用玻璃覆蓋的生物學試劑的制備
【專利說明】用玻璃覆蓋的生物學試劑的制備
[0001] 本申請為分案申請，原申請的申請日為2007年9月13日，申請?zhí)枮?200780034507. 7 (PCT/US2007/078376)，發(fā)明名稱為"用玻璃覆蓋的生物學試劑的制備"。
[0002] 香叉參考相關(guān)申請
[0003] 本申請要求2006年9月18日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/845, 307和2007年 1月31日提交的60/887, 364(其公開內(nèi)容W其全文并入本文作為參考）的優(yōu)先權(quán)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明設(shè)及生物學材料和試劑W玻璃狀、多孔狀態(tài)長期貶存。特別地，其設(shè)及使用 多孔板制備該些材料和試劑和其貶存的方法。
[00化]發(fā)巧背景
[0006] 少數(shù)生物學活性材料足夠穩(wěn)定，從而它們可在室溫下進行分離、純化且然后在溶 液中貶存。一般地，將生物學試劑貶存在保持在4°c、-20°C或-70°c的甘油溶液中?？蓪⑺?們散裝（inbulk)貶存，然后在使用前與其他試劑組合。
[0007] 在制備用于生物學樣品的便利和有效的測試的試劑中，經(jīng)常重要的是獲得均勻、 預(yù)估量（discreetamount)的干燥的化學滲合物。用于穩(wěn)定生物學試劑的載體或填充物的 一種類型是形成玻璃的填充材料。將生物學試劑溶液并入形成玻璃的填充材料（所述材料 是水溶性或水溶脹性物質(zhì)）。然后將它們干燥W產(chǎn)生固定和穩(wěn)定生物學試劑的玻璃狀組合 物。關(guān)于用于穩(wěn)定生物學試劑的形成玻璃的填充材料參見US5, 098, 893、US5, 200, 399和 US5,240,843。
[000引碳水化合物例如葡萄糖、庶糖、麥芽糖或麥芽=糖是重要的形成玻璃的物質(zhì)組。可 使用其他多哲基化合物例如碳水化合物衍生物如山梨糖醇和經(jīng)化學修飾的碳水化合物。另 一類重要的形成玻璃的物質(zhì)是合成的聚合物，如聚己締化咯燒酬、聚丙締酷胺或聚己締亞 胺。
[0009] 形成玻璃的物質(zhì)的另外的實例包括糖類共聚物例如由GEHealthcare在注冊商標 FICDLL?下銷售的那些糖類共聚物。FICO^ ?具有5, 000至1，000, 000的分子量且包含通 過離橋鍵與雙功能基團連接的庶糖殘基扣S3, 300, 474)。此種基團可W是2、3或更多個碳 原子但通常不超過10個碳原子的亞烷基。雙功能基團用于將糖殘基連接在一起。此種聚 合物可W例如通過糖與面代醇或雙環(huán)氧（bis-epoxy)化合物的反應(yīng)來制備。
[0010] 碳水化合物聚合物的玻璃狀基質(zhì)中的經(jīng)穩(wěn)定的生物學材料可W通過冷凍干燥 (Treml等人US5, 593, 824;化anks和Hatl巧US5, 098, 893)或通過真空干燥CWa化er等 人US5, 565, 318)來制備。該些水溶性試劑方便地用于復(fù)雜的分子生物學應(yīng)用。該方法具 體用于由W單次使用的等分試樣分配的酶、核巧酸和其他組分組成的試劑系統(tǒng)。玻璃狀基 質(zhì)的重建遞送用于應(yīng)用（包括DNA擴增和DNA測序）的經(jīng)緩沖的酶。
[0011] 目前在市場上存在許多干燥的分子生物學產(chǎn)品。然而，該些產(chǎn)品中的一些通過相 當麻煩且包括大量的手工勞動的方法來制備。其他產(chǎn)品當干燥時需要冷凍。存在對用于產(chǎn) 生環(huán)境溫度干燥的試劑的改進方法的需要。
[00。]發(fā)巧概巧
[0013] 在本發(fā)明的第一方面，提供了產(chǎn)生干燥的試劑制劑的方法。該方法包括步驟；提供 至少一種經(jīng)緩沖的生物學試劑的水溶液；將形成玻璃的填充材料與經(jīng)緩沖的試劑溶液混合 來形成其中填充材料的濃度足W促進玻璃狀多孔組合物形成的混合物；將預(yù)先確定量的混 合物分配入多孔容器的孔；將容器中的混合物干燥W形成干燥的試劑制劑；其中所述試劑 制劑是水溶性的且具有對于室溫穩(wěn)定性是足夠的Tg?；旌衔飪?yōu)選是均一的溶液。
[0014] 在本發(fā)明的一個實施方案中，將干燥的試劑制劑收集入試劑瓶中W用于延長的室 溫貶存。
[0015] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，將干燥的試劑貶存于多孔容器中W進行延長的貶 存，用密封帶密封容器的頂部。任選地，密封帶是熱激活的。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的多孔容器可W是二氧化娃塑模（silicamould)或聚苯己締板。當 多孔容器是聚苯己締板時，本發(fā)明還包括在凍干前將聚苯己締板置于金屬塑模上，從而各 聚苯己締板孔的外壁與所述金屬塑模的孔緊密接觸W進行有效的熱傳遞。我們發(fā)現(xiàn)該改進 了干燥方法且產(chǎn)生了具有提高的完整性的干燥的試劑。
[0017] 在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)上述方法制備的干燥的生物學試劑組 合物。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明制備的試劑組合物是水溶性的且具有對于持室溫穩(wěn)定性是足夠的Tg。 優(yōu)選地，試劑組合物具有結(jié)構(gòu)完整性。
[0019] 生物學試劑組合物能夠在短于1分鐘，優(yōu)選30秒內(nèi)完全溶解在25y1水溶液中。 試劑組合物優(yōu)選具有低于10%的含濕量。
[0020] 試劑組合物可具有至少一種當于室溫下在水溶液中單獨存在時不穩(wěn)定的試劑。試 劑組合物還可包含多種當在室溫下于水溶液中存在時相互之間可W反應(yīng)或可W不反應(yīng)的 試劑。
[0021] 因此，本發(fā)明的目的和優(yōu)點是提供干燥的生物學試劑組合物和產(chǎn)生所述組合物的 方法。
[0022] 根據(jù)下列描述，本發(fā)明的該些和其他目的W及優(yōu)點將變得顯而易見。然而，該描述 僅僅是優(yōu)選實施方案。因此，應(yīng)當依賴權(quán)利要求來估計本發(fā)明的整個范圍。
[002引 附圖描巧
[0024] 圖1顯示用于按照本發(fā)明的實施方案制備干燥的試劑制劑的方法的方法工作流 程。
[0025] 圖2顯示，從左上角開始；用于按照本發(fā)明的實施方案制備干燥的試劑制劑的方 法的384孔聚苯己締板；右上角：顯示具有1千萬拷貝至1000拷貝的起始濃度的不同量的 入DNA作為模板的標準曲線，包括無模板對照；左下角：從384孔聚苯己締板制備的貶存在 塑料瓶中的干燥的試劑制劑餅/立方塊（cube);右下角：顯示干燥的試劑制劑成功地用于 入DNA實時qPCR擴增反應(yīng)的擴增圖。
[0026] 圖3顯示，從左上角開始；用于按照本發(fā)明的實施方案制備干燥的試劑制劑的方 法的96孔二氧化娃塑模；右上角：顯示具有1千萬個拷貝至1000個拷貝的起始濃度的不同 量的ADNA作為模板的標準曲線，包括無模板的對照；左下角：從96孔二氧化娃塑模制備 的貶存在塑料瓶中的干燥的試劑片劑；右下角：顯示干燥的試劑制劑成功地用于ADNA實 時qPCR擴增反應(yīng)的擴增圖。
[0027] 圖4顯示包含PCR制劑的96孔PCR板在凍干前進入金屬支架（metalholder)。
[0028] 圖5顯示不同形式的按照本發(fā)明的的實施方案制備的室溫穩(wěn)定的PCR試劑。左上 角；瓶中的干燥的PCR混合物。右上角；96孔板中的干燥的PCR混合物。左下角；384孔板 中的干燥的PCR混合物。右下角；96孔穿孔板（perforatedplate)中的干燥的PCR混合 物。
[0029] 圖6顯示按照本發(fā)明的實施方案制備的干燥的PCR試劑的穩(wěn)定性。干燥的PCR混 合物用于ADNA的qPCR。對于（1)'濕'制劑珠混合物（左上方）、（2)使用當前規(guī)程制備 的干燥的餅（右上方）和（3)來自GEHealthcare的puRetaqRead廠T〇-Go?(RTG)PCR珠 (左下方），注意到相似的性能。右下方；一式S份進行的上述S個反應(yīng)的Ct值和PCR效 率。新形式和pureTaq珠的Ct值和PCR效率值是相當?shù)摹?br>[0030] 圖7顯示按照本發(fā)明的實施方案制備的干燥的PCR試劑的穩(wěn)定性。將干燥的PCR 混合物于40°C和室溫（RT)下貶存8天。將干燥的試劑用于ADNA的qPCR，具有相似的性 能。左上角：于RT下貶存的干燥的PCR試劑餅（reagentcake)。右上角：于40°C下貶存 的干燥的PCR試劑餅。左下角；于RT下貶存的puReTaq珠（GEHealthcare)。右下角；于 40°C下貶存的puReTaq珠。
[0031] 圖8顯示一式兩份進行的上述四個反應(yīng)的Ct值和PCR效率。當前形式和pureTaq 珠的Ct值和PCR效率值在4