專利名稱：嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā) 明屬于生物與新醫(yī)藥技術領域。具體是一種嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-⑶8-⑶28-⑶137-⑶3 ζ的制備。其制備涉及利用分子生物學技術，將編碼腫瘤穿透肽iRGD、抗人腎癌G250抗原的單鏈抗體、⑶8的跨膜區(qū)和胞內區(qū)及⑶28、⑶137、⑶3 ζ的胞內信號結構域的核苷酸序列依次連接起來，得到編碼嵌合抗原受體iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-⑶137-⑶3 ζ的融合基因片段，并在其5’末端插入信號肽Ig kappa的編碼序列。然后將該基因片段插入慢病毒表達載體，包裝成慢病毒。利用該慢病毒感染人T淋巴細胞，使細胞表達該嵌合抗原受體。這種T淋巴細胞能夠識別腎癌細胞表面抗原G250，用于腎癌治療。
背景技術：
嵌合抗原受體(chimericantigen receptor, CAR)是模擬 T 細胞受體(T cellreceptor, TCR)功能的人工受體，由抗原識別結構域(單鏈抗體)和T淋巴細胞的一系列信號結構域(來源于⑶8、⑶28、⑶137、⑶3 ζ和FcR Y等分子)依次連接而成。根據(jù)胞內信號結構含有結構域的不同，CAR被劃分為三代。第一代CAR僅含有一個胞內信號結構域(⑶3 ζ或FcR Y )0為增強CAR修飾T淋巴細胞在體內的增殖和存活能力，一些共刺激分子(如⑶28和⑶137)的胞內信號結構域被加入到第一代CAR中，形成第二代CAR (含有一個共刺激分子)和第三代CAR (含有兩個共刺激分子)。CAR修飾的T淋巴細胞能夠通過其抗原識別結構域(單鏈抗體)識別腫瘤細胞表面抗原，然后通過胞內信號結構域將識別信號傳遞至胞內，激活T淋巴細胞的殺傷活性，殺死腫瘤細胞。CAR修飾的T淋巴細胞治療腫瘤，是一種利用人體自身淋巴細胞進行的免疫治療手段，相對于目前臨床使用的放、化療來講，具有毒副作用較弱的特點。由于CAR修飾的T淋巴細胞通過其CAR的抗原識別結構域識別腫瘤細胞，然后啟動殺傷作用，因此具有靶向性的特點。由于CAR修飾的T淋巴細胞通過CAR的抗原識別結構域直接識別腫瘤細胞表面抗原，并通過來源于⑶8、⑶28、⑶137和⑶3 ξ的信號結構域直接將識別信號傳遞至胞內，激活T淋巴細胞的殺傷活性，因此可以繞開常規(guī)細胞免疫的主要組織相容性復合體(majorhistocompatibility complex, MHC)的限制性。嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞治療惡性血液病已經(jīng)取得較好效果，但對實體瘤治療效果有限。主要原因是嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞穿透實體瘤的能力有限，所以增強其腫瘤穿透能力是增強CAR修飾T淋巴細胞對實體瘤治療效果的重要途徑。iRGD肽是一種具有腫瘤通透作用的短肽，其原理是iRGD中的RGD三肽與腫瘤血管內皮細胞表面高表達的αν整合素(av integrins)結合,將藥物導向腫瘤部位；在細胞表面蛋白酶的作用下，氨基酸K和G之間的肽鍵被水解斷開,暴露出C末端規(guī)則(C end rule, CendR)基序(CRGDK)5CendR基序與腫瘤細胞表面的neuropilin-1結合，使腫瘤組織通透性增加，便于T淋巴細胞進入腫瘤組織內部。G250是一種表達于腎癌細胞表面的腎癌特異性抗原，抗G250單克隆抗體(G250-McAb)能與所有的腎透明細胞癌(占腎癌的90%)及65%的非透明腎細胞癌結合，但不與正常腎細胞發(fā)生反應。利用131I標記G250-McAb定位腎轉移癌，90%以上的轉移癌，包括肝、肺、骨及淋巴結轉移均被發(fā)現(xiàn)，有些僅8mm沒被CT及MRI發(fā)現(xiàn)的微小腫瘤亦被顯示。G250-McAb與腎癌細胞結合的高特異性、高靈敏性，使其可應用于腎癌的靶向治療。將G250-McAb與GFP表達載體偶聯(lián)可使報告基因GFP轉染率大幅升高。因此，可以利用G250單鏈抗體(scFv)作為抗原識別結構域識別腎癌細胞表面抗原。目前臨床上使用的CAR，其scFv大多來自于鼠源抗體，其修飾的T淋巴細胞在體內會引起人抗鼠scFv的免疫反應。此免疫反應會降低CAR修飾的T淋巴細胞在體內的增殖和存活能力，進而降低其治療效果。

發(fā)明內容
為解決上述問題，本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體RGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3(及其用途，本發(fā)明采用人源化抗人腎癌抗原G250scFv可以有效降低這種免疫反應，延長CAR修飾T細胞在體內的存活時間，提升治療效果。本發(fā)明的技術方案如下一種嵌合抗原受體RGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ，其特征在于，提供的嵌合抗原受體 iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ是一種融合蛋白，由腫瘤穿透肽iRGD、人源化抗人腎癌抗原G250單鏈抗體、⑶8的跨膜區(qū)和胞內區(qū)及⑶28、⑶137和⑶3 ζ的胞內信號結構域依次串聯(lián)構成。其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所示，其編碼基因序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。利用該嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞，能夠通過識別人腎癌細胞表面的G250抗原，殺死腎癌細胞。本發(fā)明通過基因合成技術合成由編碼⑶8的跨膜區(qū)和胞內區(qū)及⑶28、⑶137和⑶3ζ胞內信號結構域的核苷酸序列構成的融合基因片段⑶8-⑶28-⑶137-⑶3 ζ。通過巢式PCR在抗人腎癌G250抗原的單鏈抗體編碼基因[ScFv(G250)]的5’端依次加上Ig kappa信號肽和腫瘤穿透肽iRGD的編碼序列，得到融合基因序列Igkappa-iRGD-SCFv(G250)。然后通過重疊延伸PCR技術將融合基因片段Igkappa-iRGD-SCFv(G250)和CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 拼接成編碼嵌合抗原受體 iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ 的融合基因片段，命名為 Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ。然后將該融合基因片段插入慢病毒表達載體中，包裝成攜帶Igkappa-iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-⑶3ζ編碼基因的慢病毒。利用該慢病毒感染T淋巴細胞，使T淋巴細胞表達該嵌合抗原受體。通過體外的Cr51釋放分析實驗證明該嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞對腎癌細胞具有殺傷作用。因此本發(fā)明所述的嵌合抗原受體iRGD-scFv (G250)-⑶8-⑶28-⑶137-⑶3 ζ可在腎癌的治療中應用。


圖I是本發(fā)明所述的在scFv(G250)的5’端依次加上Ig kappa信號肽和腫瘤穿透肽iRGD編碼序列的4次巢式PCR擴增電泳圖，圖中，I泳道DNA分子量標記(IKb Marker I)；2泳道用PPl和P5進行第一次巢式PCR的擴增產(chǎn)物；3泳道用引物P2和P5進行第二次巢式PCR的擴增產(chǎn)物；4泳道用引物P3和P5進行第三次巢式PCR的擴增產(chǎn)物；5泳道用引物P4和P5進行第四次巢式PCR擴增得到的融合基因片段Igkappa-iRGD-SCFv(G250)；圖2是本發(fā)明所述編碼嵌合抗原受體Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28_CDl37-⑶3 ζ 的融合基因全長序列擴增電泳圖，圖中，I泳道DNA分子量標記(IKb Markerl)；2 泳道編碼 Igkappa-iRGD-scFv(G250)的序列；3 泳道編碼 CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的序列；4 泳道編碼嵌合抗原受體 Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的融合基因序列。圖3是本發(fā)明所述的慢病毒表達質粒(pLVX-Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ )的示意圖，其中，逆時針序列為正向基因片段，順時針為反向基因片段。圖4 是本發(fā)明所述慢病毒表達質粒 pLVX-Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-⑶137-⑶3 ζ的限制性內切酶酶切片段電泳鑒定圖，其中，I泳道DNA分子量標記(1Kb、Markerl) ；2 泳道慢病毒表達質粒 pLVX-Igkappa-iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ ；3泳道用限制性內切酶EcoR I和Xba I雙酶切慢病毒表達質粒pLVX-Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 后所得到的編碼 Igkappa-iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 4 的 DNA 片段(1630bp)和載體片段(8192bp)；圖5是本發(fā)明所述的嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修飾的T淋巴細胞明視野圖。圖6是綠色熒光視野下觀察嵌合抗原受體iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ在T淋巴細胞中的表達效率圖。圖7是Western blot檢測人腎癌細胞Ketr-3和人胚腎細胞HEK293中G250的表達量。圖8是本發(fā)明所述的嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修飾的T淋巴細胞對人腎癌細胞Ketr-3殺傷作用的Cr51釋放分析圖，其中， CAR-Tcells :嵌合抗原受體iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修飾的T淋巴細胞實驗組；音T cells :不加修飾的T淋巴細胞實驗組。圖9是本發(fā)明所述的嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修飾的T淋巴細胞對人胚腎細胞ΗΕΚ293殺傷作用的Cr51釋放分析圖，其中，+ CAR-Tcells :嵌合抗原受體iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修飾的T淋巴細胞實驗組；
T cells :不加修飾的T淋巴細胞實驗組。
具體實施例方式實施例I :荷載嵌合抗原受體iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ的慢病毒表達載體的構建。(一)融合基因片段Igkappa-iRGD-scFv (G250)的制備Pl :5 -TGCCGCGGCGACAAGGGCCCCGACTGCGACATTGTGATGACCCAiRGDscFv(G250)GTCTCA-3，P2:5’ -GCCAGCGTGATCATGAGCCGCGGCTGCCGCGGCGACAAGGGCCIg kappa 信號肽iRGDCCGACT-3，P3:5 ’ -TGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGCCAGCGTGATCATGAIgkappa 信號肽 迎-3， P4:5，-ATATCTCGAGCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCEcoR IIg kappa 信號妝CTGC-3，P5:5，-TGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTGAGGAGACGGTGACTGAGCD8hingescFv (G250)GTTCCT-3，P6:5 ’ -AGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCCGCscFv (G250)CD8hingeGACCA-3，P7:5，-AATT TCTAGATCAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTG-3，Xba I0)3ζ以上引物由華大基因科技有限公司合成。以攜帶人源化抗人腎癌抗原G250scFv編碼基因的質粒pcDNA3. 1-scFv (G250)(人G250scFv的DNA編碼序列如序列表中的SEQ ID NO. 4所示)為模板，用引物Pl和P5進行第一次PCR擴增，得到長774bp的DNA片段，Pl序列中引入腫瘤穿透肽iRGD的編碼序列。PCR反應條件參照Primer star DNA聚合酶(購自Takara公司)的說明書，反應體系(50ul)如下雙蒸水31.5ul5 X 反應 buffer : IOuldNTP Mix 4ulPl (IOmM) : IulP5 (IOmM) : IulpcDNA3. 1-scFv (G250) (lOOng/ul) 2ulPrimer star DNA 聚合酶0. 5ul將上述第一次PCR的產(chǎn)物跑I. 5%瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒(天根生化科技有限公司)進行DNA片段回收，具體方法見說明書。分別用P2/P5、P3/P5和P4/P5三對引物，以前一次PCR產(chǎn)物為模板重復上述PCR操作，最終得到長度為855bp的DNA片段，該DNA片段依次包含編碼Ig kappa信號肽、腫瘤穿透肽iRGD和人源化抗人腎癌抗原G250 scFv的基因序列，并在氨基末端加上了 EcoR I的酶切位點。將該DNA片段命名為Igkappa-iRGD-scFv(G250)(見圖I)。(二)融合基因片段 Igkappa-iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 制備以含有⑶8的跨膜區(qū)和胞內區(qū)及⑶28、⑶137和⑶3 ζ胞內信號結構域編碼序列的質粒 PUC57-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ (CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的 DNA 編碼序列如序列表SEQ ID NO. 7所示)為模板，以引物Ρ6和Ρ7進行PCR擴增，得到長824bp的DNA片段，P7引Λ Xba I的酶切位點。PCR反應條件參照Primer star DNA聚合酶(購自Takara公司)的說明書，反應體系(50ul)如下雙蒸水31.5ul5 X 反應 buffer : IOuldNTP Mix 4ulP6 (IOmM) : IulP7 (IOmM) : IulpUC57-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ (lOOng/ul) 2ulPrimer star DNA 聚合酶0. 5ul將上述PCR產(chǎn)物跑1%瓊脂糖凝膠進行分離，瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收DNA片段。得到編碼⑶8的跨膜區(qū)和胞內區(qū)及⑶28、⑶137和⑶3 ζ胞內信號結構域的DNA片段，命名為⑶8-⑶28-⑶137-⑶3 ζ。以回收得到的Igkappa-iRGD-scFv (G250)和 CD8-CD28-CD137-CD3 ζ DNA 片段為模板，用引物Ρ4和Ρ7進行重疊延伸PCR擴增得到長度1630bp，含有Igkappa信號肽、腫瘤穿透肽iRGD、人源化抗人腎癌抗原G250單鏈抗體、⑶8的跨膜區(qū)和胞內區(qū)及⑶28、⑶137和CD3 ζ 胞內信號結構域的 DNA 片段，命名為 Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ (見圖2)。PCR反應條件參照Primer star DNA聚合酶(Takara公司)的說明書，反應體系(50ul)如下雙蒸水31.5ul5 X 反應 buffer : IOuldNTP Mix 4ulP4 (IOmM) lulP7 (IOmM) lulIgkappa-iRGD-scFv(G250)DNA 片段(lOOng/ul) lulCD8-CD28-CD137-CD3 ζ DNA 片段(lOOng/ul) lulPrimer star DNA 聚合酶0. 5ul(三)將融合基因片段Igkappa-iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 插入慢病毒表達載體pLVX-IRES-ZsGreen將融合基因片段Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 和慢病毒表達載體pLVX-IRES-ZsGreen(購自Clontech公司)用限制性內切酶EcoR I和Xba I雙酶切，具體方法見說明書。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后用瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒進行DNA片段回收。將回收的融合基因片段和載體片段通過T4連接酶(購自Fermentas公司)進行連接。將連接產(chǎn)物轉化E. coli DH5a，37°C培養(yǎng)后挑取單克隆，37°C培養(yǎng)12h后用質粒提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取質粒，具體方法見說明書。提取的質粒經(jīng)限制性內切酶EcoR I和Xba I雙酶切鑒定(見圖4)。將鑒定正確的質粒送華大基因科技有限公司對插入的融合基因片段進行測序，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。將測序結果正確的重組質粒命名為pLVX-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ (見圖3)。實施例2 :嵌合抗原受體 iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 修飾的 T 淋巴細胞的制備
(一)慢病毒的包裝制備用QIAGEN公司的質粒提取試劑盒(Catalog no. 12662)分別提取慢病毒表達質粒pLVX-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 和輔助質粒 psPAX2、pMD2. G。三種質粒以4:3:1的比例用lipo2000轉染試劑(購自Invitrogen公司)進行轉染,具體方法見lipo2000轉染試劑說明書。轉染48小時后，將含有病毒的細胞培養(yǎng)上清吸入EP管中，4°C 2000g離心lOmin，轉移上清至新EP管中，4. 5 μ m濾器過濾后_80°C保存。(二)T淋巴細胞的制備取IOml健康人的新鮮血液，用淋巴細胞分離液(購自Mediatech公司)分離外周血單核細胞。用含有300IU/ml的IL-2、50ng/ml的0KT-3和5%人AB血清(購自Invitrogen
公司)的AM-V培養(yǎng)基(購自Invitrogen公司)誘導培養(yǎng)48h，得到T淋巴細胞。(三)慢病毒感染T淋巴細胞及感染后T淋巴細胞的擴增培養(yǎng)從-80°C取出2ml病毒液，加入終濃度為8 μ g/ml的聚凝胺(購自Sigma公司)，用該病毒液重懸I X IO6個上述誘導培養(yǎng)的T淋巴細胞。將細胞懸液加入24孔板的I個孔中，1000g，32°C，離心Ih0 371，5%0)2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)811后，100(^，321，再次離心Ih0吸棄I. 4ml培養(yǎng)上清，加入I. 4ml新鮮的含有300IU/ml的IL_2、50ng/ml的0KT-3和5%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每2-3天檢測一次細胞濃度，當細胞濃度達到2 X IO6個/ml時，IOOOg, 320C，離心lh。吸取Iml細胞懸液，加入另一個孔中，分別向兩個孔中加入Iml新鮮的含有300IU/ml的IL-2和5%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)基，繼續(xù)擴大培養(yǎng)。如此反復，直至細胞擴增至足夠的用量。(四)免疫熒光觀察嵌合抗原受體iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 在 T淋巴細胞內的表達效率取IX IO6個上述慢病毒感染并擴增的T淋巴細胞，重懸于80 μ I PBS中，加入20 μ IFITC 標記的山羊抗人 IgG，F(xiàn) (ab，)2 抗體(構自 eBioscience)，4°C 孵育 30min，PBS 洗滌細胞兩次，取100 μ I PBS重懸細胞，取細胞懸液制作細胞涂片，用熒光顯微鏡觀察嵌合抗原受體iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ在T淋巴細胞中的表達效率(見圖5、圖6)。實施例三嵌合抗原受體iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修飾的T淋巴細胞的抗腫瘤作用(一)Western Blot檢測人腎癌細胞Ketr_3和人胚腎293細胞G250抗原表達量取對數(shù)生長期的人腎癌Ketr-3細胞和人胚腎293細胞(HEK293)，PBS洗細胞3次，用細胞刮刀刮下細胞，4°C，3000rpm離心5min收集細胞沉淀，加入300ullysis buffer(20mM Tris-HCl，ΡΗ7· 9，150mM NaCl,IOmM KCl，0. 5mMEDTA，0. 5%NP_40，10%Glycerol, I. 5mM MgCl2,0. 5mM PMSF, 2mM DTT，2. 5mM CaCl2)，冰上裂解 lOmin，渦旋振蕩，2min/次，共5次，17000g4°C離心5min，吸取上清。取適量上清液，用鼠抗人G250的單克隆抗體進行Western blot檢測，以Actin為內參。結果顯示G250抗原在Ketr-3細胞內高表達，在HEK293細胞內不表達(見圖7)。(二)Cr51釋放分析檢測嵌合抗原受體修飾的T細胞對腎癌細胞的特異殺傷活性分別收集I X IO6個腎癌細胞Ketr-3 (高表達G250抗原)和人胚腎293細胞，重懸于0. 5ml RPMI 1640培養(yǎng)基中(含有5%人AB血清)，加入3. 7mBq的Na2Cr51O4, 37°C水浴中標記lh，PBS洗滌細胞三次，用上述培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞濃度至5X IO4個/ml。向96孔板中加入標記后的Ketr-3細胞和HEK293細胞，每孔100 μ I。然后按不同效靶比(I: I、3: I、10: I、30:1)加入嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞，37°C共孵育4h。每種細胞設置3個陰性對照孔(自發(fā)釋放，只加100 μ I完全培養(yǎng)基)和3個陽性對照孔[最大釋放，加100 μ I1%ΝΡ-40(ν/ν)]。培養(yǎng)4h后，IOOOg離心培養(yǎng)板lOmin，每孔吸取100 μ I上清在伽馬計數(shù)儀上測定每分鐘放射活性(cpm值)。細胞殺傷活性按以下公式計算細胞殺傷活性(％)=[(實驗組cpm-自發(fā)釋放組cpm) / (最大釋放組cpm-自發(fā)釋放組cpm) ] X 100%。結果顯示嵌合抗原受體修飾的T細胞對人腎癌Ketr-3細胞有顯著的殺傷活性(見圖8)，對HEK 293細胞無明顯殺傷活性(見圖9)。
序列表〈110〉徐州醫(yī)學院<120> 嵌合抗原受體 iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 及其應用<160>7<170>PatentIn Version 3. 2<210>1<211>512<212>PRT〈213〉人工序列〈223〉嵌合抗原受體 iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ〈400〉ICys Arg Asy Asp Lys Gly Pro Asp Cys Asp He Val Met Thr Gln Ser Gln Arg51015Phe Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser He Thr Cys Lys Ala Ser Gln20253035Asn Val Val Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys404550Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr55606570Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Asn Met Gln Ser Glu75808590Asp Leu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly95100105Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly110115120125Ser Gly Glu Gly Ser Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys130135140Leu Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn145150155160
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala165170 175180Ala He Asn Ser Asp Gly Gly He Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val Lys Gly Arg185190 195Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser200205 210 215Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys Ala Arg His Arg Ser Gly Tyr220225 230Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr235240 245 250Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr He Ala Ser Gln Pro Leu255260 265270Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg275280 285Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp He Tyr lie Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys290295 300 305 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val lie Thr Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu310315 320His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His325330 335 340Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly345350 355360Arg Lys Lys Leu Leu Tyr He Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr365370 375Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly380385 390 395Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln400405 410Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp415420 425 430Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg435440 445450Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala455460 465Glu Ala Tyr Ser Glu He Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
470475480485Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu490495500His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg505510<210>2 <211>1536<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈222〉(I)......(1536)〈223〉嵌合抗原受體 iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的融合基因〈400〉2TGCCGCGGCG ACAAGGGCCC CGACTGCGAC ATTGTGATGA CCCAGTCTCA AAGATTCATG60TCCACAACAG TAGGAGACAG GGTCAGCATC ACCTGCAAGG CCAGTCAGAA TGTGGTTTCT120GCTGTTGCCT GGTATCAACA GAAACCAGGA CAATCTCCTA AACTACTGAT TTACTCAGCA180TCCAATCGGT ACACTGGAGT CCCTGATCGC TTCACAGGCA GTGGATCTGG GACAGATTTC240ACTCTCACCA TTAGCMTAT GCAGTCTGAA GACCTGGCTG ATTTTTTCTG TCAACAATAT300AGCAACTATC CGTGGACGTT CGGTGGAGGC ACCAAGCTGG AAATCAAAGG CAGCACCAGC360GGCAGCGGCA AGCCCGGCAG CGGCGAGGGC AGCGACGTGA AGCTCGTGGA GTCTGGGGGA420GGCTTAGTGA AGCTTGGAGG GTCCCTGAAA CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG ATTCACTTTC480AGTAACTATT ACATGTCTTG GGTTCGCCAG ACTCCAGAGA AGAGGCTGGA GTTGGTCGCA540GCCATTMTA GTGATGGTGG TATCACCTAC TATCTAGACA CTGTGAAGGG CCGATTCACC600ATTTCAAGAG ACAATGCCAA GAACACCCTG TACCTGCAAA TGAGCAGTCT GAAGTCTGAG660GACACAGCCT TGTTTTACTG TGCAAGACAC CGCTCGGGCT ACTTTTCTAT GGACTACTGG720GGTCAAGGAA CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA ACCACGACGC CAGCGCCGCG ACCACCAACA780CCGGCGCCCA CCATCGCGTC GCAGCCCCTG TCCCTGCGCC CAGAGGCGTG CCGGCCAGCG840GCGGGGGGCG CAGTGCACAC GAGGGGGCTG GACTTCGCCT GTGATATCTA CATCTGGGCG900CCCCTGGCCG GGACTTGTGG GGTCCTTCTC CTGTCACTGG TTATCACCAG GAGTAAGAGG960AGCAGGCTCC TGCACAGTGA CTACATGAAC ATGACTCCCC GCCGCCCCGG GCCCACCCGC1020AAGCATTACC AGCCCTATGC CCCACCACGC GACTTCGCAG CCTATCGCTC CAAACGGGGC1080AGAAAGMAC TCCTGTATAT ATTCAMCAA CCATTTATGA GACCAGTACA AACTACTCM1140GAGGAAGATG GCTGTAGCTG CCGATTTCCA GAAGMGAAG AAGGAGGATG TGAACTGAGA1200GTGAAGTTCA GCAGGAGCGC AGACGCCCCC GCGTACCAGC AGGGCCAGAA CCAGCTCTAT1260AACGAGCTCA ATCTAGGACG MGAGAGGAG TACGATGTTT TGGACAAGAG ACGTGGCCGG1320GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GCCGCAGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT1380GMCTGCAGA MGATMGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC1440CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC CAAGGACACC1500
TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGC 1536<210>3<211>241<212>PRT〈213〉人工序列〈223〉人源化抗人腎癌抗原G250單鏈抗體
<400>3Asp He Val Met Thr Gln Ser Gln Arg Phe Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg51015Val Ser He Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Ser Ala Val Ala Trp Tyr20253035Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Asn Arg404550Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr55 60 65 70Leu Thr He Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Gln75 80 85 90Tyr Ser Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Gly95 100 105Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Asp Val Lys Leu110 115 120 125Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys130 135 140Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr145 150 155 160Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Ala He Asn Ser Asp Gly Gly He Thr165 170 175 180Tyr Tyr Leu Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys185 190 195Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe200 205 210 215Tyr Cys Ala Arg His Arg Ser Gly Tyr Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly220 225 230Thr Ser Val Thr Val Ser Ser235240<210>4<211>723<212>DNA〈213〉人工序列
〈220〉<221>misc_feature〈222〉(I)......(723)〈223〉編碼人源化抗人腎癌抗原G250單鏈抗體的基因〈400〉4
GACATTGTGA TGACCCAGTC TCAAAGATTC ATGTCCACAA CAGTAGGAGA CAGGGTCAGC 60ATCACCTGCA AGGCCAGTCA GAATGTGGTT TCTGCTGTTG CCTGGTATCA ACAGAAACCA 120GGACAATCTC CTAAACTACT GATTTACTCA GCATCCAATC GGTACACTGG AGTCCCTGAT 180CGCTTCACAG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATTAGCAA TATGCAGTCT 240GAAGACCTGG CTGATTTTTT CTGTCAACAA TATAGCAACT ATCCGTGGAC GTTCGGTGGA 300GGCACCAAGC TGGAAATCAA AGGCAGCACC AGCGGCAGCG GCAAGCCCGG CAGCGGCGAG 360GGCAGCGACG TGAAGCTCGT GGAGTCTGGG GGAGGCTTAG TGAAGCTTGG AGGGTCCCTG 420AAACTCTCCT GTGCAGCCTC TGGATTCACT TTCAGTAACT ATTACATGTC TTGGGTTCGC 480CAGACTCCAG AGAAGAGGCT GGAGTTGGTC GCAGCCATTA ATAGTGATGG TGGTATCACC 540TACTATCTAG ACACTGTGAA GGGCCGATTC ACCATTTCAA GAGACAATGC CAAGAACACC 600CTGTACCTGC MATGAGCAG TCTGAAGTCT GAGGACACAG CCTTGTTTTA CTGTGCAAGA 660CACCGCTCGG GCTACTTTTC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT CACCGTCTCC 720TCA 723<210>5<211>9<212>PRT〈213〉人工序列〈223〉腫瘤穿透肽iRGD<400>5Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys5<210>6<211>262<212>PRT〈213〉人工序列〈223〉CD8-CD28-CD137-CD3 ζ<400>6Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr He Ala Ser Gln51015Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His20253035Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp He Tyr He Trp Ala Pro Leu Ala Gly404550Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val He Thr Arg Ser Lys Arg Ser Arg
55606570Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg75808590
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys95100105Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr He Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val110115120125Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu130135140Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr145150155160Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu165170175180Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro185190195Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys200205210215Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu He Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys220225230Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp235240245250Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg255260<210>7<211>840<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈222〉(I)......(840)〈223〉編碼 CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的融合基因<400>7ACCACGACGC CAGCGCCGCG ACCACCAACA CCGGCGCCCA CCATCGCGTC GCAGCCCCTG 60TCCCTGCGCC CAGAGGCGTG CCGGCCAGCG GCGGGGGGCG CAGTGCACAC GAGGGGGCTG 120GACTTCGCCT GTGATATCTA CATCTGGGCG CCCCTGGCCG GGACTTGTGG GGTCCTTCTC 180CTGTCACTGG TTATCACCAG GAGTAAGAGG AGCAGGCTCC TGCACAGTGA CTACATGAAC 240ATGACTCCCC GCCGCCCCGG GCCCACCCGC AAGCATTACC AGCCCTATGC CCCACCACGC 300
GACTTCGCAG CCTATCGCTC CAAACGGGGC AGAAAGAAAC TCCTGTATAT ATTCAAACAA 360
CCATTTATGA GACCAGTACA AACTACTCAA GAGGAAGATG GCTGTAGCTG CCGATTTCCA 420GAAGAAGAAG AAGGAGGATG TGAACTGAGA GTGAAGTTCA GCAGGAGCGC AGACGCCCCC 480GCGTACCAGC AGGGCCAGAA CCAGCTCTAT AACGAGCTCA ATCTAGGACG AAGAGAGGAG 540TACGATGTTT TGGACAAGAG ACGTGGCCGG GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GCCGCAGAGA 600AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA AAGATAAGAT GGCGGAGGCC 660TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC 720CAGGGTCTCA GTACAGCCAC CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC 780CCTCGC 840
權利要求
1.一種嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ，其特征在于該嵌合抗原受體由腫瘤穿透肽iRGD、人源化抗人腎癌抗原G250的單鏈抗體、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及⑶28、⑶137、⑶3的胞內信號結構域依次串聯(lián)構成。
2.如權利要求I所述的嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ，其特征在于該嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所示。
3.如權利要求I所述的嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ，其特征在于該嵌合抗原受體含有針對人腎癌抗原G250的人源化單鏈抗體，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示。
4.如權利要求I所述的嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ，其特征在于該嵌合抗原受體的氨基末端含有一個具有腫瘤穿透功能的iRGD肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 5所示。
5.如權利要求I所述的嵌合抗原受體iRGD-scFv(G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ，其特征在于該嵌合抗原受體以⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、⑶28、⑶137、⑶3的胞內信號結構域串聯(lián)而成的結構域為信號傳導結構，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示。
6.權利要求I所述的嵌合抗原受體的用途，該嵌合抗原受體的編碼基因能夠被轉移至T淋巴細胞內，表達該嵌合抗原受體的T淋巴細胞能夠單獨用于治療腎癌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物與新醫(yī)藥技術領域。公開了一種嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor,CAR)iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ及其應用。該嵌合抗原受體由腫瘤穿透肽iRGD、人源化抗人腎癌抗原G250的單鏈抗體、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD28、CD137、CD3ζ的胞內信號結構域串聯(lián)構成。該嵌合抗原受體可用于修飾T淋巴細胞。修飾后的T淋巴細胞可用于腎癌治療。
文檔編號A61P35/00GK102775500SQ20121027567
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權日2012年8月3日
發(fā)明者張寶福, 張青, 方琳, 李慧忠, 李連濤, 楊潔, 程乾, 章龍珍, 裴冬生, 趙鐵鎖, 鄭駿年 申請人:鄭駿年