一種在蛋白質(zhì)上修飾烯酰基團的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)分子的化學修飾方法，具體涉及一種在蛋白質(zhì)上修飾烯酰基團的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]化學修飾是一種重要的設(shè)計蛋白質(zhì)的手段。迄今為止，已有多種蛋白質(zhì)被修飾后在臨床應用中顯示出優(yōu)良性質(zhì)，如:物理和熱穩(wěn)定性增強，化學性質(zhì)變化，對酶降解敏感程度的降低，溶解度的增大，在體內(nèi)循環(huán)半衰期、清除時間的增長，免疫原性和抗原性的降低及毒性的減小等。修飾蛋白在肽類和非肽類藥物、免疫學、診斷學和生物催化等諸多領(lǐng)域得到越來越廣泛的應用。經(jīng)過化學修飾及修飾的蛋白質(zhì)不僅較高的維持蛋白質(zhì)的生物活性，而且能夠有效的克服蛋白質(zhì)免疫原性和毒性方面的缺點；同時賦予蛋白質(zhì)一些新的優(yōu)良性能。蛋白質(zhì)的化學修飾技術(shù)主要是蛋白質(zhì)的氨基酸殘基修飾技術(shù)，是通過化學試劑對蛋白質(zhì)肽鏈上的特定活性基團衍生化，使部分肽鍵斷裂或引入各種功能基團，包括對氨基酸殘基的酰化、去酰胺、磷酸化、糖基化、共價交聯(lián)、水解以及氧化等。蛋白質(zhì)肽鏈上的活性基團主要有氨基、羥基、巰基等，化學修飾的本質(zhì)是通過新基團的引入而改變蛋白質(zhì)的化學性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、構(gòu)象以及凈電荷、疏水性等，從而改善其功能性質(zhì)，如反應特性、溶解性、表面性質(zhì)、吸水性、凝膠性以及熱穩(wěn)定性等。
[0003]—般地說，選擇蛋白質(zhì)修飾劑要綜合考慮如下問題:蛋白質(zhì)的種類和修飾位點，修飾劑對氨基酸殘基的專一性如何;期望的修飾度是多少，在給定的操作條件下，反應是否可逆;修飾劑的水解穩(wěn)定性和反應活性，修飾劑后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本保持不變;修飾后是否需要進一步分離;是否適合于建立快速、方便、準確的分析方法;修飾劑的合成是否簡便經(jīng)濟，修飾劑是否價廉易得等。
[0004]目前報道較多的是PEG?；揎椀鞍踪|(zhì)，如姜忠義等在蛋白質(zhì)的化學修飾研究進展，《現(xiàn)代化工》第21卷第8期報道蛋白質(zhì)的PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯類的修飾。目前尚未見在蛋白質(zhì)分子上修飾不飽和碳碳雙鍵;而且目前報道的蛋白質(zhì)?；磻獥l件苛刻，后處理復雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明第一個目的是提供一種廉價、快速、反應條件易于控制、反應程度高、修飾效果顯著的蛋白質(zhì)修飾方法;本發(fā)明的另一目的是首次提供一種在蛋白質(zhì)上修飾烯酰基團的方法，實現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子上修飾不飽和碳碳雙鍵。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]—種在蛋白質(zhì)上修飾烯酰基團的方法，其包括:往蛋白質(zhì)溶液中加入堿后冷卻，在O?10°C下，往冷卻后的蛋白質(zhì)溶液中加入烯酰氯乙腈溶液進行反應，純化反應結(jié)束后的混合液得到烯?；鞍踪|(zhì)。
[0008]所述蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)可選自溶菌酶蛋白、牛血清白蛋白等；所述蛋白質(zhì)溶液的濃度可為I?ΙΟΟΟΟμπιοΙ/L。
[0009]所述堿可為碳酸鹽或叔胺，所述碳酸鹽可選自碳酸鈉、碳酸鉀等中的至少一種;所述叔胺可選自三乙基胺、三甲基胺、N，N_ 二甲基甲酰胺等中的至少一種;所述堿在混合液中的濃度可為1?I OOmmo 1/L。
[0010]所述烯酰氯可為丙烯酰氯、甲基丙烯酰氯等;所述烯酰氯與蛋白質(zhì)的物質(zhì)的量比可為I?100;所述烯酰氯乙腈溶液中，乙腈的體積為烯酰氯體積的5?20倍;所述往冷卻后的蛋白質(zhì)溶液中加入烯酰氯乙腈溶液，加入之前先將烯酰氯乙腈溶液冷卻至O?10C。
[0011]所述反應的時間可為5?30min。
[0012]反應結(jié)束后將混合液轉(zhuǎn)移至截留分子量為5K或1K的超濾離心管中，離心，棄去濾液;再超濾離心管中加入超純水，離心，棄去濾液，所得產(chǎn)物即為烯酰化蛋白質(zhì)。
[0013]在一個實施例中，所述一種在蛋白質(zhì)上修飾烯?；鶊F的方法，其包括:將0.716g溶菌酶蛋白溶解于1mL水中，往溶菌酶蛋白溶液中加入53mg碳酸鈉固體使得其最終濃度為50mmol/L，混勻后置于4°C冰箱中冷藏;取45.2mg的丙烯酰氯，用5倍丙烯酰氯體積量的乙腈稀釋配制成丙烯酰氯溶液;將蛋白溶液置于冰水浴中，邊振蕩邊往溶菌酶蛋白溶液中逐滴加入丙烯酰氯乙腈溶液進行反應，反應1min后取出混合液;將混合液轉(zhuǎn)移至截留分子量為5K的超濾離心管中，離心，棄去濾液;再超濾離心管中加入超純水，離心，棄去濾液，得到丙烯?；芫傅鞍?。
[0014]在另一個實施例中，所述一種在蛋白質(zhì)上修飾烯?；鶊F的方法，其包括:將0.716g溶菌酶蛋白1mL水中，往溶菌酶蛋白溶液中加入10.1mg三乙基胺溶液使得其最終濃度為lOmmol/L，混勻后置于4°C冰箱中冷藏;取41.Smg的甲基丙烯酰氯，用10倍甲基丙烯酰氯體積量的乙腈稀釋配制成甲基丙烯酰氯溶液;將溶菌酶蛋白溶液置于冰水浴中，邊振蕩邊往蛋白溶液中逐滴加入甲基丙烯酰氯乙腈溶液，反應5min后取出混合液;將混合液轉(zhuǎn)移至截留分子量為5K的超濾離心管中，離心，棄去濾液;再超濾離心管中加入超純水，離心，棄去濾液，得到甲基丙烯?；芫傅鞍住?br>[0015]在一些實施例中，所述一種在蛋白質(zhì)上修飾烯?；鶊F的方法，其包括:將1.33g牛血清白蛋白溶于I OmL水中，往牛血清白蛋白溶液中加入1 Img三乙基胺溶液使得其最終濃度為lOOmmol/L，混勻后置于4°C冰箱中冷藏;取36.2mg的丙烯酰氯，用10倍體積量的乙腈稀釋配制成丙烯酰氯溶液;將牛血清白蛋白溶液置于冰水浴中，邊振蕩邊往溶液中逐滴加入4倍量的丙烯酰氯乙腈溶液，反應15min后取出混合液;將混合液轉(zhuǎn)移至截留分子量為10K的超濾離心管中，離心，棄去濾液;再超濾離心管中加入超純水，離心，棄去濾液，得到丙烯?；Ｑ灏椎鞍住?br>[0016]本發(fā)明是將?；瘜W修飾技術(shù)與超濾分離技術(shù)相結(jié)合，利用蛋白質(zhì)上的氨基能與酰氯快速反應的特性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速烯?；缓髮a(chǎn)物通過超濾分離技術(shù)進行純化，制備得到烯?；鞍踪|(zhì)，該方法具有快速簡便、使用范圍廣、限制條件少、成本低的優(yōu)點，適用于生物化學與材料化學等相關(guān)領(lǐng)域。本發(fā)明反應條件易于控制，反應程度高，修飾效果顯著。特別是采用烯酰氯試劑進行反應，如丙烯酰氯，可以在蛋白質(zhì)分子上快速修飾不飽和碳碳雙鍵，帶有不飽和碳碳雙鍵的物質(zhì)可進一步用于制備多種具有特定功能的高聚物，應用十分廣闊。
【附圖說明】
[0017]圖1是實施例1丙烯?；芫傅鞍椎母叻直尜|(zhì)譜圖。
[0018]圖2是實施例2甲基丙烯?；芫傅鞍椎母叻直尜|(zhì)譜圖。
[0019]圖3是實施例3丙烯酰化牛血清白蛋白的高分辨質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0020]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面進一步披露一些非限制實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0021]實施例1丙稀?；芫傅鞍?Iysozyme)的制備
[0022]將0.716g溶菌酶蛋白溶解于1mL水中，往溶菌酶蛋白溶液中加入53mg碳酸鈉固體使得其最終濃度為50mmOVL，混勻后置于