抗her2人源化抗體mil41、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗HER2人源化抗體，以及編碼所述人源化抗體的核酸分子。本發(fā) 明還涉及所述核酸分子用于制備所述抗HER2人源化抗體的用途，以及所述人源化抗體用 于制備抗腫瘤藥物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] HER2 (ERBB2)是I型跨膜酪氨酸激酶受體家族成員，在許多上皮來源的腫瘤細(xì)胞 中過表達(dá)，如25-30%的乳腺癌、25-32%的卵巢癌、30-40%的原發(fā)性腎細(xì)胞癌等，是腫瘤靶向 藥物研制的重要靶點。
[0003] Genentech公司研發(fā)的人源化抗體帕妥珠（Pertuzumab，也被稱作2C4,商品名 Per jeta)，通過結(jié)合HER2,阻斷了 HER2與HER3之間的聯(lián)系，而HER2與HER3是HER家族初 始致癌信號傳導(dǎo)的最強二聚體形式，這種相互作用在許多不同類型腫瘤的增殖和形成中均 起重要作用。Pertuzumab對HER2低水平表達(dá)的腫瘤細(xì)胞也有作用。帕妥珠單抗在2012年 6月8日通過了美國FDA的認(rèn)證，用于治療HER2陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。
[0004] 通過檢索相關(guān)的文獻(xiàn)以及專利（中國發(fā)明專利【申請?zhí)枴?00580031905. 4)，我們獲 悉Pertuzumab在生產(chǎn)過程中存在序列異構(gòu)體VHS的問題，這會影響最終產(chǎn)品的純度。本發(fā) 明研究的目的是獲得無 VHS異構(gòu)體或低VHS異構(gòu)體含量的抗體產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人通過計算機設(shè)計、優(yōu)化和大量的實驗摸索，驚奇地發(fā)現(xiàn)通過改變 抗體帕妥珠的核苷酸序列，以及接下來的克隆、表達(dá)策略，可以克服該抗體在表達(dá)中出現(xiàn)的 VHS異構(gòu)體現(xiàn)象，從而大大提高產(chǎn)品的純度。具體地，本發(fā)明包括以下幾個方面：
[0006] 本發(fā)明第一方面涉及編碼抗HER2人源化抗體的核酸分子，其輕鏈的核苷酸序列 如SEQ ID NO :1所示，其重鏈的核苷酸序列如SEQID NO :2所示。
[0007] 本發(fā)明第二方面涉及重組載體，其含有本發(fā)明第一方面任一項的核酸分子。
[0008] 在本發(fā)明中，所述載體可以為克隆載體或表達(dá)載體。所述載體含有本發(fā)明第一方 面所述的核酸分子，所述載體可以通過例如將上述核酸分子插入克隆載體或表達(dá)載體而得 到，或者可以通過人工合成得到。
[0009] 所述表達(dá)載體例如為原核表達(dá)載體，真核表達(dá)載體，噬菌體載體或病毒載體。其 中所述原核表達(dá)載體例如為PET載體、PGEX載體，所述真核表達(dá)載體例如為pcDNA3. 1、 pEGFP_Cl、pPIC9K，所述噬菌體載體例如為λ噬菌體載體入8丨、入8卜入8，所述病毒載體例 如為逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體。
[0010] 在本發(fā)明的實施方案中，所述載體為真核表達(dá)載體PTGS-FRT-DHFR。
[0011] 在本發(fā)明的實施方案中，將真核表達(dá)載體pTGS-FRT-DHFR做了進一步改造。在本 發(fā)明的實施方案中，所述改造方法為去除潮霉素選擇標(biāo)簽，并加入谷氨酰胺合成酶表達(dá)盒 子。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述表達(dá)載體為載體GS。
[0012] 在本發(fā)明中，在所述真核表達(dá)載體pTGS-FRT-DHFR或載體GS中連接SEQ ID NO :1 和SEQ ID NO :2的序列后，即得到重組載體。
[0013] 本發(fā)明第三方面涉及重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第二方面任一項的重組載體。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的重組細(xì)胞，其為哺乳動物細(xì)胞。在本發(fā)明的實施方 案中，所述哺乳動物細(xì)胞為適合表達(dá)人源化抗體的細(xì)胞，例如來源于人、鼠或猴的哺乳動物 細(xì)胞。在本發(fā)明的實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
[0015] 在本發(fā)明的實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞為CHO-Kl細(xì)胞。
[0016] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述CHO-Kl細(xì)胞是經(jīng)過目標(biāo)培養(yǎng)基馴化后的細(xì)胞。
[0017] 在本發(fā)明的實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基是指無血清、化學(xué)成分確定的動物細(xì)胞 培養(yǎng)基。
[0018] 在本發(fā)明的實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基中含有PluroniC F-68、葡萄糖、培養(yǎng)基 干粉Maxgrow202、碳酸氫鈉、氯化鈉和HEPES ;
[0019] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基的成分為PluronicF-681. Og/L、葡 萄糖8. 8g/L、培養(yǎng)基干粉Maxgrow2027· 44g/L、碳酸氫鈉 I. 98g/L、氯化鈉3. 47g/L和IM HEPES15ml/L，并調(diào)節(jié)pH至7. 0 ±0. 1。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基用于細(xì) 胞馴化和種子培養(yǎng)。在本發(fā)明的實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基為表1-1的種子培養(yǎng)基。
[0020] 在本發(fā)明的實施方案中，所述馴化培養(yǎng)的方法為本領(lǐng)域所公知，例如先將細(xì)胞在 含有10%小牛血清的目標(biāo)培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，按照50%的比例逐級去除血清，例如小牛血清 濃度從10%逐級降至5%、2. 5%、1. 25%、直至完全不含血清，然后繼續(xù)傳代數(shù)次，至宿主細(xì)胞 完全懸浮，成倍增長穩(wěn)定，最終獲得能夠在目標(biāo)培養(yǎng)基中生長的穩(wěn)定宿主細(xì)胞。
[0021] 本發(fā)明的第四方面涉及抗HER2人源化抗體，其由本發(fā)明第一方面任一項的核酸 分子、第二方面任一項的重組載體、或者第三方面任一項的重組細(xì)胞制備得到。
[0022] 在本發(fā)明的實施方案中，所述抗HER2人源化抗體中VHS異構(gòu)體的含量為0~ 〇· 4%，例如為 0 ~0· 2%、0 ~(λ 1%。
[0023] 在本發(fā)明的實施方案中，所述抗HER2人源化抗體中NGHC異構(gòu)體的含量為0. 2%~ 1%，例如為 0. 3% ~0. 75%。
[0024] 在本發(fā)明的實施方案中，所述VHS異構(gòu)體的定量方法為電荷變量分析法(也即陽 離子交換分析法)。
[0025] 在本發(fā)明的實施方案中，所述NGHC異構(gòu)體的定量方法為還原型的毛細(xì)管凝膠電 泳分析法（CE-SDS)。
[0026] 本發(fā)明的第五方面涉及本發(fā)明第四方面任一項的抗HER2人源化抗體的制備方 法，其包括利用本發(fā)明第一方面任一項的核酸分子、第二方面任一項的重組載體、或者第三 方面任一項的重組細(xì)胞制備該抗HER2人源化抗體的步驟。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項的制備方法，其具體包括以下步驟：
[0028] 1)將本發(fā)明第一方面的核酸分子的核苷酸序列克隆入表達(dá)載體中，得到重組表達(dá) 載體，優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體是在載體pTGS-FRT-DHFR的基礎(chǔ)上改造獲得，優(yōu)選地，所 述改造是指去除潮霉素選擇標(biāo)簽，并加入谷氨酰胺合成酶表達(dá)盒子；
[0029] 2)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，例如CHO-Kl細(xì)胞中，得到重組宿主細(xì)胞，優(yōu)選 地，所述宿主細(xì)胞是經(jīng)過目標(biāo)培養(yǎng)基馴化后的CHO-Kl細(xì)胞；
[0030] 3)將步驟2)獲得的重組宿主細(xì)胞在目標(biāo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，獲得能夠高效表達(dá)抗 體的單克隆細(xì)胞株。
[0031] 4)逐步放大培養(yǎng)步驟3)獲得的單克隆細(xì)胞株，收獲培養(yǎng)上清；
[0032] 5)將步驟4)獲得的培養(yǎng)上清進行純化，獲得本發(fā)明第四方面任一項的抗HER2人 源化抗體。
[0033] 在本發(fā)明的實施方案中，所述重組表達(dá)載體是GS載體。
[0034] 在本發(fā)明的實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基是指無血清、化學(xué)成分確定的動物細(xì)胞 培養(yǎng)基。
[0035] 在本發(fā)明的實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基中含有Pluronic F-68、葡萄糖、培養(yǎng)基 干粉Maxgrow202、碳酸氫鈉、氯化鈉和HEPES ;
[0036] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基的成分為PluronicF-681. Og/L、葡 萄糖8. 8g/L、培養(yǎng)基干粉Maxgrow2027. 44g/L、碳酸氫鈉 I. 898g/L、氯化鈉3. 47g/L和IM HEPES15ml/L，并調(diào)節(jié)pH至7. 0 ± 0. 1。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基用于細(xì) 胞馴化和種子培養(yǎng)。在本發(fā)明的實施方案中，所述目標(biāo)培養(yǎng)基為表1-1的種子培養(yǎng)基。
[0037] 在本發(fā)明的實施方案中，所述馴化培養(yǎng)的方法為本領(lǐng)域所公知，例如先將細(xì)胞在 含有10%小牛血清的目標(biāo)培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，按照50%的比例逐級去除血清，例如小牛血清 濃度從10%逐級降至5%、2. 5%、1. 25%、直至完全不含血清，然后繼續(xù)傳代數(shù)次，至宿主細(xì)胞 完全懸浮，成倍增長穩(wěn)定，最終獲得能夠在目標(biāo)培養(yǎng)基中生長的穩(wěn)定宿主細(xì)胞。
[0038] 在本發(fā)明的實施方案中，步驟3)的具體方法為：將步驟2)獲得的重組宿主細(xì)胞在 目標(biāo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，向培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的MSX (例如75 μ M MSX)，在培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)一段時間，挑選出可以在此培養(yǎng)基中存活并表達(dá)抗體的細(xì)胞，然后進行亞克隆篩選，獲得 能夠高效表達(dá)抗體的單克隆細(xì)胞株。
[0039] 在本發(fā)明的實施方案中，步驟4)的具體方法為：將能夠高效表達(dá)抗體的單克隆細(xì) 胞株經(jīng)過目標(biāo)培養(yǎng)基多步擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)基為生產(chǎn)培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基為1 :1，培養(yǎng)周期為 12-14天，培養(yǎng)第3、6、9天加入10%體積的流加培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后收獲上清。
[0040] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述種子培養(yǎng)基即為目標(biāo)培養(yǎng)基。
[0041] 在本發(fā)明的實施方案中，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基中含有氫氧化鈉、培養(yǎng)基干粉 Maxpr〇302、維生素 Β12、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉一水合物、葡萄糖、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水 合物、Pluronic F-68、氯化鈉、HC1、碳酸氫鈉和HEPES。
[0042] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基中含有氫氧化鈉0. 8g/L、培養(yǎng) 基干粉Maxpro30211. 5g/L、lg/L維生素 B12貯存液（1-2) ml/L、10g/L硫酸亞鐵貯存液 (0· 4-0. 6) ml/L、磷酸二氫鈉一水合物0· 35g/L、葡萄糖8. 8g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合 物（0· 3-0. 375)g/L、Pluronic F-681g/L、氯化鈉 I. 55g/L、5M HC15. 6ml/L、碳酸氫鈉 I. 22g/ L和IM HEP