具有改變的糖基化和降低的效應(yīng)物功能的包含fc的多肽的制作方法
【專利說明】具有改變的糖基化和降低的效應(yīng)物功能的包含F(xiàn)C的多肽
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求保護(hù)2012年9月12日提交的國際申請?zhí)枮镻CT/EP2012/003819,名稱 為"抗a0TCR抗體"的申請和2013年3月11日提交的美國臨時(shí)申請61/776, 715,名稱為 "具有改變的糖基化和降低的效應(yīng)物功能的包含F(xiàn)c的多肽"的申請的優(yōu)先權(quán)。
[0003] 本申請還與2013年3月11日提交的名稱為"通過糖基工程化的位點(diǎn)特異性抗體 藥物偶聯(lián)"的美國臨時(shí)申請61/776, 724、2013年3月11日提交的名稱為"高度糖基化的結(jié) 合多肽"的美國臨時(shí)申請61/776, 710相關(guān)。前文提到的申請的內(nèi)容在本文通過提述以其全 文并入。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 具有降低或消除的Fc糖基化的抗體已被用于炎癥和自身免疫性疾病或病癥的治 療以降低與不需要的效應(yīng)物功能相關(guān)的副作用或毒性（參見例如，ChanandCarter，Nat. ReviewsImmunology, 2010)。但是，抗體Fc結(jié)構(gòu)域糖基化對于抗體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能至 關(guān)重要且糖基化可導(dǎo)致抗體具有較差的生物物理特性。相應(yīng)地，本領(lǐng)域?qū)哂薪档偷男?yīng) 物功能但仍保留理想的糖基化的Fc結(jié)構(gòu)域特性的工程化的結(jié)合蛋白存在著需求。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本公開通過提供包含具有改變的糖基化和降低的效應(yīng)物功能的Fc結(jié)構(gòu)域的結(jié)合 多肽（例如，抗體或融合物）和任選的其藥物偶聯(lián)物改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)。在具體的實(shí)施方案 中，所述Fc結(jié)構(gòu)域包含：根據(jù)EU編號在氨基酸位點(diǎn)298的天冬酰胺殘基；和根據(jù)EU編號在 氨基酸位點(diǎn)300的絲氨酸或蘇氨酸殘基。本公開還提供編碼抗原-結(jié)合多肽的核酸、用于 制造這種抗原-結(jié)合多肽的重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。還提供使用本文公開的抗原-結(jié)合 多肽來治療疾病的方法。
[0008] 發(fā)明人還驚訝地發(fā)現(xiàn)本公開的結(jié)合多肽（例如，抗體）展示改變的糖基化概貌，其 優(yōu)勢在于消除了結(jié)合多肽與FcY受體的結(jié)合，進(jìn)而改變結(jié)合多肽的效應(yīng)物功能，同時(shí)保留 糖基化賦予的理想的生物物理特性。此外，在氨基酸位點(diǎn)298的工程化的N-連接糖基化位 點(diǎn)也可用作用于效應(yīng)物部分偶聯(lián)的位點(diǎn)（如細(xì)胞毒性藥物）。
[0009] 相應(yīng)地，一方面本發(fā)明提供分離的結(jié)合多肽，其包含具有改變的糖基化的Fc結(jié)構(gòu) 域，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域包含：根據(jù)EU編號在氨基酸位點(diǎn)298的天冬酰胺殘基；以及根據(jù)EU 編號在氨基酸位點(diǎn)300的絲氨酸或蘇氨酸，且其中所述結(jié)合多肽由于所述改變的糖基化展 示降低的效應(yīng)物功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽在根據(jù)EU編號的氨基酸位點(diǎn)299 進(jìn)一步包含丙氨酸殘基。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽在根據(jù)EU編號的氨基酸位點(diǎn) 297進(jìn)一步包含谷氨酰胺殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)構(gòu)域是IgGlFc結(jié)構(gòu)域。在 另一實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)構(gòu)域是人的。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天冬酰胺殘基的側(cè)鏈與聚糖通過e-糖基酰胺連接基連 接。在另一實(shí)施方案中，所述聚糖是雙觸角聚糖。在另一實(shí)施方案中，所述具糖是天然存在 的哺乳動(dòng)物糖形。
[0011] 在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽與具有天然Fc結(jié)構(gòu)域的結(jié)合多肽相比具有對 于Fey受體較低的親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fey受體是FcyRI和/或FcyRIIIa。 在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽具有與具有天然Fc結(jié)構(gòu)域的結(jié)合多肽對于FcRn受體相 似的親和力。
[0012] 在另一實(shí)施方案中，所述聚糖包含具有反應(yīng)性的醛基。在另一實(shí)施方案中，所述聚 糖包括包含具有反應(yīng)性的醛基的氧化的糖類殘基。在另一實(shí)施方案中，所述氧化的糖類殘 基是末端唾液酸或半乳糖。
[0013] 在另一實(shí)施方案中，所述聚糖與效應(yīng)物部分連接。在另一實(shí)施方案中，所述效應(yīng)物 部分是細(xì)胞毒素。在另一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒素選自列于表1的細(xì)胞毒素組。在另一實(shí) 施方案中，所述效應(yīng)物部分是檢測劑。在另一實(shí)施方案中，所述效應(yīng)物部分與聚糖的糖類殘 基通過肟或腙連接基連接。在另一實(shí)施方案中，所述糖類殘基是聚糖的末端唾液酸或半乳 糖殘基。在另一實(shí)施方案中，所述效應(yīng)物部分包括pH-敏感的接頭、二硫化物接頭、酶-敏 感的接頭或其它可裂解的接頭部分。在另一實(shí)施方案中，所述效應(yīng)物部分包括選自表2或 14中描述的接頭部分的組的接頭部分。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽是抗體或免疫粘附素。
[0015] 另一方面，本發(fā)明提供了分離的結(jié)合多肽，其包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域 包含：根據(jù)EU編號在氨基酸位點(diǎn)298的游離的天冬酰胺殘基；和根據(jù)EU編號在氨基酸位點(diǎn) 300的游離的絲氨酸或蘇氨酸殘基。
[0016] 另一發(fā)面，本發(fā)明提供了分離的結(jié)合多肽，其包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域包 含：根據(jù)EU編號在氨基酸位點(diǎn)298的修飾的天冬酰胺殘基；和根據(jù)EU編號在氨基酸位點(diǎn) 300的游離的絲氨酸或蘇氨酸殘基。
[0017] 在另一實(shí)施方案中，所述效應(yīng)物部分與聚糖的糖類殘基通過修飾的天冬酰胺殘基 的側(cè)鏈連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖類是聚糖的末端唾液酸或半乳糖殘基。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述效應(yīng)物部分與聚糖的糖類殘基通過肟或腙連接基連接。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述糖類是聚糖的末端唾液酸或半乳糖殘基。在另一實(shí)施方案中，所述修飾的天冬酰胺殘 基與藥物效應(yīng)物部分連接以形成抗體藥物偶聯(lián)物（ADC)。
[0018] 在另一實(shí)施方案中，組合物包含在先權(quán)利要求任一項(xiàng)的結(jié)合多肽和藥學(xué)上可接受 的載劑或賦形劑。
[0019] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療患者的方法，包括施用有效量的本發(fā)明的組 合物。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的結(jié)合多肽的分離的多核苷酸。另一發(fā)面，本發(fā) 明提供包含所述多核苷酸的載體或包含所述多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。
[0021] 又另一方面，本發(fā)明提供了一種制造結(jié)合多肽的方法，其包括在細(xì)胞中表達(dá)所述 多核苷酸或所述載體。
[0022] 附圖簡述
[0023] 圖1是抗體藥物偶聯(lián)物合成的簡要說明，其中毒素部分與抗體聚糖的氧化唾液酸 殘基使用肟連接基相連。
[0024] 圖2是展示糖基化突變體的表達(dá)和純化的考馬斯藍(lán)染色凝膠。
[0025] 圖3描繪表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用以評估a0TCRHEBEIIgG抗體突變 體與重組人FcyRllla的結(jié)合（V158&F158)。
[0026] 圖4描繪表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用以評估a0TCRHEBEIIgG抗體突變 體與重組人FcyRI的結(jié)合。
[0027] 圖5描繪在突變抗a0TCR抗體存在下來自PBMC的關(guān)于TNFa、GM-CSF、IFNy和 IL10的細(xì)胞因子釋放概貌（第2天）。
[0028] 圖6描繪在突變抗a0TCR抗體存在下來自PBMC的關(guān)于IL6、IL4和IL2的細(xì)胞 因子釋放概貌（第2天）。
[0029] 圖7描繪在突變抗a0TCR抗體存在下來自PBMC的關(guān)于TNFa、GM-CSF、IFNy和 IL10的細(xì)胞因子釋放概貌（第4天）。
[0030] 圖8描繪在突變抗a0TCR抗體存在下來自PBMC的關(guān)于IL6、IL4和IL2的細(xì)胞 因子釋放概貌（第4天）。
[0031] 圖9描繪通過免疫印跡分析和表面等離子體共振研宄2C3突變體表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。
[0032] 圖10描繪PNGaseF治療之前和之后對2C3突變體糖基化進(jìn)行研宄的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0033] 圖11描繪對分離自細(xì)胞培養(yǎng)的2C3突變體上的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行研宄的SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0034] 圖12描繪用以評估修飾的抗⑶52與重組人Fc丫RIIIa(V158)結(jié)合的表面等離子 體共振實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用在Fc結(jié)構(gòu)域中包含S298N/Y300S突變的抗CD52來評估修飾的分子 與CD52肽（A)結(jié)合、與FcYRIIIa(V158，B)結(jié)合，和對照與小鼠FcRn(C)結(jié)合的效應(yīng)物功 能。
[0035] 圖13描繪對2C3突變體的Fc結(jié)合特性進(jìn)行研宄的表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0036]圖 14 描繪對修飾的抗CD52 與FeyRIIIa(Vall58)(如上）和FeyRIIIa(Phel58) 結(jié)合進(jìn)行研宄的表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用在Fc結(jié)構(gòu)域中包含S298N/Y300S突變的 抗CD52抗體來評估修飾的分子與FeyRIIIa(Vall58,圖14A)和FeyRIIIa(Phe58,圖14B) 結(jié)合的效應(yīng)物功能。
[0037] 圖15描繪對S298N/Y300S突變體和野生型2C3對照中Clq結(jié)合的分析（A)，以及 確認(rèn)孔的等同包被的Eliza分析結(jié)果。
[0038] 圖16描繪測量2C3突變體與CD-52肽741結(jié)合動(dòng)力學(xué)的表面等離子體共振實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。
[0039] 圖17描繪比較野生型抗⑶-52 2C3和A114N高度糖基化突變體抗原結(jié)合親和力 的表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0040]圖18描繪測定2C3突變體的聚糖含量的等電子聚焦以及質(zhì)譜電荷標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)的結(jié) 果。
[0041] 圖19描繪濃度（八等分）和比較野生型抗⑶-52 2C3和突變體的抗原結(jié)合親和 力的等離子共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0042] 圖20描繪測定抗TME1A114N突變體的葡聚糖含量的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0043] 圖21描繪A114N抗Her2突變體的SDS-PAGE和疏水相互作用色譜分析的結(jié)果。
[0044] 圖22描繪證明PEG與2C3A114N突變體通過氨基氧基連接基偶聯(lián)的SDS-PAGE實(shí) 驗(yàn)結(jié)果。
[0045] 圖23描繪測定抗TEM1A114N高度糖基化突變體的葡聚糖含量的LC-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0046] 圖24描繪測定野生型HER2抗體和A114N抗Her-2高度糖基化突變體的葡聚糖含 量的LC-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0047] 圖25描繪根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)施抗體的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的典型方法。
[0048] 圖26描繪本發(fā)明的如下典型效應(yīng)物部分的合成：氨基氧 基-Cys-MC-VC-PABC-MMAE和氨基氧基-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-DollO。
[0049] 圖27描繪唾液酸化的HER2抗體的表征信息。
[0050] 圖28描繪氧化的唾液酸化的抗HER2抗體的表征信息。
[0051] 圖29描繪用三種不同的唾液酸化抗體以兩種不同的氨基氧基基團(tuán)制備的糖基偶 聯(lián)物的疏水相互作用色譜。
[0052] 圖30展示使用GAM⑴化學(xué)制備的具有A0-MMAE的抗Her2A114糖基化突變體偶 聯(lián)物的HIC色譜。
[0053] 圖31描繪抗HER2糖基偶聯(lián)物和巰基偶聯(lián)物在體外的效力比較。
[0054] 圖32描繪抗FAPB11糖基偶聯(lián)物和巰基偶聯(lián)物在體外的效力比較。
[0055] 圖33描繪抗HER2糖基偶聯(lián)物和巰基偶聯(lián)物在Her2+腫瘤細(xì)胞異種移植模型中的 體內(nèi)效力的比較。
[0056] 圖34描繪測定包含S298N/Y300S突變的突變抗a0TCR抗體的葡聚糖含量的 LC-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0057] 圖35描繪確定野生型抗a0TCR抗體和包含S298N/Y300S突變的突變抗a0TCR 抗體的相對熱穩(wěn)定性的圓二色實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0058] 圖36描繪用帶有A114N高度糖基化突變的抗HER抗體和A0-MMAE制備的ADC的 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0059]