用于常溫等溫核酸大片段體外擴(kuò)增的蛋白酶及擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的一項(xiàng)新應(yīng)用，涉及利用多個(gè)工程酶和相應(yīng)化學(xué)輔助 成分的相互協(xié)同作用，在常溫且恒定溫度下，對長片斷核酸實(shí)現(xiàn)體外的快速擴(kuò)增，從而使該 方法今后可被廣泛應(yīng)用于測序、環(huán)狀質(zhì)粒擴(kuò)增，甚至于全基因組擴(kuò)增等領(lǐng)域當(dāng)中。
【背景技術(shù)】
[0002]自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)實(shí)現(xiàn)了體外核酸擴(kuò)增之后，科學(xué)家們一直致力于在體外 獲取更長的核酸片斷，期望能對具有完整功能的編碼基因進(jìn)行更深入的研宄，例如蛋白表 達(dá)研宄、結(jié)構(gòu)研宄等。或者獲取某種特定物種的全基因組序列，以便能解碼出更多有用的信 息，從而推動生物學(xué)各領(lǐng)域的快速和深入發(fā)展。由于PCR是基于高溫變性原理打開DNA雙鏈 從而獲得單鏈模板，但其中的TaqDNA聚合酶最適反應(yīng)溫度為60-80度之間，高溫（>90度） 會使其DNA合成活性折損（例如95度溫育40分鐘后，僅保持50 %的活性），因此在變溫環(huán) 境下進(jìn)行核酸體外擴(kuò)增時(shí)，PCR能否成功獲得完整長片斷，在很大程度上取決于DNA聚合酶 的催化活性、持續(xù)合成能力、校對能力和延伸效率等諸多因素?；诖?，目前對TaqDNA聚 合酶多采用以下幾種方式進(jìn)行基因工程改造，例如熱啟動Taq酶，通過抑制其低溫下活性， 從而避免在反應(yīng)初始產(chǎn)生的少量非特異性擴(kuò)增對后續(xù)目標(biāo)序列擴(kuò)增的影響；或者通過獲得 高耐熱Taq酶，增強(qiáng)其在高溫下半衰期，從而提高其催化活性；或混合幾種功能各異的DNA 聚合酶以提高PCR反應(yīng)在超長片斷擴(kuò)增中的能力。
[0003]雖然通過以上幾種策略，PCR在長片斷擴(kuò)增方面也取得不錯(cuò)的進(jìn)展，但是復(fù)雜的反 應(yīng)體系優(yōu)化過程還是使科研工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近些年出現(xiàn)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)為體外核酸擴(kuò) 增指出了一條新出路，它們不再僅僅局限于使用TaqDNA聚合酶，而是開始采用不同的酶， 例如具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，或是多個(gè)功能迥異的酶相互組合，從而在等溫條件 下去實(shí)現(xiàn)核酸的有效擴(kuò)增。然而，一方面由于各自反應(yīng)原理的不同，另一方面由于多以現(xiàn)場 快速檢測為主要研宄目的，當(dāng)前成熟的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)仍多以擴(kuò)增短小核酸片斷為主。 當(dāng)然其中也有例外，例如滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（RCA)曾利用phi29DNA聚合酶和多條核酸酶抗性的 隨機(jī)引物，從小于10個(gè)人類細(xì)胞里精確擴(kuò)增出平均產(chǎn)物長度超過l〇kb的DNA，一定程度上 實(shí)現(xiàn)了常溫全基因組DNA檢測。但是因使用隨機(jī)引物，所以獲得的產(chǎn)物是長度不一的模板 串聯(lián)重復(fù)雙鏈DNA。此外，依賴解旋酶DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（HDA)經(jīng)過技術(shù)改進(jìn)后，利用17噬 菌體復(fù)制系統(tǒng)建立了一種可同時(shí)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增完整質(zhì)粒及長目標(biāo)片斷的方法，cHDA法。雖然該 方法可在室溫（25度）下完成長達(dá)10kb的插入序列擴(kuò)增，但是所需反應(yīng)時(shí)間較長（一般為 6小時(shí)），而且cHDA只能擴(kuò)增環(huán)狀DNA，不能擴(kuò)增線性DNA，因而使其應(yīng)用面受到一定局限。
[0004]當(dāng)前，對特定長度的長目標(biāo)片斷的擴(kuò)增主要是依賴PCR技術(shù)，長時(shí)間的前期體系 優(yōu)化過程給科研工作增加了很多工作量。此外，重組質(zhì)粒的獲取總需要經(jīng)過轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)和提 取等繁瑣的步驟，才能在體外實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的大量積累；如能以更快的方式實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒的復(fù) 制將會節(jié)省大量的工作時(shí)間，并簡化已有的實(shí)驗(yàn)流程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種能在體外、在常溫等溫條件下快速實(shí)現(xiàn)長片斷核酸擴(kuò)增的蛋 白酶及新的擴(kuò)增方法。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供用于常溫等溫核酸大片段體外擴(kuò)增的蛋白酶。
[0007]用于常溫等溫核酸大片段體外擴(kuò)增的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶包括：（1) 重組酶；（2)單鏈結(jié)合蛋白；（3)DNA聚合酶；（4)輔助蛋白；所述重組酶的氨基酸序列如SEQ IDNo. 35所示；單鏈結(jié)合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 36所示；DNA聚合酶的氨基酸序 列如SEQIDNo. 37所示；輔助蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 38所示。
[0008] 進(jìn)一步地，在擴(kuò)增體系中，重組酶濃度范圍是0. 5~0. 8mg/ml;單鏈結(jié)合蛋白濃 度范圍是0? 9~1. 2mg/ml;DNA聚合酶濃度范圍是0? 3~0? 6mg/ml;輔助蛋白濃度范圍是 0? 1 ~0? 3mg/ml〇
[0009] 所述蛋白酶還包括：（5)拓?fù)洚悩?gòu)酶或解旋酶；拓?fù)洚悩?gòu)酶的氨基酸序列如SEQ IDNo. 39 ;解旋酶的氨基酸序列如SEQIDNo. 40所示。
[0010] 在擴(kuò)增體系中，拓?fù)洚悩?gòu)酶濃度范圍是〇. 1~〇. 5U/ul;解旋酶濃度范圍是0. 1~ 0.5U/ul〇
[0011]本發(fā)明所述的常溫等溫，是指在某一恒定溫度下進(jìn)行孵育，溫度較低為37°c，接近 常溫，并且是均一恒定的溫度。
[0012] 上述蛋白酶（工程酶）是多個(gè)經(jīng)過基因改造，并且具有高純度和高活力的蛋白酶， 具有以下特點(diǎn)：1)包括4或5種功能各異的蛋白酶，分別是重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合 酶、輔助蛋白和拓?fù)洚悩?gòu)酶或解旋酶；2)所有蛋白酶都來源于自然界，后經(jīng)過重組、發(fā)酵、 細(xì)胞破碎、純化和酶活力測定等步驟生產(chǎn)獲得；3)重組酶，負(fù)責(zé)與引物形成起始復(fù)合物，在 體系中的最適濃度范圍是0. 5~0. 8mg/ml;4)單鏈結(jié)合蛋白，負(fù)責(zé)結(jié)合DNA模板的單鏈，幫 助形成局部氣泡區(qū)，以便起始復(fù)合物在打開的單鏈區(qū)進(jìn)行匹配區(qū)域的掃描，在體系中的最 適濃度范圍是0. 9~1. 2mg/ml;5)DNA聚合酶，因具有鏈置換活性，故在擴(kuò)增過程中除負(fù)責(zé) 從引物的3'端延伸并合成新子鏈外，還負(fù)責(zé)用新子鏈替代其中的一條母鏈，與另一條母鏈 形成雙鏈，在體系中的最適濃度范圍是〇. 3~0. 6mg/ml;6)輔助蛋白，幫助起始復(fù)合物以適 當(dāng)?shù)慕Y(jié)合力更好地與DNA單鏈親和，既能實(shí)現(xiàn)掃描，也能在找到匹配區(qū)域后讓重組酶和引 物很好的脫離，在體系中的最適濃度范圍是〇. 1~〇. 3mg/ml;7)拓?fù)洚悩?gòu)酶，在擴(kuò)增過程中 幫助打開DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，在體系中屬于可選添加組分，其最適濃度范圍是0. 1~0.5UM; 8)解旋酶，可協(xié)助單鏈結(jié)合蛋白更好地打開DNA雙鏈，也是可選添加組分。
[0013] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于常溫等溫核酸大片段體外擴(kuò)增的試劑。
[0014] 用于常溫等溫核酸大片段體外擴(kuò)增的試劑，其特征在于，所述試劑主要包括Tris 堿、dNTP、ATP、磷酸肌酸二鈉鹽、磷酸肌酶、乙酸鉀、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、二硫蘇糖醇 和蛋白酶，所述蛋白酶包括：（1)重組酶；（2)單鏈結(jié)合蛋白；（3)DNA聚合酶；（4)輔助蛋白； 優(yōu)選還包括（5)拓?fù)洚悩?gòu)酶或解旋酶。
[0015] 所述試劑為凍干粉，各組分在凍干粉中的濃度為：Tris堿20~30mM，dNTP200~ 250uM，ATP2~3mM，磷酸肌酸二鈉鹽45~55mM，磷酸肌酶90~110ng/y1，乙酸鉀90~ 110mM，海藻糖5. 5~6. 5%，甘露醇6~10%，聚乙二醇2~3%，二硫蘇糖醇4~6mM，重 組酶0. 5~0. 8mg/ml，單鏈結(jié)合蛋白0. 9~1. 2mg/ml，DNA聚合酶0. 3~0. 6mg/ml，輔助蛋 白0. 1~0. 3mg/ml，拓?fù)洚悩?gòu)酶0. 1~0. 5U/ul，解旋酶0. 1~0. 5U/ul;所述凍干粉由以 下方法制成：現(xiàn)在將試劑在-30~_35°C下冷凍干燥4-10小時(shí)，再0~20°C干燥30分鐘~ 1小時(shí)。
[0016] 用于常溫等溫核酸大片段體外擴(kuò)增試劑中的各種化學(xué)組分，是一系列為反應(yīng)提 供最適緩沖環(huán)境的化學(xué)成分，具有以下特點(diǎn)：1)各組分在體系中的功能各不相同，或提供 反應(yīng)所需原料，例如脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP);或?yàn)榉磻?yīng)提供能量，例如三磷酸腺苷 (ATP)、磷酸肌酸二鈉鹽（PCr)和磷酸肌酶（CK);或者提供合適鹽濃度，例如乙酸鉀（KAc); 或保證冷凍干燥過程中組分活性不受折損，例如海藻糖（Trehalose)、甘露醇（Mannitol) 和聚乙二醇（PEG) ;2)各反應(yīng)組分在凍干體系中的最適濃度分別是：PEG2~3%、Tris堿 20 ~30mM、KAc90 ~110mM、DTT(二硫蘇糖醇）4 ~6mM、ATP2 ~3mM、PCr45 ~55mM、CK 90~110叩/111、(1階13 200~250碰、海藻糖5.5~6.5%、甘露醇6~10%。
[0017] 擴(kuò)增時(shí)間冷凍干燥過程，是一種將反應(yīng)體系進(jìn)行低溫干化處理的流程，具有以下 特點(diǎn)：1)包括主干燥和再干燥兩步驟，主干燥是-30~-35°c，4~10小時(shí)，再干燥是0~ 20°C，30分鐘~1小時(shí)；2)每步的實(shí)際溫度與時(shí)長取決于每次凍干的樣品總量；3)處理后 的反應(yīng)體系可在常溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，不會引發(fā)任何檢測效力的折損或降低；4)凍干處理 后的反應(yīng)樣品是白色干粉狀，無任何粘性物質(zhì)附著于管壁，當(dāng)用緩沖液重懸后，能完全溶 解，無任何明顯顆粒狀物質(zhì)存在；5)凍干后反應(yīng)體系的檢測活力可維持半年。
[0018] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種常溫等溫核酸大片段體外擴(kuò)增方法。
[0019] 一種常溫等溫核酸大片段體外擴(kuò)增方法，其特征在于，所述擴(kuò)增方法是用所述擴(kuò) 增試劑加入模板和擴(kuò)增引物后，置于一溫控設(shè)備中孵育30分鐘到4小時(shí)，再通過瓊脂糖凝 膠電泳進(jìn)行可視化檢測；所述常溫的溫度為37°C，擴(kuò)增過程中保持均一恒定溫度。所述試 劑主要包括Tris堿、dNTP、ATP、磷酸肌酸二鈉鹽、磷酸肌酶、乙酸鉀、海藻糖、甘露醇、聚乙 二醇、二硫蘇糖醇和蛋白酶，所述蛋白酶包括：⑴重組酶；（2)單鏈結(jié)合蛋白；（3)DNA聚合 酶；(4)輔助蛋白；優(yōu)選還包括（5)拓?fù)洚悩?gòu)酶或解旋酶。
[0020] 本發(fā)明所述溫控設(shè)備是為反應(yīng)提供合適溫育環(huán)境的儀器，具有溫度控制模塊、時(shí) 間設(shè)置功能和樣品孔。例如金屬浴、水浴鍋、孵育箱或其它小型便攜式溫育設(shè)備等。
[0021] 本發(fā)明具有以下技術(shù)特點(diǎn)：
[0022] 1)本發(fā)明利用多個(gè)工程酶和相應(yīng)化學(xué)輔助成分的相互協(xié)同作用可實(shí)現(xiàn)常溫等溫 條件下特異性擴(kuò)增：可在常溫恒定溫度條件（例如37°C)下，通過擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳 后，可在膠圖的特定位置處觀察到一條特異、明亮的條帶。其明亮程度足以與其它非特異性 擴(kuò)增條帶區(qū)別。
[0023] 2)快速簡單：針對3kb以下長片斷，溫育40分鐘足以；擴(kuò)增大于3kb的核酸片斷， 需要40分鐘到4小時(shí)為宜。
[0024] 3)高保真性：由于是最大程度模擬生物體內(nèi)核酸擴(kuò)增的情況，在擴(kuò)增過程中的錯(cuò) 配率非常低，應(yīng)小于l/l〇〇〇〇kb。
[0025] 4)適合難擴(kuò)樣本：針對難擴(kuò)增序列，例如高GC含量或高AT含量的樣本，本發(fā)明的 擴(kuò)增方法具有一定優(yōu)勢。
[0026] 5)本發(fā)明的擴(kuò)增方法在常溫且恒定溫度下，對長片斷核酸實(shí)現(xiàn)體外的快速擴(kuò)增， 可被廣泛應(yīng)用于測序、環(huán)狀質(zhì)粒擴(kuò)增，甚至于全基因組擴(kuò)增等領(lǐng)域當(dāng)中。
【附圖說明】
[0027] 圖1是1~0_1.6kb核酸片斷擴(kuò)增圖。圖中，泳道1產(chǎn)物大小是1132bp，泳道2產(chǎn) 物大小是1246bp，泳道3產(chǎn)物大小是1346bp，泳道4產(chǎn)物大小是1446bp，泳道5產(chǎn)物大小是 1550bp，泳道6是正對照，其大小為lOOObp，M是DNA標(biāo)記物。
[0028] 圖2是1.6~2.0kb核酸片斷擴(kuò)增圖。圖中，泳道1產(chǎn)物大小是1636bp，泳道2產(chǎn) 物大小是1739bp，泳道3產(chǎn)物大小是1823bp，泳道4產(chǎn)物大小是1950bp，泳道5產(chǎn)物大小是 2020bp，泳道6是正對照，其大小為1550bp，M是DNA標(biāo)記物。
[0029] 圖3是2. 0~3. 4kb核酸片斷擴(kuò)增圖。圖中，泳道1產(chǎn)物大小是2134bp，泳道2產(chǎn) 物大小是2220bp，泳道3產(chǎn)物大小是2350bp，泳道4產(chǎn)物大小是2435bp，泳道5產(chǎn)物大小是 2548bp，泳道6產(chǎn)物大小是2505bp，泳道7產(chǎn)物大小是2761bp，泳道8產(chǎn)物大小是3053bp， 泳道9產(chǎn)物大小是3364bp，泳道10產(chǎn)物大小是2476bp，泳道11產(chǎn)物大小是2768bp，泳道 12產(chǎn)物大小是3080bp，泳道13產(chǎn)物大小是2641bp，M是DNA標(biāo)記物。
[0030] 圖4是1.0~3. 3kb核酸片斷擴(kuò)增圖（凍干后反應(yīng)體系）。圖中，泳道1產(chǎn)物大 小是1132bp，泳道2產(chǎn)物大小是1246bp，泳道3產(chǎn)物大小是1346bp，泳道4產(chǎn)物大小是 1446bp，泳道5產(chǎn)物大小是1550bp，泳道6產(chǎn)物大小是1636bp，泳道7產(chǎn)物大小是1739bp， 泳道8產(chǎn)物大小是1823bp，泳道9產(chǎn)物大小是1950bp，泳道10產(chǎn)