一種多肽在制備kv2.1型鉀通道工具試劑中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物活性多肽在制備電壓門控鉀通道工具試劑?KV2.1型鉀通道抑制劑中的應(yīng)用方法，所述的生物活性多肽為蜘蛛抑鈉肽?IX（SPNP?IX），試驗驗證該活性多肽對KV2.1型電壓門控鉀通道具有明顯的抑制作用。在制備電壓門控鉀通道亞型工具試劑時，配制細(xì)胞外給藥的濃度為10 μmol/L。SPNP?IX的半數(shù)有效作用劑量IC50為1.6 μmol/L。SPNP?IX對KV2.1型鉀通道的抑制呈現(xiàn)時間依從性，是一種較好的KV2.1型鉀通道工具試劑。
【專利說明】
一種多肽在制備KV2.1型鉀通道工具試劑中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種活性多肽在離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1x(簡寫為SPNP-1X)在制備電壓門控鉀通道工具試劑-KV2.1型鉀通道抑制劑中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]電壓門控鉀通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程，同時也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鉀通道在動作電位的產(chǎn)生和傳播過程中的關(guān)鍵性作用，電壓門控鉀通道成為很多動植物毒素的作用靶標(biāo)。鉀離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國際上的研究熱點。電壓門控鉀通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點。自然界的動物毒素是一類具有很高實用價值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì)，不僅是有毒動物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料，同時也是研究離子通道的獨特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動物(如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動物等)的毒液中鑒定到了很多作用于鉀通道的活性成分。它們通過與鉀通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鉀通道的分子機(jī)制，除了在理論上可深入推測鉀通道亞型之間的功能活動區(qū)別和門控活動機(jī)制外，還可以為將它們開發(fā)成治療人類相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X在制備電壓門控鉀通道工具試劑-KV2.1型鉀通道抑制劑的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽_IX(簡寫為SPNP-1X)，其氨基酸序列為:
NH2~G1u Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys ProHis Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-
NH2,
其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組份用于制備KV2.1型鉀通道抑制劑。
[0004]所述的蜘蛛抑鈉肽-1X的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。
[0005]該蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組分用于制備KV2.1型鉀通道抑制劑，以細(xì)胞外給藥的方式制備成KV2.1型鉀通道工具試劑。
[0006]蜘蛛抑鈉肽-1X在制備KV2.1型鉀通道工具試劑或抑制劑時，配制細(xì)胞外給藥的劑量為10 pmol/Lo
[0007]蜘蛛抑鈉肽-1X抑制KV2.1型鉀通道的半數(shù)有效作用劑量IC5q為1.6μπιοΙ/L。
[0008]蜘蛛抑鈉肽-1X對KV2.1型鉀通道的抑制呈現(xiàn)時間依從性，是一種較好的KV2.1型鉀通道工具試劑。
【附圖說明】
[0009]圖1是10 pmol/L SPNP-1X對大鼠DRG神經(jīng)元上KV2.1型鉀通道的影響。
[0010]圖2是SPNP-1X作用于大鼠DRG細(xì)胞KV2.1鉀通道的濃度-效應(yīng)關(guān)系曲線。
[0011]圖3是SPNP-1X作用于大鼠DRG細(xì)胞KV2.1鉀通道的時間-效應(yīng)關(guān)系曲線。
[0012]圖4是SPNP-1X對大鼠DRG細(xì)胞KV2.1鉀通道電流-電壓關(guān)系的影響。
【具體實施方式】
[0013]為了更好的理解和更充分公開本發(fā)明，下面將通過細(xì)胞外給藥途徑，采用爪蟾卵母細(xì)胞模型來說明蜘蛛抑鈉肽-1X的KV2.1型鉀通道抑制作用。
[0014]
1、實驗材料和方法 1.1質(zhì)粒的線性化及回收
含Kvl.1基因的質(zhì)粒PCI用限制性內(nèi)切酶Sma I線性化;含Kvl.2基因的質(zhì)粒pcDNA3用限制性內(nèi)切酶Sph I線性化;含Kvl.3基因的質(zhì)粒pC1-neo用限制性內(nèi)切酶Not I線性化;含Kv2.1基因的質(zhì)粒pCI用限制性內(nèi)切酶Not I線性化。cDNA的回收操作如下:取Kv2.1質(zhì)粒20pL, 10 XBuffer 5μL1H2O 22μ1，限制性內(nèi)切酶NotI 3μ1，震蕩混合后，37°C下放置5hr。酶切后的產(chǎn)物用0.8%的Agarose膠電泳，切膠后用離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。割下含DNA的Agarose膠放入1.5 mL離心管中，每100 mg膠加入300μI溶膠液，置65°C水浴1min，使膠完全溶化，混合液轉(zhuǎn)入到已經(jīng)套入收集管的吸附柱內(nèi)，13000 rpm離心30s，倒掉廢液，加入700μ1漂洗液，13000 rpm離心30s，倒掉廢液，加入500μ1漂洗液，13000 rpm離心30s，倒掉廢液，13000rpm空柱離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱放入一干凈離心管中，加入適量經(jīng)65-70°C水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置2min，13000 rpm離心Imin收集DNA溶液。
[0015]1.2 cDNA的體外轉(zhuǎn)錄和mRNA的純化
Kvl.1、Κν1.3、Κν1.2和Kv2.1 cDNA的體外轉(zhuǎn)錄均采用Amb1n公司的mMESSAGEmMACHINE T7 Transcript1n kit 試劑盒進(jìn)行。取cDNA 20μ1,10 XBuffer 2μ1，2ΧΝΤΡ/CAP 10μ1，Τ7 RNA聚合酶2μ1，上述溶液震蕩混合后，37°C水浴2hr;加Ιμ? DNAase，37°C加熱511^11。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入15μ1醋酸銨和115μ1 Η20終止反應(yīng)。加入150μI酸/氯仿，混勾，靜置5min，12000rpm低溫離心5min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，然后加入等體積氯仿，混勾，12000rpm低溫離心10min，吸上清至新離心管，加入350μl預(yù)冷的異丙醇，-20°C放置30min，12000rpm低溫離心10min，移去上清，加入預(yù)冷的70%乙醇，1000rpm低溫離心5min，去上清，風(fēng)干，加入適量無RNA酶的ddH20。取轉(zhuǎn)錄好的mRNA 1μI，用紫外分光光度計測量其濃度，檢測結(jié)果為1.7?1.。將mRNA稀釋到1.0 ng/nl，_70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0016]1.3卵母細(xì)胞標(biāo)本的制備和培養(yǎng)ND96溶液(mM):NaCl 96、KC1 2、CaCl2-2H20 I.8、MgCl2-6H20 UHEPES-NaOH 5。用NaOH調(diào)pH至7.5。
[0017]OR2溶液(mM): NaCl 82.5、KC1 2.5、CaCl2-2H20 UMgCl2^H2O 1、Na2HPO4-^H2O
1、HEPES 5。用NaOH調(diào)pH至7.5。使用前加入青霉素(10萬單位/L)。
[0018]卵母細(xì)胞的分離:雌性非洲爪蟾購自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所。取成年雌性非洲爪蟾，放入碎冰內(nèi)冷凍麻醉約30 min，腹部朝上置于冰上，用鑷子和手術(shù)刀在其腹部劃開一長約1.0?1.5 cm的口子，再把鑷子伸入腹腔夾出卵巢，剪取2-3葉放入無鈣ND96溶液中。將取出的卵葉用系線鑷初步分散成1 - 20個細(xì)胞一團(tuán)。然后轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入溶有膠原酶的無鈣ND96溶液，酶的終濃度為I mg/mL。在25°C，60 rpm下酶解50min。取細(xì)胞觀察，如果有80%以上的細(xì)胞已經(jīng)去除微血管及濾泡膜，則停止酶解。酶解完畢，用無鈣的ND96溶液多次洗滌細(xì)胞，洗去殘留的膠原酶。然后，挑選個體比較大、動植物極分明的細(xì)胞轉(zhuǎn)入OR2溶液中培養(yǎng)。
[0019]1.4電壓鉗實驗
通過顯微注射系統(tǒng)(WPI，German )將mRNA注入挑選好的卵母細(xì)胞，每次注射體積約為20-50 nl，從黑色的動物極一側(cè)注入。之后，放入16°C低溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2?4天，每天更換一次新鮮的OR2培養(yǎng)液。雙電極桿電壓鉗記錄在室溫(18?22°C)下進(jìn)行。電流和電壓玻璃電極經(jīng)一步拉制而成，灌注3 M KCl后電阻為0.5-1.5 MΩ。將細(xì)胞放入細(xì)胞槽中，用OR2溶液灌流。然后將兩個玻璃電極分別插入細(xì)胞的動植物兩極。將細(xì)胞膜鉗制在-80 mV，給予去極化脈沖刺激。所用放大器為TURBO TEC-03XCNPI Electronic, Germany)。數(shù)據(jù)采集濾波為2kHz。參比電極用Ag/AgCl電極與浴槽相連。刺激脈沖控制和電流信號記錄采用cel Iworks數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(NPI公司，Germany)。線性漏電流和電容電流不予刪除。數(shù)據(jù)分析采用Sigmaplot9.0軟件進(jìn)行。所有毒素直接用溶液溶解并配制成目的濃度。實驗過程中，為防止毒素粘在細(xì)胞槽壁上，可在OR2溶液中加入少量BSA( Sigma，USA)。
[0020]
2、實驗結(jié)果與分析
2.1 SPNP-1X對KV2.1型電壓門控鉀通道的影響
與SPNP-1X有63%同源性的hanatoxinl是已知的Kv2.1通道毒素，因此我們也檢測了SPNP-1X對表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞上的延遲整流鉀通道(Kvl.1，Kvl.2, Kvl.3和Kv2.1)的作用。延遲整流鉀通道1^1.1、1^1.2、1^1.3和1^2.1電流以同一種去極化方式誘導(dǎo):將細(xì)胞膜電位鉗制在_90 mV，以200 ms的時程給予一測試電壓OmV，每隔5 s重復(fù)一次。實驗結(jié)果表明，10 μΜ的SPNP-1X對Kvl.1，Kvl.2，Kvl.3沒有明顯的抑制作用，卻能抑制93 土 3.2 %的Κν2.1通道電流(如圖1) ^PNP-1X對Kv2.1電流的抑制效應(yīng)具有濃度依從性，其半有效抑制濃度(1050)為1.6 μΜ(圖2) APNP-1X對Κν2.1電流的抑制具有時間依從性，當(dāng)濃度增加為10 μΜ時，可在約2min的時間內(nèi)達(dá)到94%的抑制程度(圖3)。10 μΜ的SPNP-1X抑制Kv2.1電流的結(jié)合和解離時間常數(shù)分別為26.6±1.3 s (η = 5)。并且10 μΜ的SPNP-1X對靜息關(guān)閉狀態(tài)的Κν2.1通道的抑制比例約為93%，表明SPNP-1X對處于靜息關(guān)閉和激活狀態(tài)的鉀通道均有相似的親和敏感性。
[0021]2.2 SPNP-1X對KV2.1型鉀通道門控特征的影響
門控調(diào)制毒素與通道作用一個非常重要的特征是通過使通道的激活電位向去極化方向漂移從而調(diào)制通道門控的動力學(xué)。SPNP-1X對Kv2.1通道1-V曲線的影響見圖4:當(dāng)細(xì)胞膜電位鉗制在-80 mV時，Kv2.1通道的起始激活電壓約為-40 mV，SPNP-1X能使Kv2.1通道的激活電位朝去極化方向漂移約20 mV，說明它是作為通道的門控調(diào)制劑在發(fā)揮作用。
【主權(quán)項】
1.一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X在制備電壓門控鉀通道工具試劑-KV2.1型鉀通道抑制劑中的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X(簡寫為SPNP-1X)，其氨基酸序列為: Mfe-Glu Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys Pro His Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-NH2, 其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組份用于制備KV2.1型鉀通道抑制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X在制備電壓門控鉀通道工具試劑-KV2.1型鉀通道抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的蜘蛛抑鈉肽-1X的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組分用于制備KV2.1型鉀通道抑制劑。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X制備成細(xì)胞外給藥的KV2.1型鉀通道工具試劑。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X在制備KV2.1型鉀通道工具試劑或抑制劑時，配制細(xì)胞外給藥的劑量為10 ymol/L。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X的半數(shù)有效作用劑量IC50為1.6pmol/L07.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X的作用是時間依從的。
【文檔編號】A61P25/00GK105833247SQ201610234418
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月17日
【發(fā)明人】鄧梅春, 羅旋
【申請人】長沙沁才生物科技有限公司