編碼gpc-3嵌合抗原受體蛋白的核酸及表達(dá)gpc-3嵌合抗原受體蛋白的t淋巴細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】編碼表達(dá)于人T淋巴細(xì)胞表面的嵌合抗原受體蛋白的核酸，所述嵌合抗原受體蛋白包含順序連接的胞外結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，其中所述胞外結(jié)合區(qū)包含特異性識(shí)別GPC3的C末端表位的單鏈抗體scFv(GPC3)。
【專利說(shuō)明】編碼GPC-3嵌合抗原受體蛋白的核酸及表達(dá)GPC-3嵌合抗 原受體蛋白的T淋巴細(xì)胞

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞治療領(lǐng)域，更具體地，涉及對(duì)特異性表達(dá)GPC3的上皮來(lái)源的 腫瘤的轉(zhuǎn)基因 T淋巴細(xì)胞治療領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3, GPC3,又稱 DGSX，GTR2-2, MXR7, 0CI-5， SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)是一種細(xì)胞表面蛋白，屬于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基 因編碼產(chǎn)生70-kDa左右的前體核心蛋白，該前體蛋白能夠被弗林蛋白酶（furin)剪切產(chǎn)生 40-kDa左右的可溶性的能夠進(jìn)入血液的氨基端（N末端）肽和30-kDa左右含有2個(gè)硫酸 乙酰肝素（HS)糖鏈的膜結(jié)合的羧基端（C末端）肽。GPC3蛋白通過(guò)糖基磷脂酰肌醇（GPI) 錨依附在細(xì)胞膜上。
[0003] GPC3高度表達(dá)于胎兒肝臟，而不表達(dá)于正常成年人的肝組織，但在肝細(xì)胞肝癌中 恢復(fù)表達(dá)，與肝癌的發(fā)生發(fā)展有十分密切的關(guān)系，不僅在肝癌發(fā)生的早期檢出率較高，而且 隨著肝癌的發(fā)展，其檢出率也隨之增高。而GPC3的表達(dá)在肝腺癌，膽管細(xì)胞癌，肝轉(zhuǎn)移癌和 12種常見(jiàn)實(shí)體瘤和21種非肝癌細(xì)胞系中均未檢測(cè)出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢 透明細(xì)胞癌、卵黃囊瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤中表達(dá)?？紤]到GPC3在肝細(xì)胞肝癌，黑色素瘤 等腫瘤中特異性的高表達(dá)，其被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的一個(gè)候選靶標(biāo)。
[0004] 利用抗GPC3抗體進(jìn)行肝癌檢測(cè)和利用抗GPC3抗體的抗體依賴的（ADCC)或補(bǔ)體 依賴的（CDC)細(xì)胞毒性研究方案已有報(bào)道。一般用于治療的抗體識(shí)別的是GPC3蛋白的C 末端。然而，抗體治療存在著抗體在體內(nèi)血液循環(huán)中半哀期的限制，一般來(lái)說(shuō)，半哀期大多 在23天以內(nèi)。因此，持續(xù)給藥和/或增大給藥劑量是腫瘤抗體治療所要求的，這導(dǎo)致患者 治療成本的增加，以及某些情況下，甚至不得已終結(jié)治療。另外，治療性抗體作為異源蛋白， 還有可能在體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)及針對(duì)該治療性抗體的中和性抗抗體的風(fēng)險(xiǎn)。
[0005] T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用日益受到重視?；赥淋巴細(xì)胞的過(guò)繼性 免疫治療在部分腫瘤中取得了一定的效果，并且該種免疫治療方法可以克服抗體治療的 上述缺陷，但在大多數(shù)腫瘤的療效仍不能令人滿意[Grupp SA，et al. Adoptive cellular therapy.Curr Top Microbiol Immunol.，.2011;344:149-72·]。近年來(lái)，根據(jù) CTL 對(duì)革巴 細(xì)胞的識(shí)別特異性依賴于T淋巴細(xì)胞受體（T Cell Rec印tor，TCR)的發(fā)現(xiàn)，將針對(duì)腫瘤細(xì) 胞相關(guān)抗原的抗體的scFv與T淋巴細(xì)胞受體的CD3 ζ或Fc ε RI γ等胞內(nèi)信號(hào)激活基序融 合成嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor, CAR),并將其通過(guò)如慢病毒感染等方式 基因修飾在T淋巴細(xì)胞表面。這種CAR T淋巴細(xì)胞能夠以主要組織相容性復(fù)合物（Major Histocompatibility Complex, MHC)非限制性方式選擇性地將T淋巴細(xì)胞定向到腫瘤細(xì) 胞并特異性地殺傷腫瘤。CAR T淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的一個(gè)新的免疫治療策略 [Schmitz M,et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol,2010, doi ：10. 1155/2010/956304.]〇
[0006] 嵌合抗原受體包括胞外結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。通常胞外區(qū)包含能夠識(shí)別 腫瘤相關(guān)抗原的scFv，跨膜區(qū)采用CD8，CD28等分子的跨膜區(qū)，胞內(nèi)信號(hào)區(qū)采用免疫受體酪 氨酸活化基序（ITAM)⑶3 ζ或Fc ε RI γ及共刺激信號(hào)分子⑶28、⑶137、⑶134等的胞內(nèi)信 號(hào)區(qū)。
[0007] 胞內(nèi)信號(hào)區(qū)僅包含ΙΤΑΜ的為第一代CAR Τ淋巴細(xì)胞，其中嵌合抗原受體各部分 按如下形式連接：scFv-TM-ITAM。該種CAR T可以激發(fā)抗腫瘤的細(xì)胞毒性效應(yīng)，但是細(xì) 胞因子分泌比較少，并且在體內(nèi)不能激發(fā)持久的抗腫瘤效應(yīng)[Zhang T.et al. Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res2007,67 (22)： 11029-11036.]。
[0008] 隨后發(fā)展的第二代CAR T淋巴細(xì)胞加入了⑶28或⑶137(又名4-1BB)的胞內(nèi) 信號(hào)區(qū)，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接：scFv-TM-⑶28-ITAM或scFv-TM-/ ⑶137-ITAM。胞內(nèi)信號(hào)區(qū)發(fā)生的B7/⑶28或4-1BBL/⑶137共刺激作用引起T淋巴細(xì)胞的持 續(xù)增殖，并能夠提高T淋巴細(xì)胞分泌IL-2和IFN- γ等細(xì)胞因子的水平，同時(shí)提高CAR T在 體內(nèi)的存活周期和抗腫瘤效果[Dotti G.et al.CD28costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest,2011,121 (5) ： 1822-1826. ]〇
[0009] 近些年發(fā)展的第三代CAR T淋巴細(xì)胞，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連 接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM 或 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，進(jìn)一步提高了 CAR T 在體 內(nèi)的存活周期和其抗腫瘤效果[Carpenito C·，et al. Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137domains. PNAS，2009,106(9) :3360-3365.]。
[0010] 盡管CAR T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫治療中具有誘人的前景，但一些潛在的風(fēng)險(xiǎn)亦需 要考慮。比如，由于某些/種正常組織低表達(dá)CAR所能識(shí)別的特異性抗原可能造成CAR T 淋巴細(xì)胞對(duì)表達(dá)相應(yīng)抗原的正常組織的損傷。如，針對(duì)腎細(xì)胞癌患者腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗 原碳酸酐酶IX (CAIX)是第一個(gè)用于臨床的CAR T淋巴細(xì)胞過(guò)繼治療的案例，也是第一個(gè) 報(bào)道含CAR細(xì)胞的脫靶效應(yīng)的案例。病人在多次輸入CAR T淋巴細(xì)胞后出現(xiàn)2-4級(jí)肝毒 性。分析原因?yàn)楦文懝苌掀ぜ?xì)胞低表達(dá)CAIX，原臨床試驗(yàn)被迫中斷同時(shí)排除了病人治療效 果的任何評(píng)價(jià)[Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX ：first clinical experience. J clin oncol，2006,24 (13) ：e20-e22. ；Ngo MC.，et al. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics，2011，Rl-R7]。另外，CAR中過(guò)多的共刺激信號(hào)會(huì)降低效應(yīng)細(xì)胞激 活所需的閾值，使得基因修飾的T淋巴細(xì)胞在低水平抗原或沒(méi)有抗原觸發(fā)的條件下也可 能會(huì)被活化，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子的釋放以致可能引發(fā)所謂的"細(xì)胞因子風(fēng)暴"。這種信號(hào) 外漏（singnal leakage)會(huì)導(dǎo)致脫祀細(xì)胞毒性，從而產(chǎn)生非特異性的組織損傷。例如，在 采用針對(duì)Her2的第三代CAR臨床治療一個(gè)具有肝和肺轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)腸癌患者的過(guò)程中 由于正常肺組織中低表達(dá)Her2而引發(fā)所謂的"細(xì)胞因子風(fēng)暴"致病人猝死[Morgan RA.， et al. Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy，2010,18(4) :843-851.]。
[0011] 因此，本領(lǐng)域存在著對(duì)克服上述缺陷的編碼GPC3嵌合抗原受體蛋白的淋巴細(xì)胞 腫瘤治療方案的強(qiáng)烈需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的第一方面涉及編碼一種表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面的GPC3嵌合抗原受體蛋 白的核酸，其表達(dá)的嵌合抗原受體蛋白使得表達(dá)該受體的T淋巴細(xì)胞針對(duì)高表達(dá)GPC3的腫 瘤細(xì)胞具有高度特異性的細(xì)胞毒性作用。所述GPC3嵌合抗原受體蛋白包含順序連接的胞 外結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，其中所述胞外結(jié)合區(qū)包含特異性識(shí)別GPC3的C末端表位 的單鏈抗體scFv (GPC3)。上述嵌合抗原受體蛋白的胞外結(jié)合區(qū)通過(guò)⑶8鉸鏈區(qū)與⑶8或者 CD28的跨膜區(qū)相連接，跨膜區(qū)后緊接胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。
[0013] 本發(fā)明的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發(fā)明 的編碼嵌合抗原受體蛋白氨基酸序列的核酸密碼子可以是簡(jiǎn)并的，即編碼同一氨基酸序 列的多種簡(jiǎn)并核酸序列都包含在本發(fā)明的范圍之中。編碼對(duì)應(yīng)氨基酸的簡(jiǎn)并核酸密碼子是 本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序 列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變 異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異 體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸 的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
[0014] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，更佳地至少80%，最佳地至少90 %或至少95 %相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及 在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指： (1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如〇. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C ;或（2)雜 交時(shí)加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或⑶僅 在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交 的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO :22-25之一所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活 性。
[0015] 特異性識(shí)別人GPC3的C末端表位的單克隆抗體已被公開(kāi)在例如，中國(guó)專利文獻(xiàn) CN101186650A 中外制藥株式會(huì)社），此外據(jù)文獻(xiàn) Advances in Liver Cancer Antibody Therapies ：A Focus on Glypican_3and Mesothelin, BioDrugs. 2011 Octoberl ；25 (5)： 275-284其他已知特異性識(shí)別C末端表位的單克隆抗體包括GC33和hGC33也分別被報(bào)道， 其針對(duì)GPC3的抗原決定簇位于C端524-563位氨基酸殘基，同時(shí)被報(bào)道的還包括GPC3-C02 和1G12等單克隆抗體。這些被公開(kāi)的單克隆抗體可以用于制備本發(fā)明的核酸所編碼的嵌 合抗原受體蛋白中的單鏈抗體部分。其他識(shí)別GPC3的C末端表位的單克隆抗體也可以合 適的方式運(yùn)用于本發(fā)明。
[0016] 單鏈抗體scFv (GPC3)可以根據(jù)上述公開(kāi)的GPC3單克隆抗體的序列通過(guò)基因工程 方法或化學(xué)合成方法制備。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"單鏈抗體（scFv)片段"指的是通過(guò)如下 定義的抗體片段，其是包含通過(guò)接頭（linker)連接的重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（VL) 的重組蛋白，接頭使得這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)，以最終形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。scFv的大小一般是 一個(gè)完整抗體的1/6。單鏈抗體優(yōu)選是由一條核苷酸鏈編碼的一條氨基酸鏈序列。本發(fā)明 使用的單鏈抗體可單獨(dú)或聯(lián)合使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)，例如氨基酸缺失、插入、取代、 增加、和/或重組以及/或其他修飾方法作進(jìn)一步修飾。根據(jù)一種抗體的氨基酸序列在其 DNA序列中引入這種修飾的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的；見(jiàn)例如，Sambrook， 分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修飾優(yōu)選在核 酸水平上進(jìn)行。上述單鏈抗體還可以包括其衍生物。本發(fā)明中"抗體的衍生物"包括例如 當(dāng)通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得所述抗體的衍生物時(shí)，可使用如BIAcore系統(tǒng)中使用的表面等 離子共振技術(shù)來(lái)增加與GPC3抗原表位結(jié)合的噬菌體抗體的效率（Schier，人抗體雜交瘤 7 (1996)，97-105 ;Malmborg，免疫學(xué)方法雜志 183 (1995)，7-13)。還包括，例如 W089/09622 中描述的嵌合抗體的產(chǎn)生的方法，EP-A10239400和W090/07861中描述的人源化抗體產(chǎn)生 的方法，W091/10741，W094/02602和W096/33735中有描述的產(chǎn)生異種抗體例如小鼠中的人 抗體的方法所產(chǎn)生的抗體的衍生物。
[0017] 本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)"特異性識(shí)別"的意思是本發(fā)明的雙特異性抗體不與或基本上不與 目標(biāo)抗原以外的任意多肽交叉反應(yīng)。其特異性的程度可以通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)來(lái)判斷，包括但 不限于免疫印跡，免疫親和層析，流式細(xì)胞分析等。在本發(fā)明中，特異性識(shí)別優(yōu)選通過(guò)流式 細(xì)胞技術(shù)來(lái)確定，而具體情況下特異性識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)可由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員根據(jù)其掌握的 本領(lǐng)域常識(shí)來(lái)判斷。
[0018] 嵌合抗原受體的跨膜區(qū)可以選自⑶8或⑶28等蛋白的跨膜區(qū)。⑶8或⑶28是T 淋巴細(xì)胞表面的天然標(biāo)記物。人⑶8蛋白是個(gè)異二聚體，由α β或者Υ δ兩條鏈組成。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，跨膜區(qū)選自CD8a或者CD28的跨膜區(qū)。此外，CD8a鉸鏈區(qū) (hinge)是一個(gè)柔性區(qū)域，因此，CD8或CD28和跨膜區(qū)加上鉸鏈區(qū)被用于將嵌合抗原受體 CAR的靶點(diǎn)識(shí)別結(jié)構(gòu)域scFv和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)連接起來(lái)。
[0019] 胞內(nèi)信號(hào)區(qū)可以選自⑶3 ζ，F(xiàn)c ε RIY，⑶28,⑶137,⑶134蛋白的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，及 其組合。⑶3分子由五個(gè)亞單位組成，其中⑶3 ζ亞單位（又稱⑶3zeta，簡(jiǎn)稱Z)含有3個(gè) ITAM基序，該基序是TCR-⑶3復(fù)合體中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。⑶3 δ Z是截短的不具有ITAM 基序的CD3(序列，在本發(fā)明實(shí)踐中一般作為陰性對(duì)照的構(gòu)建。Fee RIY主要分布在肥大 細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面，其含有一個(gè)ITAM基序，在結(jié)構(gòu)、分布及功能上與CD3(類似。此 外如前所述，CD28, CD137, CD134是共刺激信號(hào)分子，在與各自配體結(jié)合后其胞內(nèi)信號(hào)區(qū)段 產(chǎn)生的共刺激作用引起T淋巴細(xì)胞的持續(xù)增殖，并能夠提高T淋巴細(xì)胞分泌IL-2和IFN- γ 等細(xì)胞因子的水平，同時(shí)提高CAR T淋巴細(xì)胞在體內(nèi)的存活周期和抗腫瘤效果。
[0020] 本發(fā)明的核酸所編碼的GPC3嵌合抗原受體蛋白可以選自按如下方式順序連接的 嵌合抗原受體蛋白：
[0021] scFv(GPC3)-CD8-CD3 ζ，
[0022] scFv (GPC3)-CD8-CD137-CD3 ζ，
[0023] scFv(GPC3)-CD28a-CD28b_CD3 ζ，
[0024] scFv (GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3 ζ，
[0025] 及其組合，其中相關(guān)嵌合抗原受體蛋白中⑶28a代表⑶28分子的跨膜區(qū)，⑶28b代 表CD28分子的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。上述各種抗GPC3嵌合抗原受體統(tǒng)稱為scFv (GPC3) -CAR。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸具有如SEQ ID NO :18?21所述的序 列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸是編碼具有如SEQ ID NO :22-25之一的 嵌合抗原受體蛋白的核酸。
[0027] 本發(fā)明的第二方面包括包含上述編碼表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面的嵌合抗原受體 蛋白的核酸的載體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的載體是一種慢病毒質(zhì)粒載體 pPWT-eGFP。該質(zhì)粒屬于第三代自滅活慢病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)共有三個(gè)質(zhì)粒即編碼蛋 白Gag/Po 1、編碼Rev蛋白的包裝質(zhì)粒psPAX2 ;編碼VSV-G蛋白的包膜質(zhì)粒PMD2. G ;及 空載體pPWT-eGFP，其可以用于重組引入目的核酸序列，即編碼CAR的核酸序列?？蛰d體 pPWT-eGFP(其本身為后續(xù)試驗(yàn)中的mock)中由延長(zhǎng)因子-la (elongation factor-la, EF-1 a)啟動(dòng)子調(diào)控增強(qiáng)型綠色突光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP) 的表達(dá)。而包含編碼CAR的目的核酸序列的重組表達(dá)載體pWPT-eGFP-F2A-CAR是通過(guò)由 來(lái)自口蹄疫病毒（food-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)的核糖體跳躍序列（ribosomal skipping sequence2A)(簡(jiǎn)稱F2A)實(shí)現(xiàn)eGFP與CAR的共表達(dá)的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中， 本發(fā)明的載體具有如SEQ ID NO :27-30之一的核酸序列。
[0028] 本發(fā)明的第三方面包括包含上述載體的病毒。本發(fā)明的病毒包括包裝后的具有感 染力的病毒，也包括包含包裝為具有感染力的病毒所必需成分的待包裝的病毒。本領(lǐng)域內(nèi) 已知的其他轉(zhuǎn)導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的病毒及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒載體也可用于本發(fā)明。
[0029] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒是包含上述pWPT-eGFP-F2A-CAR重組載體 (即含有scFv(GPC3)-CAR)的慢病毒。
[0030] 本發(fā)明的第四方面包括一種轉(zhuǎn)基因 T淋巴細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)導(dǎo)有本發(fā)明的核酸或被轉(zhuǎn) 導(dǎo)有本發(fā)明的上述包含所述含有該核酸的重組質(zhì)粒，或包含該質(zhì)粒的病毒。本領(lǐng)域常規(guī) 的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，包括非病毒和病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法都可以用于本發(fā)明?；诜遣《镜霓D(zhuǎn)導(dǎo) 方法包括電穿孔法和轉(zhuǎn)座子法。近期Amaxa公司研發(fā)的nucleofector核轉(zhuǎn)染儀能夠直 接將外源基因?qū)爰?xì)胞核獲得目的基因的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，基于睡美人轉(zhuǎn)座子（Slewing Beauty system)或PiggyBac轉(zhuǎn)座子等轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較普通電穿孔有較大提 高，將nucleofector轉(zhuǎn)染儀與睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用已有報(bào)道[Davies JK.，et al.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010,70(10) :0F1-10.]，該方法既具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率又能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因的定點(diǎn)整合。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn)嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法是基 于病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。該方法具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，外源基因能夠穩(wěn)定表 達(dá)，且可以縮短體外培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞到達(dá)臨床級(jí)數(shù)量的時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。在該轉(zhuǎn)基因 T淋巴細(xì) 胞表面，轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)在其表面。通過(guò)對(duì)各種不同的培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行 體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的表面表達(dá)嵌合抗原受體的轉(zhuǎn)基因 T淋巴細(xì)胞具有高度特異 性的腫瘤細(xì)胞殺傷效果（亦稱細(xì)胞毒性）。因此本發(fā)明的編碼嵌合抗原受體蛋白的核酸，包 含該核酸的質(zhì)粒，包含該質(zhì)粒的病毒和轉(zhuǎn)導(dǎo)有上述核酸，質(zhì)?；虿《镜霓D(zhuǎn)基因 T淋巴細(xì)胞 可以有效地用于腫瘤的免疫治療。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的T淋巴細(xì)胞，其表面表達(dá)一種嵌合抗原受體，所述嵌 合抗原受體由SEQ ID NO :18-21之一的核酸編碼表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn) 基因 T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列選自SEQ ID NO :22-25 之一。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1顯示的是作為示例的本發(fā)明的包含編碼CAR序列的慢病毒載體 pWPT-eGFP-F2A-CAR的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0033] 圖2顯示的是作為示例的包含在慢病毒載體中的本發(fā)明的CAR的不同區(qū)之間連接 關(guān)系的示意圖，其中由核糖體跳躍序列F2A連接的eGFP和svFv(GPC3)特異性嵌合抗原受 體。
[0034] 圖3顯示的是Mlul和Sail雙酶切鑒定實(shí)施例1的慢病毒質(zhì)粒的核酸電泳圖。其 中Ml是DS2000分子量標(biāo)記物（廣州東盛生物科技有限公司）；M2是Hind III標(biāo)記物（廣 州東盛生物科技有限公司）。泳道1-5分別是
[0035] 1 ：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-δ Ζ ；
[0036] 2 ：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-Z ；
[0037] 3 ：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ ；
[0038] 4：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z ；
[0039] 5 :pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ。
[0040] 圖4顯示的是本發(fā)明實(shí)施例2的病毒感染CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）后細(xì)胞表 達(dá)的eGFP的流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果。
[0041] 圖5顯示的是本發(fā)明實(shí)施例2的表達(dá)不同嵌合抗原受體（CAR+)的CTL細(xì)胞的體 外生長(zhǎng)情況。圖中顯示在病毒感染后第9天，表達(dá)不同嵌合抗原受體的CTL細(xì)胞體外擴(kuò)增 20?40倍。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不能理解為用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中如未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法， 則按照常規(guī)條件如Sambrook等，"分子克隆：實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（New York :Cold Spring Harbor laboratory Press，1989) "中所述的條件，而在實(shí)施例中明確說(shuō)明有試劑公司說(shuō)明書時(shí)，貝lj 按照說(shuō)明書所建議的條件進(jìn)行。
[0043] 實(shí)施例1.表達(dá)本發(fā)明核酸編碼的嵌合抗原受體蛋白的慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒 包裝
[0044] 下表1解釋了本發(fā)明示例的嵌合抗原受體各部分的連接順序，該連接還可參見(jiàn)圖 2中所示。表1
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 編碼表達(dá)于人T淋巴細(xì)胞表面的抗GPC3嵌合抗原受體蛋白的核酸，所述抗GPC3嵌 合抗原受體蛋白包含順序連接的胞外結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，其中所述胞外結(jié)合區(qū) 包含特異性識(shí)別GPC3的C末端表位的單鏈抗體scFv(GPC3)。
2. 權(quán)利要求1所述的核酸，其中跨膜區(qū)選自包含CD8或CD28的跨膜區(qū)和鉸鏈區(qū)的序 列。
3. 權(quán)利要求1或2的核酸，其中胞內(nèi)信號(hào)區(qū)選自⑶3 ζ，F(xiàn)c ε RI Y，⑶28,⑶137,⑶134 的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列，及其組合。
4. 權(quán)利要求3的核酸，其中所述嵌合抗原受體蛋白是選自包含順序連接的胞外結(jié)合 區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的如下順序連接的嵌合抗原受體蛋白： scFv(GPC3)-CD8-CD3 ζ， scFv(GPC3)-CD8-CD137-CD3 ζ， scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD3 ζ， scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3 ζ， 及其組合，其中相關(guān)嵌合抗原受體蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜區(qū)，CD28b代表 CD28分子的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。
5. 權(quán)利要求1的核酸，選自編碼具有SEQ ID NO :22?25之一序列的嵌合抗原受體蛋 白的核酸。
6. 權(quán)利要求1的核酸，具有SEQ ID NO :18-21之一的序列。
7. 包含權(quán)利要求1-6之一所述的核酸的載體。
8. 權(quán)利要求7所述的載體，該載體來(lái)自慢病毒質(zhì)粒pWPT-eGFP，并具有如SEQ ID NO : 27-30之一的核酸序列。
9. 包含權(quán)利要求7或8所述載體的病毒。
10. -種基因修飾的T淋巴細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)導(dǎo)有權(quán)利要求1-6之一的核酸或權(quán)利要求7或 8所述的載體或權(quán)利要求9所述的病毒。
11. 一種轉(zhuǎn)基因 T淋巴細(xì)胞，其表面表達(dá)一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體由SEQ ID NO :18-21之一的核酸編碼表達(dá)。
12. -種基因修飾的T淋巴細(xì)胞，其表面表達(dá)一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體的 氨基酸序列選自SEQ ID NO :22-25之一。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK104140974SQ201310164725
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月8日
【發(fā)明者】李宗海, 高慧萍, 蔣華, 石必枝, 王華茂, 李克桑, 王紅陽(yáng), 楊勝利, 顧健人 申請(qǐng)人:上海益杰生物技術(shù)有限公司