫落，也不會因為與抗體的結(jié)合而發(fā)生抗原調(diào)變。此外，近期關(guān)于癌基因 MYC基因如何推動 B淋巴細胞惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的研究，發(fā)現(xiàn)CD19對穩(wěn)定Myc蛋白來說是絕對必要的， 當(dāng)Myc基因是穩(wěn)定的，并處于較高水平時，Myc基因會促使癌癥發(fā)展，并且，Myc蛋白水平高 的患者更可能死于淋巴瘤。CD19可能是控制Myc基因通路上的開關(guān)，而控制通斷開關(guān)可能 代表了治療淋巴細胞腫瘤的有力工具。基于以上現(xiàn)象，故CD19成為治療CD19陽性的急性 B淋巴細胞白血病的一個重要靶點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中NKT細胞對腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺 傷活性有待提高的缺陷，提供一種嵌合抗原受體⑶19ScFv-2-⑶8-⑶137-⑶3 ζ及其基因 和重組表達載體、工程化⑶19靶向性的NKT細胞（CAR19-2-NKT細胞）及其應(yīng)用，嵌合抗原 受體⑶19ScFv-2-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修飾的NKT細胞在治療進展期⑶19陽性的急性B淋巴 細胞白血病時，對白血病細胞具有很好的特異殺傷活性，且對已經(jīng)過多次治療（如放療、化 療及其他藥物對癥治療等）但均無明顯療效的進展期CD19陽性的急性B淋巴細胞白血病 患者有一定的治療效果。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的嵌合抗原受體 ⑶19ScFv-2-⑶8-⑶137-⑶3 ζ對NKT細胞具有高的感染效率，且感染后得到的 CAR19-2-NKT細胞在體外有高效的殺瘤活性，同時采用CAR19-2-NKT細胞治療進展期⑶19 陽性的急性B淋巴細胞白血病時，對白血病細胞具有很好的特異殺傷活性，且對已經(jīng)過多 次治療（如放療、化療及其他藥物對癥治療等）但均無明顯療效的進展期CD19陽性的急性 B淋巴細胞白血病患者有一定的治療效果。
[0006] 因此，為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為 CD19ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ，由 CD19 的單鏈抗體（CD19ScFv-2)、CD8 的鉸鏈 區(qū)（hinge區(qū)）和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成， 編碼所述CD19ScFv-2的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達載體。
[0009] 第四方面，本發(fā)明提供了一種工程化⑶19靶向性的NKT細胞，所述NKT細胞是上 述嵌合抗原受體CD19ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細胞。
[0010] 第五方面，本發(fā)明提供了上述工程化⑶19靶向性的NKT細胞在制備用于治療白血 病的制劑中的應(yīng)用。
[0011] 在治療進展期CD19陽性的急性B淋巴細胞白血病時，本發(fā)明的嵌合抗原受 體⑶19ScFv-2-⑶8-⑶137-⑶3 ζ對NKT細胞具有高的感染效率，且感染后得到的 CAR19-2-NKT細胞，即工程化CD19靶向性的NKT細胞，在體外具有高效的殺瘤活性，在體 內(nèi)能夠不依賴于白介素2而持續(xù)長久的存在，且能夠特異性結(jié)合CD19抗原，明顯延長免疫 細胞在患者體內(nèi)的存活時間，增強免疫細胞靶向識別B淋巴細胞白血病CD19抗原的能力， 加強對白血病細胞的特異殺傷活性，而且對已經(jīng)過多次治療（如放療、化療及其他藥物對 癥治療等）但均無明顯療效的進展期CD19陽性的急性B淋巴細胞白血病患者，本發(fā)明的 CAR19-2-NKT細胞具有較低的毒副作用，患者具有較好的耐受性，并且發(fā)揮一定的治療效 果。本發(fā)明的工程化CD19靶向性的NKT細胞為治療進展期CD19陽性的急性B淋巴細胞白 血病提供了一種新的選擇，具有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。
[0012] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0013] 圖1為流式細胞術(shù)對分離培養(yǎng)的NKT細胞表型分析的結(jié)果。
[0014] 圖2為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的限制性內(nèi)切酶MluI/ Sail雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0015] 圖3為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWPT-CD19ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ的限制性內(nèi) 切酶BamHI/Sall雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0016] 圖4為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWPT-CD19ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ的結(jié)構(gòu)示意 圖，其中，逆時針序列為正向基因片度，順時針為反向基因片段。
[0017] 圖5為流式細胞術(shù)檢測含有嵌合抗原受體⑶19ScFv-2_⑶8-⑶137-⑶3 ζ的病毒 濃縮液對NKT細胞的感染效率。
[0018] 圖6為流式細胞術(shù)檢測嵌合抗原受體CD19ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT 細胞（CAR19-2-NKT細胞）表型鑒定的結(jié)果。
[0019] 圖7為本發(fā)明的CAR19-2-NKT細胞對人B淋巴白血病細胞殺傷作用的細胞毒性分 析圖。
[0020] 圖8為本發(fā)明的CAR19-2-NKT細胞對進展期⑶19陽性的急性B淋巴細胞白血病 患者治療過程中CAR19-2-NKT細胞的拷貝數(shù)變化趨勢圖。
[0021] 圖9為采用本發(fā)明的CAR19-2-NKT細胞治療前后患者骨髓中⑶19陽性細胞數(shù)目 的變化趨勢圖。
[0022] 圖10為采用本發(fā)明的CAR19-2-NKT細胞治療前（左圖）與治療2月后（右圖） 的骨髓中CD19陽性細胞數(shù)目的變化圖。
【具體實施方式】
[0023] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0024] 本發(fā)明提供了 一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為 CD19ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ，由 CD19 的單鏈抗體（CD19ScFv-2)、CD8 的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、 ⑶137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成，編碼所述⑶19ScFv-2的基 因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。優(yōu)選情況下，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0025] 本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優(yōu)選情況下，編碼上述嵌合抗原受 體的基因的核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0026] 本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達載體。優(yōu)選情況下，重組表達載體為慢病 毒表達載體。對于慢病毒表達載體沒有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉(zhuǎn)染包裝細胞 如293T包裝細胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體⑶19ScFv-2-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修飾的 NKT細胞即可，優(yōu)選情況下，慢病毒表達載體為pWPT-CD19ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0027] 對于慢病毒表達載體pWPT-CD19ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ的制備方法沒有特 別的限定，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的各種方法，優(yōu)選情況下，慢病毒表達載體 pWPT-CD19ScFv-2-CD8-CD137-CD3G的制備方法包括以下步驟：
[0028]