專利名稱：：在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生人源化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由轉(zhuǎn)基因非人動物產(chǎn)生的人源化抗體。對非人動物進行基因工程化，以獲得含一種或多種人源化免疫球蛋白基因座，該基因座能夠在轉(zhuǎn)基因非人動物中進行基因重排和基因轉(zhuǎn)變，以產(chǎn)生各種人源化免疫球蛋白。本發(fā)明進一步涉及一種新穎的序列、重組載體和用于產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)基因動物的轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明的人源化抗體對人具有最小的免疫原性，適用于人類主體的治療性處理。
背景技術(shù)：
：由細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲導(dǎo)致的感染性疾病的治療很大程度基于化療。然而，抗藥生物的出現(xiàn)要求不斷開發(fā)新的抗生素?；加袗盒约膊『桶┌Y的患者的治療也基于化療。然而，這些治療中的許多是無效的，并且患者的死亡率高。對于感染性疾病和癌癥，需要改進和創(chuàng)新的治療。抗移植器官排斥的甾體類治療需要使用生物試劑(單克隆或多克隆抗體制劑)，該生物試劑在移植受體中逆轉(zhuǎn)正在進行的同種異體免疫應(yīng)答。從動物獲得的免疫制劑的主要問題是人類患者中非人免疫球蛋白的免疫原性。為了減少非人免疫球蛋白的免疫原性，提出了在動物中對各個抗體基因進行基因工程化。具體地，已經(jīng)證明通過融合動物可變(V)區(qū)外顯子和人恒定(C)區(qū)外顯子，可以獲得嵌合抗體基因。然而，該方法只能去除由非人Fc區(qū)導(dǎo)致的免疫原性，而其余的非人Fab序列仍然可以是免疫原性的。在另一種方法中，將重鏈和輕鏈免疫球蛋白的人免疫球蛋白基因?qū)肓诵∈蠡蚪M。盡管該基因工程方法導(dǎo)致在工程化的小鼠中表達人免疫球蛋白多肽，人免疫球蛋白的表達水平很低。這可能是由于免疫球蛋白的有效表達所必須的免疫球蛋白基因座中的物種特異性調(diào)節(jié)元件。如在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中所證明的，人免疫球蛋白基因中存在的條件元件在非人動物中可能不能正常起作用。已經(jīng)描述了免疫球蛋白基因中的一些條件元件。特別重要的是重鏈恒定區(qū)下游(3′)的增強子和輕鏈基因中的內(nèi)含子增強子。此外，其它有待于鑒定的控制元件可能存在于免疫球蛋白基因中。在小鼠中的研究表明，免疫球蛋白分子的膜形式的膜和細(xì)胞質(zhì)尾在對人Cγ1基因為雜合的小鼠血清中的人-小鼠嵌合抗體的表達水平中起重要作用。因此，對于動物中異源免疫球蛋白基因的表達，需要用通常存在于動物中相同位置的序列替代含增強子元件和編碼跨膜區(qū)的外顯子(M1外顯子)和編碼細(xì)胞質(zhì)尾的外顯子(M2外顯子)的序列。將人免疫球蛋白基因?qū)胄∈蠡蚪M導(dǎo)致各種人抗體所有組成成分在基因工程化小鼠中的表達。在小鼠和人中，通過基因重排產(chǎn)生抗體多樣性。該過程導(dǎo)致編碼許多具有不同抗原結(jié)合位點的抗體分子的許多不同重組V(D)J片段的產(chǎn)生。然而，在其它動物，如兔、豬、牛和鳥中，通過稱作基因轉(zhuǎn)變的很大程度不同的機制產(chǎn)生抗體多樣性。例如，已經(jīng)確切證明，在兔和雞中，VDJ重排非常有限(產(chǎn)生的大約90％的免疫球蛋白具有3’近端VH1元件)，抗體多樣性由基因轉(zhuǎn)變和超變產(chǎn)生。相反，小鼠和人即使有基因轉(zhuǎn)變，也非常少見。因此，預(yù)計在通過基因轉(zhuǎn)變產(chǎn)生抗體多樣性的動物中，基于基因重排的基因工程方法將產(chǎn)生具有低抗體滴度和有限的抗體多樣性的動物。因此，用于產(chǎn)生用于人類治療的非免疫原性抗體制劑的大動物的基因工程需要其它的基因工程策略。相關(guān)文獻多克隆抗體制劑在治療移植排斥中的用途最近綜述于N.Bonnefoy-Berardetal.，JHeartLungTransplant1996；15(5)435-442；C.Colbyetal.，AnnPharmacother1996；30(10)1164-1174；M.J.Duganetal.，AnnHematol1997；75(1-2)41-46。多克隆抗體治療對自身免疫病的用途最近描述于W.Cendrowski，BollIstSieroterMilan1997；58(4)339-343；L.K.Kastrukoffetal.，CanJNeurolSci1978；5(2)175-178；J.E.Walkeretal.，JNeurolSci1976；29(2-4)303-309。用抗體制劑消耗脂肪細(xì)胞描述于L.DeClercqetal.，JAnimSci1997；75(7)1791-1797；J.T.Wrightetal.，ObesRes1995；3(3)265-272。免疫球蛋白基因中的調(diào)節(jié)元件描述于Bradleyetal.(1999)，TranscriptionalenhancersandtheevolutionoftheIgHlocus；Lauster，R.etal.，EmboJ124615-23(1993)；Volginaetal.，JImmunol1656400(2000)；Holeetal.，JImmunol1464377(1991)。在雞和兔中通過基因轉(zhuǎn)變使抗體多樣化描述于Bucchinietal.，Nature326409-11(1987)；Knightetal.，AdvancesinImmunology56179-218(1994)；Langmanetal.，ResImmunol144422-46(1993)。表達人-小鼠嵌合抗體的小鼠的產(chǎn)生描述于Pluschkeetal.，JournalofImmunologicalMethods21527-37(1998)。表達具有小鼠來源的膜和細(xì)胞質(zhì)尾的人-小鼠嵌合抗體的小鼠的產(chǎn)生描述于Zouetal.，Science2621271-1274(1993)；Zouetal.CurrBiol41099-1103。表達人免疫球蛋白多肽的小鼠的產(chǎn)生描述于Bruggemannetal.CurrOpinBiotechnol8(4)455-8(1997)；Lonbergetal.IntRevImmunol13(1)65-93(1995)；Neubergeretal.，Nature338350-2(1989)。用BAC克隆產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠描述于Yangetal.，NatBiotechnol15859-65(1997)。轉(zhuǎn)基因兔的產(chǎn)生描述于Fan，J.etal.，PatholInt49583-94(1999)；Bremetal.，MolReprodDev4456-62(1996)。兔的核轉(zhuǎn)移克隆描述于Sticeetal.，BiologyofReproduction39657-664(1988)。免疫球蛋白表達受損的兔描述于McCartney-Francisetal.，MolImmunol24357-64(1987)；Allegrucci，etal.，EurJImmunol21411-7(1991)。轉(zhuǎn)基因雞的產(chǎn)生描述于Etchesetal.，MethodsinMolecularBiology62433-450；Painetal.，CellsTissuesOrgans1999；165(3-4)212-9；Sang，H.，″Transgenicchickens--methodsandpotentialapplications″，TrendsBiotechnol12415(1994)；和WO200075300，″Introducinganucleicacidintoanaviangenome，usefulfortransfectingavianblastodermalcellsforproducingtransgenicaviananimalswiththedesiredgenes，bydirectlyintroducingthenucleicacidintothegerminaldiscoftheegg″。無丙種球蛋白血癥的雞描述于Frommeletal.，JImmunol105(1)1-6(1970)；Benedictetal.，AdvExpMedBiol1977；88(2)197-205。從細(xì)胞克隆動物描述于T.Wakayamaetal.，Nature1998；394369-374；J.B.Cibellietal.，Science2801256-1258(1998)；J.B.Cibellietal.，NatureBiotechnology1998；16642-646；A.E.Schniekeetal.，Science2782130-2133(1997)；K.H.Campbelletal.，Nature38064-66(1996)。從轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生抗體描述于美國專利No.5,814,318，No.5,545,807和No.5,570,429。嵌合哺乳動物宿主的同源重組舉例于美國專利No.5,416,260。將DNA導(dǎo)入胚胎的方法描述于美國專利No.5,567,607。胚胎干細(xì)胞的維持和擴增描述于美國專利No.5,453,357。參與豬、羊和牛中抗體所有組成成分的多樣化的機制綜述于Butler，J.E.(1998)，″Immunoglobulindiversity，Bcellandantibodyrepertoiredevelopmentinlargefarmanimals″，RevSciTech1743。羊中的抗體多樣化描述于Reynaud，C.A.，C.Garcia，W.R.Hein，andJ.C.Weill(1995)，″Hypermutationgeneratingthesheepimmunoglobulinrepertoireisanantigen-independentprocess″，Cell80115；和Dufour，V.，S.Malinge，andF.Nau.(1996)，″ThesheepIgVariableregionrepertoireconsistsofasingleVHfamily″，JImmunol1562163。發(fā)明概述本發(fā)明的一種實施方案提供了具有人免疫球蛋白多肽序列的至少一部分的人源化抗體(人源化免疫球蛋白)。本發(fā)明的人源化抗體是由經(jīng)遺傳工程化而含有一種或多種人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因非人動物產(chǎn)生的。本發(fā)明的人源化抗體優(yōu)選從主要通過基因轉(zhuǎn)變和超變產(chǎn)生抗體多樣性的轉(zhuǎn)基因非人動物，如兔、豬、雞、羊、牛和馬制備。這些抗體可以通過用需要的抗原，如感染劑(如細(xì)菌或病毒)或其部分或片段免疫轉(zhuǎn)基因動物而制備。與從非人動物制備的非人源化抗體相比，這些人源化抗體對靈長類動物，特別是人的免疫原性減少。因此，本發(fā)明的人源化抗體適用于人類主體的治療性處理。本發(fā)明的另一種實施方案提供了人源化抗體的制劑，該抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明的優(yōu)選抗體是多克隆抗體制劑，根據(jù)本發(fā)明，它對靈長類動物，特別是人具有最小的免疫原性。優(yōu)選的多克隆抗體制劑由人源化的免疫球蛋白分子組成，該分子具有至少一種由人恒定區(qū)基因片段編碼的重鏈或輕鏈恒定區(qū)多肽序列。更優(yōu)選地，免疫球蛋白分子的重鏈或輕鏈可變區(qū)也是由人基因片段編碼。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了包含人源化抗體制劑和可藥用載體的藥物組合物。本發(fā)明的另一種實施方案提供了來自非人動物，優(yōu)選主要依賴基因轉(zhuǎn)變產(chǎn)生抗體多樣性的動物的Ig基因片段的5′和3′側(cè)翼區(qū)的新序列。具體地，本發(fā)明提供了編碼雞Cλ、兔Cγ和Cκ、牛Cγ1，2，3和綿羊Cγ1，2的基因下游(3′，3-端)的新核苷酸序列和兔Cγ5′的新序列。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了用于用相應(yīng)的人Ig基因片段替代非人動物Ig基因片段的重組載體。這些載體包含在5′端和3′端與側(cè)翼序列連接的人Ig基因片段，其中側(cè)翼序列與靶動物Ig基因片段的側(cè)翼序列同源。優(yōu)選的重組載體是用于替代動物Ig恒定區(qū)的那些。例如，提供了用于替代兔重鏈恒定區(qū)基因的重組載體。優(yōu)選的載體從5′至3′含有SEQIDNO12或SEQIDNO13所示核苷酸序列，或SEQIDNO12或SEQIDNO13的一部分，人重鏈恒定區(qū)基因片段，SEQIDNO10所示核苷酸序列或SEQIDNO10所示核苷酸序列的一部分。另一種優(yōu)選的載體含有SEQIDNO51所示核苷酸序列，該序列的特征在于具有與來自于兔重鏈恒定區(qū)基因的5′和3′側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列連接的人Cγ1基因。也提供了用于替代兔輕鏈恒定區(qū)基因的重組載體。一種優(yōu)選的載體含有SEQIDNO53所示的核苷酸序列，該序列的特征在于具有與來自于兔輕鏈Cκ1基因基因的5′和3′側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列連接的人Cκ。提供了其它用于替代雞輕鏈恒定區(qū)基因的重組載體。一種優(yōu)選的載體含有SEQIDNO57所示的核苷酸序列，其特征在于具有與來自于雞輕鏈Cλ基因基因的5′和3′側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列連接的人Cλ2。提供的其它重組載體包括用于替代動物IgV區(qū)元件的那些。例如，提供了一種用于替代兔重鏈V區(qū)元件的重組載體，該載體含有SEQIDNO52。提供了一種用于替代兔輕鏈V區(qū)元件的重組載體，該載體含有SEQIDNO54。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體或載體，所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體或載體含有至少一種人源化Ig基因座，即來源于非人動物的Ig基因座或來源于非人動物Ig基因座的一部分，其中該基因座或基因座的部分經(jīng)基因修飾而含有至少一種人Ig基因片段。這些人源化的Ig基因座具有在非人動物中進行基因重排和基因轉(zhuǎn)變的能力，從而產(chǎn)生多樣的人源化免疫球蛋白所有組成成分。本發(fā)明提供的一種人源化Ig基因座是含有一個或多個V基因片段、一個或多個D基因片段、一個或多個J基因片段、以及一個或多個恒定區(qū)基因片段的人源化重鏈基因座，其中至少一個基因片段是人重鏈基因片段。人源化重鏈基因座中的基因片段以未重排、部分或完全重排的構(gòu)型彼此并列。優(yōu)選的人源化重鏈基因座含有人恒定區(qū)基因片段，優(yōu)選含Cα或Cγ。更優(yōu)選的人源化基因座含有多個V基因片段和至少一個人V基因片段，以及一個人重鏈恒定區(qū)片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。另一種人源化Ig基因座是含有一個或多個V基因片段、一個或多個J基因片段、以及一個或多個恒定區(qū)基因片段的人源化輕鏈基因座，其中至少一個基因片段是人輕鏈基因片段。人源化輕鏈基因座中的基因片段以未重排或重排的構(gòu)型彼此并列。優(yōu)選的人源化輕鏈基因座含有人恒定區(qū)基因片段，優(yōu)選含Cλ或Cκ。更優(yōu)選的人源化輕鏈基因座進一步含有多個V基因片段和至少一個人V基因片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。甚至更優(yōu)選的人源化輕鏈基因座含重排的人VJ片段，置于許多(如10-100)非人或人來源的VL基因片段下游。本發(fā)明的另一種實施方案涉及通過從非人動物分離Ig基因座或Ig基因座的一部分，并且將需要的人Ig基因片段整合至分離的動物Ig基因座或Ig基因座的分離部分而制備含人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體的方法。通過以保持基因座在非人動物中進行有效基因重排和基因轉(zhuǎn)變的方式進行連接或同源重組，將人Ig基因片段整合至分離的動物Ig基因座或Ig基因座的分離部分。通過同源重組進行的人Ig基因片段的整合可以通過使用本發(fā)明的重組載體而完成。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了制備能夠產(chǎn)生人源化抗體的轉(zhuǎn)基因動物的方法。該轉(zhuǎn)基因動物可以通過將含人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體或含人Ig基因片段的重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞或動物細(xì)胞，并且從基因修飾的受體細(xì)胞或細(xì)胞得到動物而獲得。提供了含一種或多種人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物和來源于所述轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞(例如來自于免疫的轉(zhuǎn)基因動物的B細(xì)胞)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物可以對轉(zhuǎn)基因的人源化Ig基因座進行基因重排和基因轉(zhuǎn)變，以產(chǎn)生多樣的人源化免疫球蛋白分子所有組成成分。附圖簡述圖1.牛Cγ3′側(cè)翼序列。引物表示于有陰影的塊中。5′引物位于CH3，3′引物位于M1?？寺?1、克隆3和克隆5的序列分別表示于SEQIDNO3，SEQIDNO4和SEQIDNO5。圖2.綿羊Cγ3′側(cè)翼序列。引物表示于有陰影的塊中。5′引物位于CH3，3′引物位于M2。克隆11和克隆1的序列分別表示于SEQIDNO8和SEQIDNO9。圖3.兔Cγ基因的新的3′端側(cè)翼序列(SEQIDNO10)。圖4.兔Cκ1基因3′的新核苷酸序列(SEQIDNO11)。圖5.兔Cγ基因5′的新核苷酸序列(SEQIDNO12和SEQIDNO13)。SEQIDNO12和SEQIDNO13之間的序列(大約1000nt的空位)有待確定。圖6.人、小鼠、大鼠、綿羊、牛和駱駝Cγ基因3′的M1和M2區(qū)的序列比較。圖7a.用于以人Cκ替代兔Cκ的DNA構(gòu)建體。一個含編碼人Cκ的DNA序列的0.5kb片段側(cè)翼為來自于兔Cκ1基因的序列。上游序列(5′Cκ)為2.8kb，下游序列(3′Cκ)為2.6kb。該載體也含有用于陽性選擇的lox-neo盒和用于陰性選擇的Hsv-Tk盒。圖7b.用于以人Cγ1替代兔Cγ的DNA構(gòu)建體。一個含編碼人Cγ1的DNA序列的1.8kb片段側(cè)翼為來自于兔Cγ基因的序列。上游序列(5′Cγ)為1.9kb，下游序列(3′Cγ)為3.1kb。該載體也含有用于陽性選擇的lox-neo盒和用于陰性選擇的Hsv-Tk盒。圖8.含有人免疫球蛋白重鏈Cγ1基因片段的DNA片段(SEQIDNO51)，其側(cè)翼為50個來源于兔Cγ基因側(cè)翼區(qū)的核苷酸。來源于兔Cγ基因側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列用下劃線標(biāo)出。圖9.含有與兔V元件具有大于80％序列等同性并且編碼人V元件多肽序列的V基因片段的DNA片段(SEQIDNO52)。來源于兔VH1和J基因的側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列用下劃線標(biāo)出。圖10.含有人免疫球蛋白重鏈Cκ基因片段的DNA片段(SEQIDNO53)，其側(cè)翼為50個來源于兔輕鏈免疫球蛋白κ1基因的核苷酸。來源于兔Cκ基因側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列用下劃線標(biāo)出。圖11.含有與兔V元件具有大于80％序列等同性并且編碼人V元件多肽序列的V基因片段的DNA片段(SEQIDNO54)。來源于兔V和J基因的側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列用下劃線標(biāo)出。圖12.含有編碼人免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)Cλ2的基因的DNA片段(SEQIDNO57)，其側(cè)翼為50個(用下劃線標(biāo)出)來源于雞Cλ基因側(cè)翼序列的核苷酸。圖13.用ET系統(tǒng)修飾雞輕鏈基因座。通過同源重組修飾具有全長輕鏈基因座的雞基因組BAC克隆。在第一步中，通過插入選擇盒而去除Cλ，在第二個同源重組步驟中，該盒與人Cλ基因交換。圖14.含有與雞V基因片段具有80％序列等同性并且編碼人VJ免疫球蛋白多肽多肽的VJ基因片段的DNA片段(SEQIDNO58)。來源于雞免疫球蛋白V和J基因的側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列用下劃線標(biāo)出。圖15.修飾的雞輕鏈基因座。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個實施方案提供了人源化的免疫球蛋白(抗體)?！叭嗽椿贵w”或“人源化免疫球蛋白”表示具有人免疫球蛋白多肽序列(或由人Ig基因片段編碼的多肽序列)的至少一部分的免疫球蛋白分子。本發(fā)明的人源化免疫球蛋白分子可以從經(jīng)基因工程化而產(chǎn)生人源化免疫球蛋白分子的轉(zhuǎn)基因非人動物分離。相對于從動物制備或從來源于動物的細(xì)胞制備的非人源化免疫球蛋白，這些人源化免疫球蛋白分子對靈長類動物，特別是人的免疫原性較低。此處用到的“非人動物”包括，但不限于，兔、豬、鳥類(如雞、火雞、鴨、鵝等)、綿羊、山羊、牛和馬。優(yōu)選的非人動物是主要依賴于基因轉(zhuǎn)變和/或體細(xì)胞超變而產(chǎn)生抗體多樣性的動物，如兔、豬、鳥類(如雞、火雞、鴨、鵝等)、綿羊、山羊、和牛。特別優(yōu)選的非人動物是兔和雞。在人和小鼠等動物中，在重鏈基因座上有多個拷貝的V，D和J基因片段，在輕鏈基因座上有多個拷貝的V和J基因片段。這些動物中的抗體多樣性主要由基因重排產(chǎn)生，即由基因片段的不同組合形成重排的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。然而，在其它動物(如兔、雞、綿羊、山羊和牛)中，基因重排在抗體多樣性的產(chǎn)生中不起顯著作用。例如，在兔中，僅有很少的V基因片段，最常見是V區(qū)3′末端的V基因片段，用于基因重排以形成連續(xù)的VDJ片段。在雞中，只有一個V基因片段(鄰接于D區(qū)，或“3′近端V基因片段″)，一個D片段和一個J片段用于重鏈重排；只有一個V基因片段(3′近端V片段)和一個J片段用于輕鏈重排。因此，在這些動物中，在連接多樣化得到的最初重排的可變區(qū)序列中幾乎沒有多樣化。重排的Ig基因的進一步多樣化通過基因轉(zhuǎn)變而完成，基因轉(zhuǎn)變是一種過程，其中來源于上游V基因片段的短序列替代了重排Ig基因中V基因片段內(nèi)的短序列。此處用到的“Ig基因片段”是指編碼Ig分子各部分的DNA的片段，這些片段存在于動物和人的種系中，并且一起進入B細(xì)胞以形成重排的Ig基因。因此，此處用到的Ig基因片段包括V基因片段、D基因片段、J基因片段和C區(qū)基因片段。此處用到的“人Ig基因片段”包括人Ig基因片段的天然存在序列、人Ig基因片段的天然存在序列的簡并形式，以及編碼與人Ig基因片段的天然存在序列所編碼的多肽基本等同的多肽序列的合成序列?！盎尽北硎景被嵝蛄械牡韧猿潭葹橹辽偌s85％-95％。本發(fā)明的優(yōu)選人源化免疫球蛋白分子含有人重鏈或輕鏈恒定區(qū)多肽序列的至少一部分。更優(yōu)選的免疫球蛋白分子含有人重鏈或輕鏈恒定區(qū)多肽序列的至少一部分，和人可變區(qū)多肽序列的至少一部分。在本發(fā)明的另一種實施方案中，提供了一種人源化抗體的制劑。“人源化抗體制劑”表示從轉(zhuǎn)基因非人動物(如動物血清、乳汁或卵黃)制備或從來源于轉(zhuǎn)基因非人動物的細(xì)胞(如B細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞)制備的一種分離的抗體產(chǎn)品或純化的抗體產(chǎn)品。人源化抗體制劑可以是多克隆抗體制劑，該多克隆抗體包括人源化免疫球蛋白分子的所有組成成分(repertoire)。人源化抗體制劑也可以是單克隆抗體制劑。盡管與非人源化單克隆抗體制劑相比，人源化單克隆抗體制劑對人的免疫原性也減少，但人源化的多克隆抗體制劑是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。已經(jīng)認(rèn)識到，當(dāng)以大量重復(fù)給藥時，人源化的單克隆抗體在靈長類動物(如人)中仍然激發(fā)一定程度的免疫應(yīng)答(抗獨特型應(yīng)答)，這是因為單克隆抗體的獨特的和新的獨特型。本發(fā)明獨一無二地認(rèn)識到，多克隆抗體的總體免疫原性較少依賴于抗獨特型應(yīng)答。例如，由非人動物制備的只有恒定區(qū)元件被人源化的多克隆抗體(例如，具有由人基因片段編碼的恒定區(qū)，以及具有由非人動物的內(nèi)源性基因編碼的可變區(qū)的多克隆抗體)對靈長類動物基本無免疫原性。不希望受到任何理論的限制，本發(fā)明人提出，這種人源化多克隆抗體制劑的免疫原性降低是由于該制劑含有極大量具有許多不同獨特型的不同抗體，所述獨特型很大程度由重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(CDR)中的新氨基酸序列所限定。因此，當(dāng)將這種制劑給予人等靈長類動物時，制劑中每種單個免疫球蛋白分子的給藥量可能太低，因此不能針對每種免疫球蛋白分子引起免疫應(yīng)答。因此，即使多克隆抗體制劑中的抗體都針對同一抗原，具有多種不同獨特型和可變區(qū)的人源化多克隆抗體制劑對接受者具有最小的免疫原性。為進一步減少任何潛在的殘余免疫原性，可以制備由具有人Ig基因片段所編碼的可變區(qū)和恒定區(qū)這兩者的免疫球蛋白分子組成的人源化多克隆抗體制劑。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了包含具有人重鏈或輕鏈恒定區(qū)多肽序列的至少一部分的人源化免疫球蛋白分子的抗體制劑。更優(yōu)選地，除人恒定區(qū)多肽序列的至少一部分，本發(fā)明的抗體制劑中的人源化免疫球蛋白進一步包含人可變區(qū)多肽序列的至少一部分。本發(fā)明的優(yōu)選人源化抗體制劑由從轉(zhuǎn)基因非人動物制備的人源化抗體組成，該動物的抗體多樣性主要由基因轉(zhuǎn)變產(chǎn)生，該動物如兔、鳥類(如雞、火雞、鴨、鵝等)、綿羊和牛；優(yōu)選為兔和雞。一旦制備了能夠產(chǎn)生多樣化的人源化免疫球蛋白分子的轉(zhuǎn)基因非人動物(如下文所進一步闡述)，通過用抗原免疫該動物就可以容易獲得抗該抗原的人源化免疫球蛋白和人源化抗體制劑。可以用各種抗原免疫轉(zhuǎn)基因宿主動物。這些抗原包括，存活的、減毒的或死亡的微生物，如病毒和單細(xì)胞生物(如細(xì)菌和真菌)，微生物片段或從微生物分離的抗原性分子。用于免疫動物的優(yōu)選細(xì)菌抗原包括從金黃色葡萄球菌純化的抗原，如5型和8型莢膜多糖、α毒素等毒性因子的重組形式、粘附素結(jié)合蛋白、膠原結(jié)合蛋白、和纖連蛋白結(jié)合蛋白。優(yōu)選的細(xì)菌抗原也包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、腸球菌、腸桿菌和肺炎克雷白氏桿菌的減毒形式，或這些細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液?？梢杂糜诿庖叩钠渌?xì)菌抗原包括純化的脂多糖(LPS)、莢膜抗原、莢膜多糖和/或外膜蛋白的重組形式、纖連蛋白結(jié)合蛋白、內(nèi)毒素和銅綠假單孢菌、腸球菌、腸桿菌和肺炎克雷白氏桿菌的外毒素。用于產(chǎn)生抗真菌的抗體的優(yōu)選抗原包括真菌的減毒形式或其外膜蛋白，該真菌包括，但不限于，白色假絲酵母，近平滑假絲酵母，熱帶假絲酵母，和新型隱球酵母。用于免疫以產(chǎn)生抗病毒抗體的優(yōu)選抗原包括病毒的被膜蛋白和病毒的減毒形式，所述病毒包括，但不限于呼吸道合胞病毒(RSV)(特別是F蛋白)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、EBV和HSV?？梢酝ㄟ^用分離的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系；腫瘤相關(guān)抗原免疫轉(zhuǎn)基因動物，產(chǎn)生用于癌癥治療的治療性抗體，所述腫瘤相關(guān)抗原包括，但不限于，Her-2-neu抗原(抗該抗原的抗體可用于治療乳腺癌)；CD20，CD22和CD53抗原(抗這些抗原的抗體可用于治療B細(xì)胞淋巴瘤)，(3)前列腺特異性膜抗原(PMSA)(抗該抗原的抗體可用于治療前列腺癌)，和17-1A分子(抗該抗原的抗體可用于治療結(jié)腸癌)?？梢圆捎萌我夥奖愕姆词綄⑦@些抗原可以給予轉(zhuǎn)基因宿主動物，可以使用或不使用佐劑，并且可以根據(jù)預(yù)定的方式給藥。免疫后，可以對被免疫的轉(zhuǎn)基因動物的血清或乳汁進行分級分離，以便純化特異于抗原的藥物級多克隆抗體。在轉(zhuǎn)基因鳥類中，可以通過對鳥卵進行分級分離而制備抗體?？梢酝ㄟ^層析(親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等)，用硫酸鋁等鹽、乙醇等有機溶劑或聚乙二醇等聚合物進行選擇性沉淀而獲得濃縮的、純化的免疫球蛋白級分。為制備單克隆抗體，從被免疫的轉(zhuǎn)基因動物分離脾細(xì)胞，用于與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系融合產(chǎn)生雜交瘤，或通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)克隆編碼抗體的cDNA并且在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達。制備單克隆抗體的程序是本領(lǐng)域公知的。見，例如歐洲專利申請0583980A1(″MethodForGeneratingMonoclonalAntibodiesFromRabbits″)，美國專利No.4,977,081(″StableRabbit-MouseHybridomasAndSecretionProductsThereof″)，WO97/16537(″StableChickenB-cellLineAndMethodofUseThereof″)，和EP0491057B1(″HybridomaWhichProducesAvianSpecificImmunoglobulinG″)，在此引入其公開內(nèi)容作為參考。從克隆的cDNA分子體外產(chǎn)生單克隆抗體的方法描述于Andris-Widhopfetal.，″Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay″，ImmunolMethods242159(2000)，和Burton，D.R.，″Phagedisplay″，Immunotechnology187(1995)，在此引入其公開內(nèi)容作為參考。在本發(fā)明的另一種實施方案中，純化的單克隆或多克隆抗體與適用于在靈長類動物特別是人中給藥的適當(dāng)藥用載體混合，以便提供藥物組合物?？梢杂糜谠撍幬锝M合物中的可藥用載體可以任意和所有的溶劑、分散介質(zhì)、等滲劑等。除了對受體或其中所含有的抗體的療效有害的任何常規(guī)介質(zhì)、試劑、稀釋劑或載體外，其在本發(fā)明的藥物組合物中的使用是適當(dāng)?shù)?。載體可以是液體、半固體，如糊，或固體載體。載體的例子包括油、水、鹽溶液、乙醇、糖、凝膠、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、樹脂、多孔基質(zhì)、粘合劑、填料、包衣、防腐劑等，或其組合。本發(fā)明進一步涉及新的核苷酸序列和載體，以及該序列和載體在制備產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因非人動物中的用途。簡言之，非人動物的基因工程包括將一個或多個人Ig基因片段整合至動物基因組，以產(chǎn)生一個或多個人源化Ig基因座。應(yīng)該理解的是，根據(jù)基因修飾中所使用的方法，人Ig基因片段可以被整合在動物的內(nèi)源性Ig基因座(例如作為定向插入的結(jié)果)，或整合在動物的不同基因座。也就是說，人源化Ig基因座可以位于動物內(nèi)源性Ig基因座通常所在的染色體位置，或位于動物內(nèi)源性Ig基因座通常所在位置以外的染色體位置。不論在染色體上的什么位置，本發(fā)明的人源化Ig基因座具有在非人動物中進行基因重排和基因轉(zhuǎn)變的能力，從而能夠產(chǎn)生多樣化的人源化免疫球蛋白分子所有組成成分。具有進行基因重排和基因轉(zhuǎn)變的能力的Ig基因座此處也稱作“功能性”Ig基因座，由功能性Ig基因座產(chǎn)生的具有多樣性的抗體此處也稱作“功能性”抗體或“功能性”抗體所有組成成分。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生人源化Ig基因座和制備能夠產(chǎn)生人源化免疫球蛋白分子的轉(zhuǎn)基因動物的新序列。具體地，本發(fā)明提供了來自于非人動物，優(yōu)選主要依賴于基因轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生抗體多樣性的動物(如兔、豬、綿羊、山羊、牛、鳥類，如雞、火雞、鴨、鵝等)的Ig基因片段5′和3′側(cè)翼區(qū)的序列。編碼恒定區(qū)的基因的5′和3′側(cè)翼區(qū)是特別重要的，因為這些序列含有的非翻譯調(diào)節(jié)元件(如增強子)對于血清中高Ig表達是關(guān)鍵的。編碼重鏈恒定區(qū)的基因的3′側(cè)翼區(qū)也含有編碼免疫球蛋白膜形式的膜和細(xì)胞質(zhì)尾的外顯子(Volginaetal.Immunol1656400，2000)。已經(jīng)證明抗體膜形式的膜和細(xì)胞質(zhì)尾對獲得抗體在小鼠血清中的高水平表達是關(guān)鍵的(Zouetal.，Science2621271，1993)。因此，對側(cè)翼序列的鑒定允許了用人的等價物替代Cγ基因的外顯子和間插內(nèi)含子，以及保持編碼跨膜和細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)的內(nèi)源性外顯子和內(nèi)源性非編碼增強子序列。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了非人動物重鏈恒定區(qū)的3′側(cè)翼序列。更具體地，提供了編碼兔Cγ、牛Cγ1，2，3和綿羊Cγ1，2的基因下游(3′，3-端(prime))的核苷酸序列。特別優(yōu)選的核苷酸序列包括SEQIDNO10(兔Cγ的3′)，SEQIDNOS3-5(牛Cγ1，2，3的3′)和SEQIDNOS8-9(綿羊Cγ1，2的3′)。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了非人動物輕鏈恒定區(qū)的3′側(cè)翼序列。更具體地，本發(fā)明提供了編碼兔Cκ的基因下游(3′，3-端)的核苷酸序列。特別優(yōu)選的核苷酸序列包括SEQIDNO11(兔Cκ的3′)。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了非人動物重鏈恒定區(qū)的5′側(cè)翼序列。更具體地，提供了編碼兔Cγ的基因上游(5′，5-端)的核苷酸序列。特別優(yōu)選的序列包括SEQIDNO12和SEQIDNO13。本發(fā)明的另一種實施方案非人動物輕鏈恒定區(qū)的5′側(cè)翼序列。本發(fā)明提供了上述新的側(cè)翼序列的部分?！耙徊糠帧北硎灸軌蚪閷?dǎo)人Ig基因片段和靶動物Ig基因片段之間的同源重組的側(cè)翼核苷酸序列的一個片段。一般地，對于在ES細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中的重組，一部分是至少約200個堿基對，優(yōu)選至少約400個堿基對，對于在大腸桿菌中的重組，一部分是至少約40個堿基對，優(yōu)選至少約50個堿基對。上述新的側(cè)翼序列的部分的例子包括SEQIDNOS59-60，61-62，63-64，65-66，67-68和69-70(分別由圖8-12和14中加下劃線的序列表示)。另一方面，本發(fā)明提供了用于以相應(yīng)的人Ig基因片段替代非人動物Ig基因片段的載體。這些載體此處也稱作“重組載體”，包括與5′端和3′端的側(cè)翼序列連接的人Ig基因片段，其中側(cè)翼序列與靶動物Ig基因片段的側(cè)翼序列有足夠介導(dǎo)人基因和動物基因片段之間的同源重組的同源性程度。一般地，為完成ES細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等動物細(xì)胞中的同源重組，重組載體中的側(cè)翼序列和靶基因的側(cè)翼序列之間應(yīng)該有至少約200個堿基相同；為完成大腸桿菌中的同源重組，應(yīng)該有至少約40個堿基相同。提供了用于替代動物免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)基因的重組載體，該載體從5′至3′含有靶動物重鏈恒定區(qū)基因5′側(cè)翼區(qū)的同源核苷酸序列，人重鏈恒定區(qū)基因(如人Cγ10)，以及靶動物重鏈恒定區(qū)基因3′側(cè)翼區(qū)的同源核苷酸序列。提供了用于替代兔重鏈恒定區(qū)基因的優(yōu)選重組載體。一種這樣的載體從5′至3′含有SEQIDNO12或SEQIDNO13所示核苷酸序列或其一部分，人重鏈恒定區(qū)基因片段，SEQIDNO10所示核苷酸序列或SEQIDNO10所示核苷酸的一部分。另一種這樣的載體含有SEQIDNO51(兔8)，其特征在于具有與來自于兔重鏈恒定區(qū)基因5′和3′側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列連接的人Cγ基因。也提供了用于替代動物免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)基因的重組載體。該載體從5′至3′含有靶輕鏈恒定區(qū)基因5′側(cè)翼區(qū)的同源核苷酸序列，人輕鏈恒定區(qū)基因(如人Cκ或Cλ)，以及靶輕鏈恒定區(qū)基因3′側(cè)翼區(qū)的同源核苷酸序列。優(yōu)選的載體包括用于替代兔輕鏈恒定區(qū)基因的載體。優(yōu)選的載體含有SEQIDNO53所示核苷酸序列，該序列的特征在于具有與來自于兔輕鏈Cκ1基因5′和3′側(cè)翼區(qū)的側(cè)翼序列連接的人Cκ基因。提供的其它重組載體包括那些用于替代動物IgV區(qū)元件的載體。例如，提供了用于替代兔重鏈V區(qū)元件的重組載體，該載體含有SEQIDNO52。提供了用于替代兔輕鏈V區(qū)元件的重組載體，該載體含有SEQIDNO54。本發(fā)明的重組載體可以包含其它序列，這些序列促進選擇進行了成功重組事件的細(xì)胞。例如，可以將編碼對新霉素、博萊霉素、嘌呤霉素等的抗性的標(biāo)記基因包含在重組載體內(nèi)，以促進選擇進行了成功重組事件的細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供了攜帶一種或多種人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體或載體。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了含人源化Ig重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，所述人源化Ig重鏈基因座含有一個或多個V基因片段、一個或多個D基因片段、一個或多個J基因片段、以及一個或多個恒定區(qū)基因片段，其中至少一個基因片段是人重鏈基因片段。這種人源化重鏈基因座中的基因片段以未重排構(gòu)型(或“種系構(gòu)型”)、或部分或完全重排的構(gòu)型彼此并列。人源化重鏈基因座在非人動物中具有進行基因重排(如果基因片段沒有完全重排)和基因轉(zhuǎn)變的能力，從而產(chǎn)生具有人多肽序列的多樣化的重鏈所有組成成分，或“人源化重鏈”。在一種優(yōu)選實施方案中，人源化重鏈基因座含有至少一種C區(qū)基因片段，該片段為人恒定區(qū)基因片段，優(yōu)選為Cα或Cγ(包括Cγ亞類1，2，3和4的任意一種)。在另一種更優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因的人源化重鏈基因座含有人源化V區(qū)和人源化C區(qū)，即，具有至少一個人VH基因片段的V區(qū)和具有至少一個人C基因片段的C區(qū)(如人Cα或Cγ)。優(yōu)選地，人源化V區(qū)包含至少約10-100個重鏈V(或“VH”)基因片段，其中至少一個是人VH基因片段。根據(jù)本發(fā)明，包含在轉(zhuǎn)基因中的人VH基因片段與宿主動物的VH基因片段，特別是包含在轉(zhuǎn)基因上游區(qū)中的動物VH基因片段具有至少約75％至約85％的同源性。如前面所述，人VH片段包括天然存在的人VH基因片段，天然存在的人VH基因片段的簡并形式，以及編碼與人重鏈V區(qū)多肽基本等同(即約85％-95％)的多肽序列的合成序列。人VH基因片段優(yōu)選位于轉(zhuǎn)基因基因座中非人VH片段的下游。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因中的非人VH基因片段是來自于宿主動物Ig基因座中3′VH區(qū)的VH基因片段，包括3′近端VH1。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了含人源化輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，所述人源化輕鏈基因座能夠在宿主動物中進行基因重排和基因轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生具有人多肽序列的多樣化的輕鏈所有組成成分，或“人源化輕鏈”。人源化輕鏈基因座含有一個或多個V基因片段、一個或多個J基因片段、以及一個或多個恒定區(qū)基因片段，其中至少一個基因片段是人輕鏈基因片段。這種人源化輕鏈基因座中的基因片段以未重排構(gòu)型(或“種系構(gòu)型”)、或部分或完全重排的構(gòu)型彼此并列。在一種優(yōu)選實施方案中，人源化輕鏈基因座含有至少一種C區(qū)基因片段，該片段為人恒定區(qū)基因片段，優(yōu)選為Cλ或Cκ。在另一種優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因的人源化輕鏈基因座含有人源化V區(qū)和人源化C區(qū)，即，具有至少一個人VL基因和/或至少一個重排的人VJ片段的V區(qū)和具有至少一個人C基因片段的C區(qū)(如人Cλ或Cκ)。優(yōu)選地，人源化V區(qū)包含至少約10-100個輕鏈V(或“VL”)基因片段，其中至少一個是人VL基因片段。包含在轉(zhuǎn)基因中的人VL基因片段與宿主動物的VL基因片段，特別是包含在轉(zhuǎn)基因上游區(qū)中的動物VL基因片段具有至少約75％至約85％的同源性。如前面所述，人VL片段包括天然存在的人VL基因片段，天然存在的人VL基因片段的簡并形式，以及編碼與人輕鏈V區(qū)多肽基本等同(即約85％-95％)的多肽序列的合成序列。人VL基因片段優(yōu)選位于轉(zhuǎn)基因基因座中非人VL片段的下游。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中的非人VL基因片段選自宿主動物輕鏈基因座中3′VL區(qū)的VL基因片段，包括3′近端VL1。在另一種優(yōu)選實施方案中，人源化輕鏈基因座包含重排的人VJ片段，位于許多(如10-100)非人或人來源的VL基因片段的下游。本發(fā)明的另一方面涉及制備含人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體的方法。這些方法包括從非人動物分離Ig基因座或其一部分，將所需人Ig基因片段插入分離的動物Ig基因座或動物Ig基因座的分離部分。以保留基因座在非人動物中進行有效基因重排和基因轉(zhuǎn)變的能力的方式進行連接或同源重組，從而將人Ig基因片段插入分離的動物Ig基因座或其部分。優(yōu)選地，從通過基因轉(zhuǎn)變產(chǎn)生抗體多樣性的動物，如兔和雞分離含有進行人源化的Ig基因座的DNA片段。這些大的DNA片段可以通過篩選從非人動物的基因組DNA制備的質(zhì)粒、粘粒、YACs或BACs等文庫而分離。完整的動物C區(qū)可以包含在一個質(zhì)?；蛘沉？寺≈?，隨后進行人源化。YAC克隆可以攜帶最多至2兆堿基的DNA片段，因此完整的動物重鏈基因座或其大部分可以在一個YAC克隆中分離，或經(jīng)重新構(gòu)建以使其包含在一YAC克隆中。BAC克隆可以攜帶更小的DNA片段(約150-250kb)。然而，含Ig基因座的重疊片段的多個BAC克隆可以被獨立人源化，隨后一起注射至動物受體細(xì)胞，其中重疊片段在接受的動物細(xì)胞中重組，以產(chǎn)生連續(xù)的Ig基因座?？梢酝ㄟ^各種方法將人Ig基因片段整合至載體(如BAC克隆)上的Ig基因座中，所述方法包括通過同源重組連接DNA片段或插入DNA片段。整合人Ig基因片段是以使人Ig基因片段可操作性連接至轉(zhuǎn)基因中的宿主動物序列的方式進行的，以產(chǎn)生功能性的人源化Ig基因座，即能夠進行基因重排和基因轉(zhuǎn)變的Ig基因座，所述基因重排和基因轉(zhuǎn)變導(dǎo)致多樣化的人源化抗體所有組成成分的產(chǎn)生。優(yōu)選地，通過同源重組將人Ig基因片段整合至Ig基因座中。同源重組可以在細(xì)菌、酵母和其它細(xì)胞中通過高頻率的重組事件而進行。例如，用含有動物Ig基因座或其大部分的YAC轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。隨后，用前面所描述的重組載體進一步轉(zhuǎn)化所述酵母細(xì)胞，該載體攜帶與5′側(cè)翼序列和3′側(cè)翼序列連接的人Ig基因片段。重組載體中的5′和3′側(cè)翼序列與YAC上的動物Ig基因片段的側(cè)翼序列同源。作為同源重組的結(jié)果，用人Ig基因片段代替YAC上的動物Ig基因片段。替代地，用含動物Ig基因座或其大部分的BAC轉(zhuǎn)化大腸桿菌等細(xì)菌細(xì)胞。用攜帶與5′側(cè)翼序列和3′側(cè)翼序列連接的人Ig基因片段的重組載體進一步轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌細(xì)胞。重組載體中的5′和3′側(cè)翼序列介導(dǎo)重組載體上的人Ig基因片段和BAC上的動物Ig基因片段之間的同源重組和交換。人源化的YACs和BACs可以容易從細(xì)胞分離，并且用于制備轉(zhuǎn)基因動物。在本發(fā)明的另一方面，提供了制備能夠產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物的方法。根據(jù)本發(fā)明，可以將上述一種或多種攜帶人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入動物的一個或多個受體細(xì)胞，并且從一個或多個受體細(xì)胞衍生動物，從而制備能夠產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物。優(yōu)選地，受體細(xì)胞來自于通過基因轉(zhuǎn)變和超變產(chǎn)生抗體多樣性的非人動物，如鳥類(如雞)、兔、牛等。在這些動物中，3′近端V基因片段優(yōu)先用于產(chǎn)生免疫球蛋白。通過替代動物的3’近端V基因片段或通過置于3’近端V基因片段緊鄰處而將人V基因片段整合至轉(zhuǎn)基因載體上的Ig基因座，導(dǎo)致人V區(qū)多肽序列在大多數(shù)免疫球蛋白中表達。替代地，可以將重排的人V(D)J片段插入轉(zhuǎn)基因載體上的免疫球蛋白基因座的J基因座。將含有人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入一個或多個受體細(xì)胞，然后通過隨機整合或定向整合而整合至一個或多個受體細(xì)胞的基因組。對于隨機整合，可以通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將含有人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入動物的受體細(xì)胞。例如，可以將轉(zhuǎn)基因載體直接注射至受精卵的原核中。也可以通過在卵受精之前將精子與轉(zhuǎn)基因載體共孵育而導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因載體。可以從受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因載體的另一種方式是通過轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞并且隨后將基因修飾的胚胎干細(xì)胞注射至發(fā)育中的胚胎。替代地，可以直接將轉(zhuǎn)基因載體(裸露的或與促進劑結(jié)合)注射至發(fā)育中的胚胎。最終，從含有整合至轉(zhuǎn)基因動物的至少一些體細(xì)胞的基因組中的人源化Ig轉(zhuǎn)基因的胚胎產(chǎn)生嵌合的轉(zhuǎn)基因動物。在一種優(yōu)選實施方案中，將含有人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因隨機整合至來源于內(nèi)源性免疫球蛋白基因表達受損的動物株的受體細(xì)胞(如受精卵或發(fā)育中的胚胎)的基因組中。這些動物株的使用允許來自于人源化轉(zhuǎn)基因Ig基因座的免疫球蛋白分子的優(yōu)先表達。這些動物的例子包括Alicia和Basilea兔株，以及無丙種球蛋白血癥的雞株。替代地，可以使具有人源化免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因或基因座的轉(zhuǎn)基因動物與內(nèi)源性免疫球蛋白表達受損的動物株交配?？梢垣@得對于受損的內(nèi)源性Ig基因座和人源化轉(zhuǎn)基因Ig基因座為雜合的后代。對于定向整合，可以將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)膭游锸荏w細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞或已經(jīng)分化的體細(xì)胞。此后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法選擇其中的轉(zhuǎn)基因被整合至動物基因組并且通過同源重組被相應(yīng)的內(nèi)源性Ig基因座替代的細(xì)胞。然后可以將所選擇的細(xì)胞與去核的核轉(zhuǎn)移單位細(xì)胞，如卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞融合，這些細(xì)胞為全能的，可以形成有功能的新生動物。根據(jù)已經(jīng)確立的常規(guī)技術(shù)進行融合。見，例如，Cibellietal.，Science(1998)2801256。也可以通過顯微手術(shù)采用注射移液管進行卵母細(xì)胞去核和核轉(zhuǎn)移。(見，例如Wakayamaetal.，Nature(1998)394369.)然后將得到的卵的細(xì)胞收獲于適當(dāng)培養(yǎng)基中，并且轉(zhuǎn)移至同步的受體中，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。替代地，可以將所選擇的基因修飾的細(xì)胞注射至發(fā)育中的胚胎，該胚胎隨后發(fā)育成嵌合動物。在本發(fā)明的另一方面，也可以將上述一種或多種重組載體導(dǎo)入一個或多個受體細(xì)胞，所述載體攜帶連接于與內(nèi)源性Ig基因片段的側(cè)翼序列同源的5’和3’側(cè)翼序列的人Ig基因片段，選擇其中的內(nèi)源性Ig基因片段通過同源重組而被人Ig基因片段替代的細(xì)胞，并且從所選擇的基因修飾的一個或多個受體細(xì)胞衍生動物，從而制備產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物。類似于轉(zhuǎn)基因載體的定向插入，適于作為該方法中的受體細(xì)胞的細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞或已經(jīng)分化的體細(xì)胞。攜帶人Ig基因片段的重組載體可以通過任何可行的方法，如轉(zhuǎn)染，被導(dǎo)入這些受體細(xì)胞中。此后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法選擇其中通過同源重組用人Ig基因片段取代了相應(yīng)的內(nèi)源性Ig基因片段的細(xì)胞。這些基因修飾的細(xì)胞可以作為核轉(zhuǎn)移程序中的核供體細(xì)胞，用于克隆轉(zhuǎn)基因動物。替代地，可以將所選擇的基因修飾的胚胎干細(xì)胞注射至發(fā)育中的胚胎，該胚胎隨后發(fā)育成嵌合動物。由前述任一種方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物形成了本發(fā)明的另一種實施方案。轉(zhuǎn)基因動物在基因組中具有至少一個，即一個或多個人源化Ig基因座，由其產(chǎn)生功能性的人源化抗體所有組成成分。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了基因組中具有一個或多個人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因兔。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因兔可以對人源化Ig基因座進行重排和基因轉(zhuǎn)變，并且表達功能性的人源化抗體所有組成成分。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了基因組中具有一個或多個人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因雞。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因兔可以對人源化Ig基因座進行重排和基因轉(zhuǎn)變，并且表達功能性的人源化抗體所有組成成分。來自于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞，如來自于用一種抗原免疫的轉(zhuǎn)基因動物所建立的B細(xì)胞或細(xì)胞系也是本發(fā)明的一部分。在本發(fā)明的另一方面，提供了通過給予純化的人源化抗體組合物，優(yōu)選人源化多克隆抗體組合物而治療需要對疾病進行治療的靈長類動物，特別是人類主體的疾病的方法。用于給藥的人源化多克隆抗體組合物的特征一般在于含有多克隆抗體群，其免疫球蛋白濃度為0.1-100mg/ml，更通常1-10mg/ml?？贵w組合物可以含有各種同種型的免疫球蛋白。替代地，抗體組合物可以含僅一種同種型的抗體，或含一些選擇的同種型的抗體。大多數(shù)情況下，抗體組合物由從動物制備的沒有額外修飾，如化學(xué)或酶修飾的修飾免疫球蛋白，即人源化抗體組成。替代地，免疫球蛋白級分可以接受酶消化(如用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纖溶酶、糖苷酶、核酸酶等)、加熱等處理，和/或進一步分級分離。一般將抗體組合物給藥至血管系統(tǒng)，方便地通過注射或經(jīng)植入適當(dāng)靜脈中的導(dǎo)管進行靜脈給藥。以適當(dāng)?shù)乃俣冉o予抗體組合物，一般為約10分鐘至24小時，更通常約30分鐘至約6小時，根據(jù)患者可接受液體的速度?？梢栽趩未屋斪⒒蛞幌盗休斪⒅薪o予有效劑量，可以每日一次、每周一次、每月一次或每三個月一次進行重復(fù)輸注，取決于抗體制劑的半衰期和臨床適應(yīng)癥。對于應(yīng)用于上皮表面，抗體組合物可以以足夠提供想要達到的最終結(jié)果的量應(yīng)用于需要治療的表面，并且可以根據(jù)需要而重復(fù)?？梢杂每贵w組合物結(jié)合和中和人體組織中導(dǎo)致疾病或引發(fā)不需要的或異常免疫應(yīng)答的抗原性實體。此處的“抗原性實體”的定義包括任意可溶性或細(xì)胞表面結(jié)合的分子，包括蛋白和細(xì)胞或?qū)е录膊〉纳矬w或試劑，它們至少能夠結(jié)合抗體，優(yōu)選也能夠刺激免疫應(yīng)答。作為單獨治療或與化療聯(lián)合進行的抗感染劑的抗體組合物給藥導(dǎo)致感染顆粒的清除?？贵w的單次給藥一般使感染性顆粒減少10-100倍，更常見減少1000倍以上。同樣，惡性疾病患者中作為單獨治療或與化療聯(lián)合進行的抗體治療一般使惡性細(xì)胞的數(shù)目減少10-100倍，或1000倍以上?？梢栽谘娱L的時間中重復(fù)治療，以保證感染性顆粒、惡性細(xì)胞等的完全清除。在一些情況下，在缺乏可檢測量的感染性顆?；虿涣技?xì)胞的情況下，用抗體制劑進行的治療將持續(xù)延長的時間段。同樣，用抗體治療調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答可以由治療性抗體的單次或多次給藥組成。治療可以在沒有任何疾病癥狀的情況下持續(xù)延長的時間段。可以與劑量足以抑制感染性疾病或惡性疾病的化療聯(lián)合使用目標(biāo)治療。在自身免疫病患者或移植物受體中，可以與劑量足以抑制免疫反應(yīng)的免疫抑制劑治療聯(lián)合使用抗體治療。通過以下實施例進一步說明本發(fā)明，但并不對其進行限制。實施例1牛、綿羊和兔Cγ基因3’的新序列用QIAampDNA血液試劑盒(QIAGEN)從西門塔牛的血液中分離基因組DNA。用分離的基因組DNA作為模板并且用以下引物PCR擴增牛Cγ基因3’的基因組區(qū)(即牛Cγ基因3’側(cè)翼序列)5′引物5′cgcaagcttCCTACACGTGTGTGGTGATG3′(SEQIDNO1)；3′引物5′cgcaagcttAAGATGGWGATGGTSGTCCA3′(SEQIDNO2)(通用簡并代碼W＝(A/T)S＝(G/C))。5’引物的大寫部分來自于Cγ的外顯子3，小寫部分代表末端HindIII限制位點。3’引物的大寫部分是根據(jù)來自于人M1外顯子和小鼠M1外顯子的公開序列設(shè)計的簡并序列，小寫部分代表末端HindIII限制位點。用EXPAND長模板PCR系統(tǒng)(Roche)獲得1.3kbPCR片段。用凝膠純化該片段，用HindIII消化并且克隆至Bluescript克隆載體中。得到的克隆屬于三個群，相互之間的不同之處在于用BamHI，EcoRI和XhoI獲得的限制片段模式。對從每一個群獲得的一個克隆進行測序，序列表示于圖1(SEQIDNOS3-5)。用QIAampDNA血液試劑盒(QIAGEN)從美利奴綿羊的血液中分離基因組DNA。用分離的基因組DNA作為模板并且用以下引物PGR擴增綿羊Cγ基因3’的基因組區(qū)(即綿羊Cγ基因3’側(cè)翼序列)5′引物5′cgcggatccCCTACGCGTGTGTGGTGATG3′(SEQIDNO6)3′引物5′cgcggatccACCGAGGAGAAGATCCACTT3′(SEQIDNO7)5’引物的大寫部分來自于Cγ的外顯子3，小寫部分代表末端BamHI限制位點。3’引物的大寫部分是根據(jù)來自于人M2外顯子和小鼠M2外顯子的公開序列設(shè)計的簡并序列，小寫部分代表末端BamHI限制位點。用EXPAND長模板PCR系統(tǒng)(Roche)獲得2.9kbPCR片段。用凝膠純化該片段，用BamHI消化并且克隆至Bluescript克隆載體中。得到的克隆屬于兩個群，相互之間的不同之處在于用HindIII，EcoRI和XhoI獲得的限制片段模式。對從每一個群獲得的一個克隆進行測序，序列表示于圖2(SEQIDNOS8-9)。從基因組粘?？寺?來自于Knightetal.，JImmunol(1985)1245-50，″Organizationandpolymorphismofrabbitimmunoglobulinheavychaingenes″的cos8.3)亞克隆含Cγ基因及其來自于A2同種異體兔的側(cè)翼序列的10kbEcoRI片段。用標(biāo)準(zhǔn)方法測定Cγ的5’和3’核苷酸序列，分別見圖3和5，SEQIDNO10，12，13。從VJk2CkInpSV2neo的EcoRI/BamHI亞克隆測定兔Cκ1的3’的序列。核苷酸序列表示于圖4，SEQIDNO11。從上述3’側(cè)翼序列推測由牛、綿羊和兔M1和M2外顯子編碼的氨基酸序列。這些氨基酸序列與公開的駱駝、人和小鼠M1和M2序列進行了對比，見圖6。實施例2用于以人Cγ1片段替代兔內(nèi)源性Cγ基因片段的載體從a2純合兔的兔胚胎成纖維細(xì)胞分離基因組DNA。采用以下引物，通過PCR擴增兔Cγ上游的DNA序列(即兔Cγ的5’側(cè)翼序列)5′taattatgcggccgcCTTCAGCGTGAACCACGCCCTC3′(SEQIDNO39)，具有5′NotI位點和5′GTCGACGCCCCTCGATGCACTCCCAGAG3′(SEQIDNO40)。采用以下引物，擴增兔Cγ下游的DNA序列(即兔Cγ的3’側(cè)翼序列)5′ggtaccCTCTCCCTCCCCCACGCCGCAGC3′(SEQIDNO41)，具有5′KpnI位點和5′atatctcagaACTGGCTGTCCCTGCTGTAGTACACGG3′(SEQIDNO42)，具有5′XhoI位點。從人外周血淋巴細(xì)胞分離人基因組DNA。用以下引物擴增編碼人Cγ1的DNA片段5′GTCGACACTGGACGCTGAACCTCGCGG3′(SEQIDNO43)和5′GGTACCGGGGGCTTGCCGGCCGTCGCAC3′(SEQIDNO44)。用限制酶消化片段，克隆至Bluescript載體。隨后，將loxneo盒插入SalI位點，將Hsv-tk盒插入XhoI位點。最終的構(gòu)建體的示意圖見圖7a。實施例3用于以人Cκ片段替代兔內(nèi)源性Cκ基因片段的載體從b5純合兔的兔胎成纖維細(xì)胞分離基因組DNA。采用以下引物，通過PCR擴增兔Cκ1上游的DNA序列(即兔Cκ1的5’側(cè)翼序列)5′gcggccgcTGGCGAGGAGACCAAGCTGGAGATCAAACG3′(SEQIDNO45)，具有5′NotI位點5′GTCGACGCAGCCCAAAGCTGTTGCAATGGGGCAGCG3′(SEQIDNO46)。采用以下引物，擴增兔Cκ1下游的DNA序列(即兔Cκ1的3’側(cè)翼序列)5′atatggtaccGCGAGACGCCTGCCAGGGCACCGCC3′(SEQIDNO47)，具有5′KpnI位點5′GGATCCCGAGCTTTATGGGCAGGGTGGGGG3′(SEQIDNO48)。從人外周血淋巴細(xì)胞分離人基因組DNA。用以下引物擴增編碼人Cκ的DNA片段5′ATATGTCGACCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCC3′(SEQIDNO49)5′CTAGGTACCAGCAGGTGGGGGCACTTCTCCC3′(SEQIDNO50)。用限制酶消化片段，克隆至Bluescript載體。隨后，將loxneo盒插入SalI位點，將Hsv-tk盒插入XhoI位點。最終的構(gòu)建體的示意圖見圖7b。實施例4用相應(yīng)的人基因片段替代兔胎成纖維細(xì)胞中的內(nèi)源性Cγ和Cκ基因片段通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備兔胎成纖維細(xì)胞。一次傳代后，用5μg圖5a所示的NotI線性化的Cγ定向載體，或用5μg圖51b所示的NotI線性化的Cκ定向載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，將其種植于96孔板中(2×103細(xì)胞/孔)。用600μg/mlG418進行陽性選擇和用200nMFIAU進行陰性選擇后，將具有抗性的集落雙份平鋪于兩個96孔板，分別進行DNA分析和冷凍保存。進行PCR和/或DNA印跡分析以鑒定人Cγ1基因片段整合至基因組中的細(xì)胞。如實施例5中的描述將具有整合的人Cγ1基因的細(xì)胞用于兔的克隆。實施例5兔的克隆通過每12小時皮下注射卵泡刺激素(FSH)(0.3mg×2和0.4mg×4)，使成熟的荷蘭Belton兔。在最后一次FSH注射后12小時，通過靜脈給予0.5mg促黃體生成素(LH)誘導(dǎo)排卵。通過LH注射后17小時的排卵高潮回收卵母細(xì)胞。成熟后16-19小時對卵母細(xì)胞進行機械去核。在紫外光下用bisBENZIMIDE(HOECHST33342，Sigma，St.Louis，MO)染料評估染色體去除。使用一次180V/cm的電脈沖15us(ElectrocellManipulator200，Genetronics，SanDiego，CA)，使去核的卵母細(xì)胞與活躍分裂的成纖維細(xì)胞融合。3-5小時后，用鈣離子載體(6μM)(#407952，Calbiochem，SanDiego，CA)對卵母細(xì)胞機械活化4分鐘，用2mM6-二甲基氨基嘌呤(DMAP，Sigma)在含3mg/ml牛血清白蛋白(無脂肪酸，Sigma)CR2(SpecialtyMedia，Lavalett，NJ)中對卵母細(xì)胞活化3小時?；罨螅瑢⑴咛ピ趥}鼠胚胎培養(yǎng)基(HECM)-Hepes中洗滌5次，然后在37.8℃，含5％CO2的空氣中，在含3mg/ml無脂肪酸的BSA的CR2培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-48小時。然后將胚胎轉(zhuǎn)移至同步化的受體中。通過PCR分析后代中的轉(zhuǎn)基因片段。實施例6構(gòu)建含具有人Cγ1基因片段和編碼人VH結(jié)構(gòu)域多肽序列的VH基因片段的兔重鏈基因座的一部分的DNA片段對來自于a2同種異型兔的兔重鏈Cγ基因的上游和下游區(qū)(即5′和3′側(cè)翼序列)進行測序。采用重疊的寡核苷酸，通過PCR產(chǎn)生DNA片段(SEQIDNO51)，其中DNA片段從5′至3′含有來源于兔γ基因5′側(cè)翼區(qū)的序列，人Cγ1基因，以及來源于兔Cγ基因3′側(cè)翼區(qū)的序列(圖8)。通過標(biāo)準(zhǔn)程序產(chǎn)生來自于a2同種異型兔的基因組BAC文庫，用兔Cγ的特異性探針篩選。鑒定了含兔重鏈基因片段的BAC克隆。在大腸桿菌中，使用SEQIDNO51的DNA片段和pET系統(tǒng)，通過同源重組用人Cγ1基因替代該BAC克隆上的兔Cγ基因。該替代是通過兩個連續(xù)的重組步驟完成的首先用標(biāo)記基因替代兔Cγ基因片段；然后用人Cγ1基因片段替代標(biāo)記基因。通過用合成的VH基因片段替代3’近端VH1片段而進一步修飾含兔重鏈基因和插入的人Cγ1基因的修飾BAC克隆(圖9)。采用重疊的寡核苷酸制備合成的VH基因片段(SEQIDNO52)，該片段包含5’側(cè)翼序列，3’側(cè)翼序列，以及編碼幾乎等同于Huang和Stollar(J.Immunol.1515290-5300，1993)描述的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的多肽的序列。合成VH基因片段的編碼序列是基于公開的兔VH1基因序列(a2，KnightandBecker，Cell60963-970，1990)設(shè)計的，其80％以上等同于兔VH基因片段。合成VH片段中的5′和3′側(cè)翼序列來源于a2同種異型兔VH1基因的上游和下游區(qū)。使用pET或redεβγ系統(tǒng)，通過同源重組用SEQIDNO52的合成VH基因替代BAC克隆上的兔VH1基因。用標(biāo)準(zhǔn)程序擴增和純化修飾的BAC克隆。實施例7構(gòu)建含具有人Cκ基因片段和編碼人VL結(jié)構(gòu)域多肽序列的VJ基因片段的兔輕鏈基因座的一部分的DNA片段對來自于b5同種異型兔的兔輕鏈Cκ1基因的上游和下游區(qū)(即5′和3′側(cè)翼序列)進行測序。采用重疊的寡核苷酸，通過PCR產(chǎn)生DNA片段(SEQIDNO53)，其中DNA片段從5′至3′含有來源于兔κ1基因5′側(cè)翼區(qū)的序列，人Cκ1基因，以及來源于兔Cκ1基因3′側(cè)翼區(qū)的序列(圖10)。通過標(biāo)準(zhǔn)程序產(chǎn)生來自于b5同種異型兔的基因組BAC文庫，用兔Cκ1的特異性探針篩選。鑒定了含兔輕鏈基因片段的BAC克隆。在大腸桿菌中，使用pET或redεβγ系統(tǒng)，通過同源重組用人Cκ1基因替代該BAC克隆上的兔Cκ1基因。該替代是通過兩個連續(xù)的重組步驟完成的首先用標(biāo)記基因替代兔Cκ1基因片段；然后用人Cκ1基因片段替代標(biāo)記基因。通過將重排的VJDNA片段插入兔輕鏈基因座的J區(qū)而進一步修飾含兔輕鏈基因和插入的人Cκ1基因的修飾BAC克隆(圖9)。重排的VJDNA片段編碼由Pritsch等(Blood82(10)3103-3112，1993)和Lautner-Rieske等(Eur.JImmunol.22(4)，1023-1029，1992))描述的人免疫球蛋白可變區(qū)多肽(圖7)。重排的VJ片段的核苷酸序列設(shè)計為使核苷酸水平上與Lieberman等(J.Immunol.133(5)，2753-2756，1984)公開的兔Vκ序列具有最大的序列同源性。該重排的VJDNA序列80％以上等同于已知的兔Vκ基因。采用重疊的寡核苷酸，通過PCR使重排的VJDNA片段連接于5’和3’側(cè)翼序列，得到SEQIDNO54的DNA片段(圖11)。5’側(cè)翼序列來源于兔Vκ的5’，3’側(cè)翼序列來源于兔J2的3’。隨后在大腸桿菌中，使用pET或redεβγ系統(tǒng)，將SEQIDNO54的DNA片段插入兔輕鏈基因座。插入的方式使兔輕鏈區(qū)含有兔Vκ1基因片段，兔J1和J2片段，其間的序列被重排的VJDNA片段替代。同樣，用標(biāo)記基因替代兔的V至J區(qū)，然后用重排的VJDNA片段替代標(biāo)記基因，以便完成該插入。用標(biāo)準(zhǔn)程序擴增和純化修飾的BAC克隆。實施例8表達人源化免疫球蛋白輕和/或重鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因兔根據(jù)Fan等(Pathol.Int.49583-594，1999)的描述產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因兔。簡言之，用標(biāo)準(zhǔn)方法使雌兔過量排卵，并且與雄兔交配。從輸卵管收集原核階段的受精卵，置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，如補加了20％胎牛血清的Dulbecco′s磷酸緩沖鹽水。在一對操縱器的幫助下將外源性DNA(如來自于實施例4和/或5的人源化BAC克隆，在注射前線性化)微注射至雄性原核中。將形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為存活的受精卵轉(zhuǎn)移至假孕兔的輸卵管中。假孕是通過注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)而誘導(dǎo)的。大約0.1-1％注射的受精卵發(fā)育成存活的轉(zhuǎn)基因兔。采用轉(zhuǎn)基因的特異性探針的DNA印跡分析證實了轉(zhuǎn)基因在基因組中的整合。采用從轉(zhuǎn)基因兔的B細(xì)胞(在血液、脾和/或淋巴結(jié)中)分離的RNA制備cDNA。用人轉(zhuǎn)基因(人CH基因片段或合成的人源化VH基因片段)的特異性引物從cDNA產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。對擴增產(chǎn)物的觀察表明該轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因動物中重排，重排的轉(zhuǎn)基因在動物中轉(zhuǎn)錄。對擴增產(chǎn)物進行測序，來自于上游V基因的供體序列的存在表明導(dǎo)入動物種系的轉(zhuǎn)基因進行了基因轉(zhuǎn)變。用ELISA分析測定轉(zhuǎn)基因生成(founder)兔的血清中含人IgG和/或人κ輕鏈抗原決定簇的抗體的存在。實施例9從具有Alicia和/或Basilea兔株的遺傳背景的轉(zhuǎn)基因兔中產(chǎn)生人源化抗體Alicia株缺乏VH1基因片段，因此Ig重鏈表達受損。例如，通過使用上述實施例4-5從Alicia兔建立的胎成纖維細(xì)胞，或使用上述實施例8與雄性Alicia兔交配的雌性Alicia兔的受精卵，產(chǎn)生能夠在Alicia兔株的遺傳背景中表達人源化重鏈分子的轉(zhuǎn)基因生成兔。也獲得了對AliciaIg表型為純合并且對人源化重鏈轉(zhuǎn)基因為純化的轉(zhuǎn)基因動物。在ELISA中檢測血清中人源化重鏈(如人重鏈恒定區(qū))的存在。相對于從整合至野生型(非Alicia)兔的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的抗體濃度，這些具有人源化Ig重鏈的純合Alicia動物中的抗體濃度顯著更高，如高約10-100倍。Basilea株不表達κ1輕鏈，該位置上專門表達κ2和λ輕鏈。例如，通過使用上述實施例4-5從Basile兔建立的胎成纖維細(xì)胞，或使用上述實施例8與雄性Basilea兔交配的雌性Basile兔的受精卵，產(chǎn)生能夠在Basilea兔株的遺傳背景中表達人源化輕鏈分子的轉(zhuǎn)基因生成兔。也獲得了對BasileaIg輕鏈表型為純合并且對人源化輕鏈轉(zhuǎn)基因為純化的轉(zhuǎn)基因動物。在ELISA中檢測血清中人源化輕鏈的存在。相對于具有野生型(非Basile)遺傳背景的轉(zhuǎn)基因兔中的人源化輕鏈濃度，純合Basile動物中的人源化輕鏈濃度顯著更高，高約10-100倍。轉(zhuǎn)基因生成兔互相交配，產(chǎn)生具有以下性狀的轉(zhuǎn)基因兔(1)具有至少一種人源化輕鏈轉(zhuǎn)基因，(2)具有至少一種人源化重鏈轉(zhuǎn)基因，(3)對Alicia重鏈基因座為純合，和(4)對Basilea輕鏈基因座為純合。實施例10構(gòu)建含具有人Cλ2基因片段和編碼人VL結(jié)構(gòu)域的VJ基因片段的修飾的雞輕鏈基因座的DNA片段用雞輕鏈Cλ和雞Vpsi25(在輕鏈基因座最5’的V基因片段)的特異性放射性標(biāo)記的探針篩選來源于junglefowl雞的基因組BAC文庫。鑒定了含完整λ輕鏈基因座的BAC克隆。在大腸桿菌中，如下使用pET系統(tǒng)(Zhangetal.，Nat.Biotechnol.18(12)1314-7，2000)，通過同源重組用人Cλ2基因替代該BAC克隆上的雞Cλ2基因。用Tn5基因的特異性引物通過PCR產(chǎn)生含卡那霉素選擇盒的第一個DNA片段。將5’引物(5′catacacagccatacatacgcgtgtggccgctctgcctctctcttgcaggTATGGACAGCAAGCGAACCG3′，SEQIDNO55)設(shè)計為在5’末端(小寫字母)包含來源于雞輕鏈Cλ基因的5’側(cè)翼區(qū)的50bp。將3’引物(5′atcagggtgacccctacgttacactcctgtcaccaaggagtgggagggacTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG3′，SEQIDNO56)設(shè)計為在末端(小寫字母)包含來源于雞輕鏈Cλ基因的3’側(cè)翼區(qū)的50bp。采用重疊的寡核苷酸，合成第二個DNA片段(SEQIDNO57)，其中DNA片段從5′至3′含有來源于雞輕鏈Cλ基因5′側(cè)翼區(qū)的序列，人Cλ2基因，以及來源于雞Cλ基因3′側(cè)翼區(qū)的序列(圖12)。用在誘導(dǎo)型啟動子作用下表達recE和recT功能的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雞輕鏈BAC克隆的大腸桿菌細(xì)胞。然后用上述第一個DNA片段轉(zhuǎn)化用重組治療轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，此后在含卡那霉素的培養(yǎng)基中選擇。鑒定抗卡那霉素的克隆，通過限制酶消化證實經(jīng)同源重組用卡那霉素選擇盒替代了雞Cλ片段。在第二個同源重組步驟中，用上述第二個DNA片段轉(zhuǎn)化卡那霉素選擇盒陽性細(xì)胞。篩選被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的卡那霉素抗性丟失，這表示人Cλ2基因替代了卡那霉素選擇盒。通過限制酶消化和/或序列分析證實交換。ET克隆程序概括于圖13。通過插入重排的VJDNA片段進一步修飾含雞輕鏈基因座和插入的人Cλ2基因片段的BAC克隆。重排的VJDNA片段編碼Kametanietal.(J.Biochem.93(2)，421-429，1983)描述的人免疫球蛋白可變區(qū)多肽IGλ鏈V-1區(qū)NIG-64(P01702)(圖14)。重排的VJ片段的核苷酸序列設(shè)計為使核苷酸水平上與McCormack等(Cell56，785-791，1989)公開的雞Vλ1序列具有最大的序列同源性。該重排的VJDNA序列80％以上等同于已知的雞輕鏈V基因。使重排的VJDNA片段連接于5’和3’側(cè)翼序列，得到SEQIDNO58的DNA片段(圖14)。5’側(cè)翼序列來源于雞Vλ1的5’，3’側(cè)翼序列來源于雞J的3’。如圖15所示，隨后在大腸桿菌中，使用pET系統(tǒng)，將SEQIDNO58的DNA片段插入雞輕鏈基因座。插入的方式使雞輕鏈基因座上從雞Vλ1基因片段的5’末端至雞J區(qū)的3’末端的區(qū)域被重排的合成VJDNA片段替代。同樣，用標(biāo)記基因替代雞的V-J區(qū)，然后用重排的VJDNA片段替代標(biāo)記基因，以便完成該插入。用標(biāo)準(zhǔn)程序擴增和純化修飾的BAC克隆。實施例11構(gòu)建含具有人Cγ1基因片段和編碼人VH結(jié)構(gòu)域多肽序列的VH基因的雞重鏈基因座的一部分的DNA片段用標(biāo)準(zhǔn)程序產(chǎn)生junglefowl雞的基因組BAC文庫，用雞Cγ1的特異性探針篩選。鑒定了含完整λ重鏈基因座的BAC克隆。對重鏈Cγ基因的上游和下游區(qū)(即5’和3’側(cè)翼區(qū))進行測序。在大腸桿菌中，如下使用pET系統(tǒng)，通過同源重組用人Cγ1基因替代該BAC克隆上的雞Cγ基因。用Tn5基因的特異性引物通過PCR產(chǎn)生含卡那霉素選擇盒的第一個DNA片段。將5’引物和3’引物設(shè)計為末端包含來源于雞重鏈Cγ1基因的5’和3’側(cè)翼區(qū)的50bp。采用重疊的寡核苷酸，通過PCR產(chǎn)生第二個DNA片段，其中DNA片段從5′至3′含有來源于雞重鏈Cγ基因5′側(cè)翼區(qū)的約50bp的序列，人Cγ1基因，以及來源于雞Cγ基因3′側(cè)翼區(qū)的約50bp的序列。用在誘導(dǎo)型啟動子作用下表達recE和recT功能的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雞CYBAC克隆的大腸桿菌細(xì)胞。然后用上述第一個DNA片段轉(zhuǎn)化用重組治療轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，此后在含卡那霉素的培養(yǎng)基中選擇。鑒定抗卡那霉素的克隆，通過限制酶消化證實經(jīng)同源重組用卡那霉素選擇盒替代了雞Cγ片段。在第二個同源重組步驟中，用上述第二個DNA片段轉(zhuǎn)化卡那霉素選擇盒陽性細(xì)胞。篩選被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的卡那霉素抗性丟失，這表示人Cγ1基因替代了卡那霉素選擇盒。通過限制酶消化和/或序列分析證實交換。通過用合成VH基因片段替代3’近端VH1片段(即V區(qū)中的3’近端VH1基因)而進一步修飾含插入的人Cγ1基因的BAC克隆?；诠_的雞VH1基因序列(Arakawaetal.，EMBOJ15(10)25402546，1996)設(shè)計合成的VH基因片段。合成的基因片段80％以上等同于雞VH基因片段，并且其編碼的氨基酸序列等同于由Matthyssens和Rabbitss(SteinbergCMandLefkovitsI，(eds).TheImmuneSystem132-138，S.Karger，NY1981)描述的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)多肽的氨基酸序列。采用重疊的寡核苷酸，通過PCR合成包含5’和3’側(cè)翼序列的合成VH片段。5’和3’側(cè)翼序列來源于雞VH1基因的上游和下游區(qū)。采用pET系統(tǒng)，通過同源重組用合成VH片段替代BAC克隆上的雞VH1基因。用標(biāo)準(zhǔn)程序擴增和純化修飾的BAC克隆。實施例12表達人源化免疫球蛋白輕和/或重鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因雞通過以下文獻中描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實施轉(zhuǎn)基因雞的產(chǎn)生Etchesetal.，MethodsinMolecularBiology62433-450；Painetal.，CellsTissuesOrgans1999；165(3-4)212-9；Sang，H.，″Transgenicchickens--methodsandpotentialapplications″，TrendsBiotechnol12415(1994)；和WO200075300，″Introducinganucleicacidintoanaviangenome，usefulfortransfectingavianblastodermalcellsforproducingtransgenicaviananimalswiththedesiredgenes，bydirectlyintroducingthenucleicacidintothegerminaldiscoftheegg″。簡言之，將修飾的BAC克隆線性化，并且與轉(zhuǎn)染試劑混合，以促進DNA攝取至細(xì)胞中。將制劑注射至緊鄰于胚盤的多細(xì)胞階段的雞胚胎中。關(guān)閉卵殼上的窗，并且孵育卵。通過PCR和采用轉(zhuǎn)基因的特異性探針的DNA印跡分析鑒定孵化出的嵌合雞。通過采用轉(zhuǎn)基因的特異性探針的DNA印跡分析證實了轉(zhuǎn)基因在基因組中的整合。使重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因動物互相雜交，以產(chǎn)生表達具有人源化重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)基因雞。采用從轉(zhuǎn)基因雞的B細(xì)胞(在血液、脾和/或淋巴結(jié)中)分離的RNA制備cDNA。用人轉(zhuǎn)基因(如人CH基因片段和/或合成的人源化VH基因片段)的特異性引物從cDNA產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。對擴增產(chǎn)物的觀察表明該轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因動物中重排，重排的轉(zhuǎn)基因在動物中轉(zhuǎn)錄。對擴增產(chǎn)物進行測序，來自于上游V基因的供體序列的存在表明導(dǎo)入動物種系的轉(zhuǎn)基因進行了基因轉(zhuǎn)變。用ELISA分析測定轉(zhuǎn)基因雞的血清中含人IgG和/或人κ輕鏈抗原決定簇的抗體的存在。實施例13在具有無丙種球蛋白血癥表型的轉(zhuǎn)基因雞中產(chǎn)生功能性的人源化抗體產(chǎn)生了具有以下性狀的轉(zhuǎn)基因雞(1)具有至少一種人源化輕鏈轉(zhuǎn)基因，(2)具有至少一種人源化重鏈轉(zhuǎn)基因，和(3)對無丙種球蛋白血癥表型為純合。這些動物在血液和卵中產(chǎn)生抗體，可以從兩種來源的任一種純化抗體?？傮w上，卵中的抗體濃度為血液中抗體濃度的約5％-50％?？梢赃x擇卵中含高水平人源化抗體的動物，使其雜交產(chǎn)生后代。替代地，可以產(chǎn)生特異性將抗體分泌至卵中的轉(zhuǎn)基因動物。實施例14產(chǎn)生表達人源化免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因雞按Pain等(Development122，2339-2348；1996)的描述分離和培養(yǎng)雞胚胎干細(xì)胞。產(chǎn)出后立即從卵獲得雞胚胎。輕柔吸取而取出完整的胚盤，緩慢機械分離胚胎，將細(xì)胞種植于滅活的STO飼養(yǎng)細(xì)胞上的ESA完全培養(yǎng)基。ESA培養(yǎng)基由以下成分組成含10％FCS的MEM培養(yǎng)基，2％雞血清，1％牛血清白蛋白，10ng/ml卵白蛋白，1mM丙酮酸鈉，1％非必需氨基酸，1μM以下核苷酸的每一種腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷，0.16mMβ巰基乙醇。ESA完全培養(yǎng)基補加了10ng/mlbFGF，20ng/mlh-IGF-1，1％vol/vol鳥類-SCF和1％vol/volh-LIF，1％vol/volh-IL-11。在7.5CO2和90％濕度下37℃孵育細(xì)胞培養(yǎng)物。48小時后，將新鮮胚盤細(xì)胞加入最初體積的ESA完全培養(yǎng)基的一半中的培養(yǎng)物。額外孵育3天后，用新鮮ESA完全培養(yǎng)基部分(50％)更換培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，此后每天更換。對于細(xì)胞收獲，用PBS洗滌培養(yǎng)物，在鏈霉蛋白酶溶液中(0.025％w/v)孵育。用各種含有人源化Ig基因座的線性化的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染解離的細(xì)胞。在選擇性抗體存在下用STO飼養(yǎng)細(xì)胞(上述)孵育被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。每周兩次將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新鮮的飼養(yǎng)細(xì)胞上。分離抗生素抗性細(xì)胞，通過PCR證實人源化Ig基因片段整合至隨機位點或相應(yīng)的雞免疫球蛋白基因座。隨后，將基因修飾的細(xì)胞注射至受體胚胎。在受體胚胎中，刺激(6Gy-鈷源)新產(chǎn)出的卵。用微移液管將100-200個基因修飾的細(xì)胞注射至胚下腔。關(guān)閉卵殼上的窗，孵育卵。通過PCR評估孵化出的雞的體細(xì)胞嵌合性。通過體細(xì)胞嵌合體的交配評估種系嵌合性。實施例15轉(zhuǎn)基因動物的免疫在第0，14和28天用純化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(弗氏不完全佐劑中的5μg)對基因工程化的雞進行肌內(nèi)免疫。在第35天，從動物中取血，制備血清。用溶于PBS中的1μg/mlHBsAg包被的ELISA板(NUNC，Denmark)在室溫下孵育1小時。隨后，通過用溶于PBS的1％脫脂干奶粉(NFM)(300μl/孔)孵育而封閉結(jié)合位點。在PBS/1％NFM中稀釋雞血清，加入包被的孔中。孵育1小時后，用PBS/0.05％Tween20洗滌板3次，用偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗人Ig檢測結(jié)合的Ig。用1mg/ml二鹽酸鄰苯二胺(Sigma)檢測偶聯(lián)的山羊抗體。加入1MHCl溶液終止比色反應(yīng)，在490nm下測量吸光度。使用了未免疫雞的血清作為對照。來自于未免疫雞的血清不與HBsAg反應(yīng)。在1∶250的稀釋度下，在未包被和HBsAg包被的板中測得的光密度為低于0.2。相反，來自于免疫雞的血清含有與HBsAg反應(yīng)的人源化抗體。在1∶250的血清稀釋度下，測得的光密度為2.3。進一步稀釋血清時(稀釋度為25600)，測得的光密度減少至0.1。沒有檢測到與山羊抗雞IgG-HRP偶聯(lián)物的抗體反應(yīng)。這證明基因工程化的雞在免疫后產(chǎn)生人源化的抗HBsAg抗體。在第0和14天用純化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(弗氏不完全佐劑中的10μg)對基因工程化的兔進行肌內(nèi)免疫。在第28天，從動物耳取血，制備血清。用溶于PBS中的1μg/mlHBsAg包被的ELISA板(NUNC，Denmark)在室溫下孵育1小時。隨后，通過用溶于PBS的1％脫脂干奶粉(NFM)(300μl/孔)孵育而封閉結(jié)合位點。在PBS/1％NFM中稀釋兔血清，加入包被的孔中。孵育1小時后，用PBS/0.05％Tween20洗滌板3次，用偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗人Ig檢測結(jié)合的Ig。用1mg/ml二鹽酸鄰苯二胺(Sigma)檢測偶聯(lián)的山羊抗體。加入1MHCl溶液終止比色反應(yīng)，在490nm下測量吸光度。使用了未免疫兔的血清作為對照。來自于未免疫兔的血清不與HBsAg反應(yīng)。在1∶100的稀釋度下，在未包被和HBsAg包被的板中測得的光密度為低于0.4。相反，來自于免疫兔的血清含有與HBsAg反應(yīng)的部分人抗體。在1∶100的血清稀釋度下，測得的光密度為2.8。進一步稀釋血清時(稀釋度為25600)，測得的光密度減少至0.2。沒有檢測到與山羊抗兔IgG-HRP偶聯(lián)物的抗體反應(yīng)。這證明基因工程化的兔在免疫后產(chǎn)生人源化的抗HBsAg抗體。實施例16用人源化抗體產(chǎn)生的對病毒感染細(xì)胞系的補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性37℃下用100μlPBS中的0.1mCi51Cr標(biāo)記表達HbsAg的人肝癌細(xì)胞系1小時。用表達抗HbsAg人源化免疫球蛋白的基因工程化兔或雞的血清孵育2000個51Cr標(biāo)記的細(xì)胞。37℃下2小時后，用閃爍計數(shù)器測量放射活性，以便測定51Cr向上清液中的釋放。為測定最大釋放，加入1％TritonX100。按如下公式計算細(xì)胞裂解度％裂解＝實驗CPM±自發(fā)CPM#/總CPM#±自發(fā)CPM。用來自于未免疫兔的血清(1∶30稀釋)的標(biāo)記細(xì)胞孵育沒有導(dǎo)致細(xì)胞裂解(＜10％)。然而，用來自于免疫兔的血清孵育細(xì)胞導(dǎo)致80％的細(xì)胞裂解。通過熱處理(56℃下30分鐘)滅活補體導(dǎo)致免疫兔的血清無活性。這些結(jié)果證明，由遺傳工程化的兔產(chǎn)生的人源化抗體與HbsAg陽性細(xì)胞結(jié)合，并且導(dǎo)致補體依賴性裂解。實施例17抗金黃色葡萄球菌的轉(zhuǎn)基因動物免疫在第0,14和28天用金黃色葡萄球菌膠原粘附素蛋白的重組片段(弗氏不完全佐劑中的100μg)對基因工程化的雞進行肌內(nèi)免疫。在第35天，從動物中取血，制備血清。用溶于PBS中的2μg/ml膠原粘附素蛋白包被的ELISA板(NUNC，Denmark)在室溫下孵育1小時。隨后，通過用溶于PBS的1％脫脂干奶粉(NFM)(300μl/孔)孵育而封閉結(jié)合位點。在PBS/1％NFM中稀釋雞血清，加入包被的孔中。孵育1小時后，用PBS/0.05％Tween20洗滌板3次，用偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗人Ig檢測結(jié)合的Ig。用1mg/ml二鹽酸鄰苯二胺(Sigma)檢測偶聯(lián)的山羊抗體。加入1MHCl溶液終止比色反應(yīng)，在490nm下測量吸光度。使用了未免疫雞的血清作為對照。來自于未免疫雞的血清不與膠原粘附素蛋白反應(yīng)。在1∶250的稀釋度下，在未包被和膠原粘附素蛋白包被的板中測得的光密度為低于0.2。相反，來自于免疫雞的血清含有與膠原粘附素反應(yīng)的人源化抗體。在1∶250的血清稀釋度下，測得的光密度為2.3。進一步稀釋血清時(稀釋度為25600)，測得的光密度減少至0.1。沒有檢測到與山羊抗雞IgG-HRP偶聯(lián)物的抗體反應(yīng)。這證明基因工程化的雞在免疫后產(chǎn)生人源化的抗金黃色葡萄球菌膠原粘附素抗體。在第0和14天用金黃色葡萄球菌膠原粘附素蛋白的重組片段(弗氏不完全佐劑中的100μg)對基因工程化的兔進行肌內(nèi)免疫。在第35天，從動物取血，制備血清。用溶于PBS中的2μg/mlHBsAg包被的ELISA板(NUNC，Denmark)在室溫下孵育1小時。隨后，通過用溶于PBS的1％脫脂干奶粉(NFM)(300μl/孔)孵育而封閉結(jié)合位點。在PBS/1％NFM中稀釋兔血清，加入包被的孔中。孵育1小時后，用PBS/0.05％Tween20洗滌板3次，用偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗人Ig檢測結(jié)合的Ig。用1mg/ml二鹽酸鄰苯二胺(Sigma)檢測偶聯(lián)的山羊抗體。加入1MHCl溶液終止比色反應(yīng)，在490nm下測量吸光度。使用了未免疫兔的血清作為對照。來自于未免疫兔的血清不與膠原粘附素蛋白反應(yīng)。在1∶100的稀釋度下，在未包被和膠原粘附素蛋白包被的板中測得的光密度為低于0.2。相反，來自于免疫兔的血清含有與膠原粘附素反應(yīng)的人源化抗體。在1∶250的血清稀釋度下，測得的光密度為2.3。進一步稀釋血清時(稀釋度為25600)，測得的光密度減少至0.1。沒有檢測到與山羊抗兔IgG-HRP偶聯(lián)物的抗體反應(yīng)。這證明基因工程化的兔在免疫后產(chǎn)生人源化的抗金黃色葡萄球菌膠原粘附素抗體。實施例18在小鼠模型中防止金黃色葡萄球菌感染在第0-1天，用16mg含金黃色葡萄球菌膠原粘附素蛋白的特異性抗體的免疫球蛋白級分(來自于實施例17)或來自于未免疫動物的免疫球蛋白級分對未接受過免疫的動物進行被動免疫。在第0天，每只小鼠用4×107CFU金黃色葡萄球菌進行侵襲，在隨后的7天內(nèi)檢測死亡率。對照組中的死亡率為80％，用含金黃色葡萄球菌膠原粘附素蛋白的特異性抗體的免疫球蛋白級分處理的組中的死亡率為10％，數(shù)據(jù)表明膠原粘附素蛋白可以保護小鼠免受金黃色葡萄球菌侵襲。實施例19從轉(zhuǎn)基因動物制備的抗原特異性雜交瘤用抗原(如KLH，人紅細(xì)胞或綿羊紅細(xì)胞)免疫轉(zhuǎn)基因動物。在免疫后的多個時間取出脾細(xì)胞，分別與來源于兔和雞的骨髓瘤細(xì)胞系融合。融合后將細(xì)胞鋪于96孔板，檢驗上清液中人源化抗體的存在。為證明抗體含人免疫球蛋白序列，用與人重鏈和輕鏈免疫球蛋白反應(yīng)的熒光標(biāo)記的抗體染色。進行有限稀釋，以將雜交瘤純化為多克隆性。實施例20評估免疫原性在第0天從5只cynomologous猴收集血漿樣品。隨后，通過靜脈給藥將純化的部分人多克隆抗體制劑(5mg/kg)給予5只cynomologous猴。以雙周的間隔重復(fù)6次給藥。密切監(jiān)測猴中的副作用(如過敏性休克，這是由體溫升高所反應(yīng)的)。7個月后從血樣中收集血清。用CNBr活化的瓊脂糖通過標(biāo)準(zhǔn)程序產(chǎn)生含純化人IgG或部分人IgG的親和樹脂。將猴血清樣品(3ml)加入含10mg人或部分人IgG的Ig親和樹脂(4ml)。隨后，用PBS洗滌柱。用0.1Mglcyin/HClpH2.5從柱上洗脫結(jié)合的猴免疫球蛋白，然后用PBS透析2次。用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)，采用BCA分析測定被洗脫級分的蛋白含量。這些級分中的蛋白總量證明，用部分人IgG治療，在受治療動物中沒有導(dǎo)致顯著抗體應(yīng)答。實施例21用人源化抗體治療動物通過硫酸銨沉淀和離子交換層析，從基因工程化兔的血清或從基因工程化雞的卵黃中純化人源化多克隆免疫球蛋白。用100萬個表達HbsAg的人肝癌細(xì)胞注射SCID小鼠。約60天后，用從未免疫的兔血清中分離的抗體處理的動物死亡。這與未處理的肝癌細(xì)胞受體相似。相反，用從免疫的兔血清中分離的抗體處理的小鼠存活150天以上。這證明在基因工程化的兔中產(chǎn)生的人抗體能夠從SCID小鼠中消除人癌細(xì)胞。序列表序列表<110>溫姆-范.斯庫坦等<120>在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生人源化抗體<130>14750<140>WO01/24348<141>2001-08-03<160>58<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>1cgcaagcttcctacacgtgtgtggtgatg29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>2cgcaagcttaagatggwgatggtsgtcca29<210>3<211>1714<212>DNA<213>牛<400>3cctacacgtgtgtggtgatgcacgaaactttacggaatcactacaaagagaagtccacct60cgaggtctccgggtaaatgagcctcgcgccgctgatctagtggacgttccctcatccacc120cacccctccccccaccccgggctccaggtccagccagggcgccctagcccctccctgtgt180gcattcctcctgggccgccgtgaataaagcacccaggccgccctgggaccctgcaacgct240gtgctggttctttccgaggcagagccctggtggccgccaggcctgcgggggtgggctgag300ccgactctgggccactttgttcagcatctgtgggggagctgaccccactccgggccagac360acacagtgagtgggtccagcaggccacctgggggctgcccaaggccacagaggggcttgg420ccagaggcacagctccacggtcccctccagccaccacctgctgggccggcctctggacag480gaaccggggaagcccccgagaccctcagggattgaggcccaatgcttcccgcctctgctc540cagcccacgctgtggggcagggccacatccttgtccccaggcccctgtccttgggtgtcc600agagtccttgtgtccactctgggcctgcctggagccacgcatggccagggggtggccctg660cttcaccctcaggctcccaaggtcaggcctcgccc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TyrSerAlaThrValThrPhePheLys3540<210>18<211>44<212>PRT<213>小鼠<400>18GlyLeuGlnLeuAspGluThrCysAlaGluAlaGlnAspGlyGluLeu151015AspGlyLeuTrpThrThrIleThrIlePheIleSerLeuPheLeuLeu202530SerValCysTyrSerAlaAlaValThrLeuPheLys3540<210>19<211>44<212>PRT<213>小鼠<400>19GlyLeuAspLeuAspAspValCysAlaGluAlaGlnAspGlyGluLeu151015AspGlyLeuTrpThrThrIleThrIlePheIleSerLeuPheLeuLeu202530SerValCysTyrSerAlaSerValThrLeuPheLys3540<210>20<211>45<212>PRT<213>小鼠<400>20ProGlyLeuGlnLeuAspGluThrCysAlaGluAlaGlnAspGlyGlu151015LeuAspGlyLeuTrpThrThrIleThrIlePheIleSerLeuPheLeu202530LeuSerValCysTyrSerAlaAlaValThrLeuPheLys354045<210>21<211>44<212>PRT<213>小鼠<400>21GluLeuGluLeuAsnGluThrCysAlaGluAlaGlnAspGlyGluLeu151015AspGlyLeuTrpThrThrIleThrIlePheIleSerLeuPheLeuLeu202530SerValCysTyrSerAlaSerValThrLeuPheLys3540<210>22<211>44<212>PRT<213>小鼠<400>22GluLeuGluLeuAsnGlyThrCysAlaGluAlaGlnAspGlyGluLeu151015AspGlyLeuTrpThrThrIleThrIlePheIleSerLeuPheLeuLeu202530SerValCysTyrSerAlaSerValThrLeuPheLys3540<210>23<211>44<212>PRT<213>綿羊<400>23LeuLeuLeuGluGluGluSerCysAlaAspAlaGlnAspGlyGluLeu151015AspGlyLeuTrpThrThrIleSerIlePheIleThrProPheLeuLeu202530SerValCysTyrSerAlaThrValThrLeuPheLys3540<210>24<211>44<212>PRT<213>綿羊<400>24LeuLeuLeuGluGluGluSerCysAlaAspAlaGlnAspGlyGluLeu151015AspGlyLeuTrpThrThrIleSerIlePheIleThrLeuPheLeuLeu202530SerValCysTyrSerAlaThrValThrLeuPheLys3540<210>25<211>19<212>PRT<213>牛<400>25LeuLeuLeuGluGluGluIleCysAlaAspAspLeuAspGlyGluLeu151015AspGlyLeu<210>26<211>19<212>PRT<213>牛<400>26LeuLeuLeuGluGluGluIleCysAlaAspAlaGlnAspGlyGluLeu151015AspGlyLeu<210>27<211>43<212>PRT<213>兔<400>27LeuGlnLeuAspGluSerCysAlaGluAlaGlnAspGlyGluLeuAsp151015GlyLeuTrpThrThrIleThrIlePheIleSerLeuPheLeuLeuSer202530ValCysTyrSerAlaThrValThrLeuPheLys3540<210>28<211>27<212>PRT<213>駱駝<400>28ValLysTrpIlePheSerSerValValGluLeuLysArgThrIleVal151015ProAspTyrArgAsnMetIleGlyGlnGlySer2025<210>29<211>27<212>PRT<213>人<400>29ValLysTrpIlePheSerSerValValAspLeuLysGlnThrIleIle151015ProAspTyrArgAsnMetIleGlyGlnGlyAla2025<210>30<211>27<212>PRT<213>人<400>30ValLysTrpIlePheSerSerValValAspLeuLysGlnThrIleIle151015ProAspTyrArgAsnMetIleGlyGlnGlyAla2025<210>31<211>27<212>PRT<213>人<400>31ValLysTrpIlePheSerSerValValAspLeuLysGlnThrIleIle151015ProAspTyrArgAsnMetIleGlyGlnGlyAla2025<210>32<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>32ValLysTrpIlePheSerSerValValGluLeuLysGlnThrLeuVal151015ProGluTyrLysAsnMetIleGlyGlnAlaPro2025<210>33<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>33ValLysTrpIlePheSerSerValValGluLeuLysGlnThrIleSer151015ProAspTyrArgAsnMetIleGlyGlnGlyAla2025<210>34<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>34ValLysTrpIlePheSerSerValValGluLeuLysGlnThrLeuVal151015ProGluTyrLysAsnMetIleGlyGlnAlaPro2025<210>35<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>35ValLysTrpIlePheSerSerValValGlnValLysGlnThrAlaIle151015ProAspTyrArgAsnMetIleGlyGlnGlyAla2025<210>36<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>36ValLysTrpIlePheSerSerValValGlnValLysGlnThrAlaIle151015ProAspTyrArgAsnMetIleGlyGlnGlyAla2025<210>37<211>27<212>PRT<213>兔<400>37ValLysTrpIlePheSerSerValValGluLeuLysHisThrIleAla151015ProAspTyrArgAsnMetMetGlyGlnGlyAla2025<210>38<211>8<212>PRT<213>綿羊<400>38ValLysTrpIlePheSerSerVal15<210>39<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>39cgcaagcttcctacacgtgtgtggtgatg29<210>40<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>40gtcgacgcccctcgatgcactcccagag28<210>41<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>41ggtaccctctccctcccccacgccgcagc29<210>42<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>42atatctcagaactggctgtccctgctgtagtacacgg37<210>43<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>43gtcgacactggacgctgaacctcgcgg27<210>44<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>44ggtaccgggggcttgccggccgtcgcac28<210>45<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>45gcggccgctggcgaggagaccaagctggagatcaaacg38<210>46<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>46gtcgacgcagcccaaagctgttgcaatggggcagcg36<210>47<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>47atatggtaccgcgagacgcctgccagggcaccgcc35<210>48<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>48ggatcccgagctttatgggcagggtggggg30<210>49<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>49atatgtcgacctgggataagcatgctgttttctgtctgtccc42<210>50<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>50ctaggtaccagcaggtgggggcacttctccc31<210>51<211>1719<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人免疫球蛋白重鏈Cγ1基因片段，其側(cè)翼為50個來源于兔重鏈的核苷酸<400>51tgacctacctaccctgccaaggtcaggggtcctccaaggcaagggatcacatggcaccac60ctctcttgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagag120cacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggt180gacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcct240acagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttggg300cacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaa360agttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcgctc420ctgcctggacgcatcccggctatgcagccccagtccagggcagcaaggcaggccccgtct480gcctcttcacccggaggcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggc540tttttccccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacaca600aaggggcaggtgctgggctcagacctgccaagagccatatccgggaggaccctgcccctg660acctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccctcagctcggacaccttctctcct720cccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatcttgtgacaaaactc780acacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcggg840acaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtcc900acctccatctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttcccc960ccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg1020gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtg1080cataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc1140gtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc1200aacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtgggacccgt1260ggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgac1320cgctgtaccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcc1380cccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggctt1440ctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaa1500gaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgt1560ggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctct1620gcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagcgctgtgccg1680gcgagctgcccctctccctcccccccacgccgcagctgt1719<210>52<211>390<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明編碼人VH元件多肽序列的VH基因片段，其側(cè)翼序列來源于兔免疫球蛋白DNA<400>52tgagtgacagtgtcctgaccatgtcgtctgtgtttgcaggtgtccagtgtgaggtgcagc60tgttggagtccgggggaggtctcgtccagccaggggggaccctgagactcacctgcgcag120tctctggattcaccttcagtagctatgcaatgagctgggtccgccaggctccagggaagg180ggctggaatgggtcggagccattagtggtagtggtagcacatactacgcggacagcgtga240aaggccgattcaccatctccagagacaactccaagaacacgctgtatctgcaaatgaaca300gtctgagagccgaggacacggccgcctattactgtgcgaaagacacagtgaggggccctc360aggctgagcccagacacaaacctccctgca390<210>53<211>445<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明含有人免疫球蛋白輕鏈Cκ基因片段，其側(cè)翼為50個來源于兔輕鏈免疫球蛋白κ基因的核苷酸<400>53catccacatggcacccaggggagatgtccactggtacctaagcctcgccatcctgtttgc60ttctttcctcaggaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagc120agttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagagg180ccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtca240cagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaag300cagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgc360ccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagagcgagacgcctgccagggcaccgc420cagcgaccctgaggcccagcctcgc445<210>54<211>632<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明編碼人Vκ元件多肽序列的Vκ基因片段，其側(cè)翼序列來源于兔免疫球蛋白DNA<400>54ggcaggctgctcccaccccatgcaggaggcagtaccaggcaggacccagcatggacatga60gggtccctgctcagctcctgggactcctgctgctctggctcccaggtaaggagggaaaca120acaaaaattttattcagccagtgtagccactaatgcctggcacttcaggaaattcttctt180agaacattactaatcatgtggatatgtgtttttatgttcctaatatcagataccagatgt240tacatccagatgacccagtctccatcctctctgtctgcatctgtgggagacagagtcacc300atcacttgccgagccagtcagggcattagcaattacttagcctggtatcagcagaaacca360gggaaggttcccaagctcctgatttatgctgcatccactttgcaatctggggtcccatcg420cggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactcttaccatcagcagcctgcagcct480gaagatgttgccacctattactgtcaaaagtacaacagtgcccctccacttttcggcgga540gggaccaaggtggagatcaaacgtaagtgcactttcctaatgttcctcaccgtttctgcc600tgatttgtttgctttttccattttttcgctat632<210>55<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>55catacacagccatacatacgcgtgtggccgctctgcctctctcttgcaggtatggacagc60aagcgaaccg70<210>56<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>56atcagggtgacccctacgttacactcctgtcaccaaggagtgggagggactcagaagaac60tcgtcaagaag71<210>57<211>419<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明編碼人免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)Cλ2的基因，其側(cè)翼為來源于雞輕鏈基因的核苷酸<400>57catacacagccatacatacgcgtgtggccgctctgcctctctcttgcaggtcagcccaag60gctgccccctccgtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggcc120acactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcttggaaagca180gatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaac240aagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagc300tacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaa360tgttcatagtagtcccactggggatgcaatgtgaggacagtggttcctcaccctccctg419<210>58<211>416<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明編碼人VJ免疫球蛋白多肽的VJ基因片段，其側(cè)翼序列來源于雞免疫球蛋白DNA<400>58ttgccgttttctcccctctctcctctccctctccaggttccctggtgcagtcagtgctga60ctcagccgccctcggtgtcagcagccccgggacaagaagtcacgatctcctgctccgggt120ctagtagcaacattggcgataatttcgtctcttggtaccagcagctgcctggcactgccc180ctaagcttctgatctatgataacaacaagagaccctcgggcatccctgaccgattctccg240gttccaaatccggcacctcagccacattaggcatcactgggctccaaaccggcgacgagg300ctgactattactgtgggacttgggacagcagcctttctgttggtatgtttgggggcggga360cacgcgtgaccgtcctaggtgagtcgctgacctcgtctcggtctttcttcccccat41權(quán)利要求1.一種分離的核酸分子，包含SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO8，SEQIDNO9，SEQIDNO10，SEQIDNO11，SEQIDNO12，或SEQIDNO13的任意一個，或SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO8，SEQIDNO9，SEQIDNO10，SEQIDNO11，SEQIDNO12，或SEQIDNO13的任意一個的一部分所示的序列。2.一種用于以人Ig基因片段替代來自于非人動物的Ig基因片段的重組載體，從5’至3’包含5’核苷酸序列，所述人Ig基因片段，和3’核苷酸序列，其中所述5’核苷酸序列和所述3’核苷酸序列與所述來自于非人動物的Ig基因片段的5’和3’側(cè)翼序列同源。3.權(quán)利要求2的重組載體，其中所述非人動物是主要依賴于基因轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生抗體多樣性的動物。4.權(quán)利要求3的重組載體，其中所述動物是兔、豬、雞、羊或牛。5.權(quán)利要求3的重組載體，其中所述來自于非人動物的Ig基因片段是編碼重鏈或輕鏈恒定區(qū)的基因片段。6.權(quán)利要求5的重組載體，其中所述載體從5’至3’包含如SEQIDNO12，SEQIDNO13，SEQIDNO12的一部分，或SEQIDNO13的一部分中的任意一個所示的5’核苷酸序列；人重鏈恒定區(qū)基因片段；如SEQIDNO10或SEQIDNO10的一部分所示的3’核苷酸序列；并且其中所述載體可用于替代兔重鏈恒定區(qū)基因片段。7.權(quán)利要求5的重組載體，包含SEQIDNO51所示核苷酸序列，其中所述載體可用于替代兔重鏈恒定區(qū)基因片段。8.權(quán)利要求5的重組載體，其中所述載體可用于替代兔輕鏈恒定區(qū)基因并且包含SEQIDNO53所示核苷酸序列。9.權(quán)利要求5的重組載體，其中所述載體可用于替代雞輕鏈恒定區(qū)基因并且包含SEQIDNO57所示核苷酸序列。10.權(quán)利要求3的重組載體，其中所述來自于非人動物的Ig基因片段是編碼重鏈或輕鏈可變區(qū)的基因片段。11.權(quán)利要求10的重組載體，其中所述載體可用于替代兔重鏈可變區(qū)基因并且包含SEQIDNO52所示核苷酸序列。12.權(quán)利要求10的重組載體，其中所述載體可用于替代兔輕鏈可變區(qū)基因并且包含SEQIDNO54所示核苷酸序列。13.一種包含人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述人源化Ig基因座來源于非人動物的Ig基因座或Ig基因座的一部分，并且包含多個Ig基因片段，其中至少一個所述基因片段是人Ig基因片段，其中所述基因片段以未重排、部分重排或完全重排的構(gòu)型并列，并且其中所述人源化Ig基因座能夠進行基因轉(zhuǎn)變并且在所述非人動物中產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的所有組成成分。14.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述非人動物是基本通過基因轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生抗體多樣性的動物。15.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述非人動物是兔、豬、雞、羊或牛。16.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述人源化Ig基因座是重鏈基因座并且包含至少一個V基因片段，至少一個D基因片段，至少一個J基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片段。17.權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述恒定區(qū)基因片段是人重鏈恒定區(qū)基因片段。18.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述人重鏈恒定區(qū)基因片段是Cγ。19.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因載體，包含約10-100個V基因片段和至少一個人V基因片段，其中所述人V基因片段位于所述10-100個V基因片段下游。20.權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述V基因片段選自所述非人動物3’V區(qū)的V基因片段和人V基因片段。21.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述人源化Ig基因座是輕鏈基因座，并且包含至少一個V基因片段，至少一個J基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片段。22.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述恒定區(qū)基因片段是人輕鏈恒定區(qū)基因片段。23.權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述人輕鏈恒定區(qū)基因片段是Cλ或Cκ。24.權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)基因載體，包含約10-100個V基因片段和至少一個人V基因片段，其中所述人V基因片段位于所述10-100個V基因片段下游。25.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述V基因片段選自所述非人動物3’V區(qū)的V基因片段和人V基因片段。26.權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)基因載體，其中所述人V區(qū)基因片段位于重排構(gòu)型中J基因片段的5’緊接處。27.一種制備包含人源化Ig基因座，能夠在非人動物中產(chǎn)生人源化抗體的功能性所有組成成分的轉(zhuǎn)基因載體的方法，包括(i)從所述非人動物獲得含一個Ig基因座或其一部分的DNA片段，該Ig基因座或其一部分包含至少一個V基因片段、至少一個J基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片段；和(ii)將至少一個人Ig基因片段整合至步驟(i)的所述DNA片段以產(chǎn)生人源化Ig基因座，其中所述人Ig基因片段可操作性連接于非人來源的序列以允許所述人源化基因座的基因重排和基因轉(zhuǎn)變以及在所述非人動物中產(chǎn)生人源化抗體的功能性所有組成成分。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述人Ig基因片段的整合是通過同源重組，從而替代來自所述非人動物的所述Ig基因座或其所述部分中的Ig基因片段而完成的。29.權(quán)利要求28的方法，其中同源重組是在細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或非人動物細(xì)胞中完成的。30.權(quán)利要求28的方法，其中人Ig基因片段在重組載體上提供，并且連接于與來自于非人動物的所述Ig基因片段的5’和3’側(cè)翼序列同源的5’核苷酸序列和3’核苷酸序列。31.一種包含人源化Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述人源化Ig基因座來源于非人動物的Ig基因座或Ig基因座的一部分，并且包含多個Ig基因片段，其中至少一個所述基因片段是人Ig基因片段，所述基因片段以未重排、部分重排或完全重排的構(gòu)型并列，并且其中所述人源化Ig基因座能夠進行基因轉(zhuǎn)變并且在所述非人動物中產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的所有組成成分。32.權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物選自兔、豬、雞、羊或牛。33.來自于權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因動物的B細(xì)胞。34.一種制備能夠產(chǎn)生人源化Ig重鏈的功能性所有組成成分的轉(zhuǎn)基因非人動物的方法，包括(i)將權(quán)利要求16-20的任一項的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人動物的受體細(xì)胞，并且將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中的人源化重鏈基因座整合至所述受體細(xì)胞的基因組中；和(ii)從具有整合至基因組中的人源化重鏈基因座的受體細(xì)胞衍生動物，從而產(chǎn)生人源化Ig重鏈的功能性所有組成成分。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述動物是兔，并且所述受體細(xì)胞是早期胚胎中的細(xì)胞。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述兔的內(nèi)源性Ig分子表達受損。37.權(quán)利要求34的方法，其中所述動物是雞，并且所述受體細(xì)胞是受精卵。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述雞的內(nèi)源性Ig分子表達受損。39.一種制備能夠產(chǎn)生人源化Ig輕鏈的功能性所有組成成分的轉(zhuǎn)基因非人動物的方法，包括(i)將權(quán)利要求21-26的任一項的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人動物的受體細(xì)胞，并且將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中的人源化輕鏈基因座整合至所述非人動物的基因組中；和(ii)從具有整合至基因組中的人源化輕鏈基因座的受體細(xì)胞衍生動物，從而產(chǎn)生人源化Ig輕鏈的功能性所有組成成分。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述動物是兔，并且所述受體細(xì)胞是早期胚胎中的細(xì)胞。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述兔的內(nèi)源性Ig分子表達受損。42.權(quán)利要求39的方法，其中所述動物是雞，并且所述受體細(xì)胞是受精卵。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述雞的內(nèi)源性Ig分子表達受損。44.一種制備能夠產(chǎn)生人源化抗體的功能性所有組成成分的轉(zhuǎn)基因非人動物的方法，包括(i)將權(quán)利要求16-20的任一項的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體和權(quán)利要求21-26的任一項的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人動物的受體細(xì)胞，并且將轉(zhuǎn)基因中的人源化Ig基因座整合至所述非人動物的基因組中；和(ii)從具有整合至基因組中的人源化Ig基因座的受體細(xì)胞衍生動物，從而產(chǎn)生人源化抗體的功能性所有組成成分。45.一種制備能夠產(chǎn)生人源化抗體的功能性所有組成成分的轉(zhuǎn)基因非人動物的方法，包括(i)制備能夠產(chǎn)生人源化重鏈的功能性所有組成成分的轉(zhuǎn)基因非人動物；(ii)制備能夠產(chǎn)生人源化輕鏈的功能性所有組成成分的轉(zhuǎn)基因非人動物；(iii)使(i)的轉(zhuǎn)基因非人動物與(ii)的轉(zhuǎn)基因動物交配；和(iv)選擇產(chǎn)生人源化重鏈和人源化輕鏈這兩者的后代，從而獲得能夠產(chǎn)生人源化抗體的功能性所有組成成分的轉(zhuǎn)基因非人動物。46.用權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生的人源化免疫球蛋白。47.來源于轉(zhuǎn)基因動物的人源化免疫球蛋白，包含人免疫球蛋白多肽序列的至少一部分。48.權(quán)利要求47的人源化免疫球蛋白，其中所述轉(zhuǎn)基因動物由基因轉(zhuǎn)變和/或超變產(chǎn)生抗體多樣性。49.權(quán)利要求48的人源化免疫球蛋白，其中所述轉(zhuǎn)基因動物是兔、雞、羊或牛。50.權(quán)利要求49的人源化免疫球蛋白，其中所述人免疫球蛋白多肽序列是重鏈或輕鏈多肽序列。51.權(quán)利要求50的人源化免疫球蛋白，其中人免疫球蛋白多肽序列的所述部分是人恒定區(qū)多肽序列。52.權(quán)利要求51的人源化免疫球蛋白，其中所述人恒定區(qū)多肽序列是Cγ，Cκ或Cλ。53.權(quán)利要求51的人源化免疫球蛋白，其中人免疫球蛋白多肽序列的所述部分進一步包含人V區(qū)多肽序列。54.權(quán)利要求47的人源化免疫球蛋白，其中所述人源化免疫球蛋白特異于一種抗原。55.權(quán)利要求54的人源化免疫球蛋白，其中所述抗原是選自細(xì)菌、真菌或病毒的微生物；所述微生物的抗原性部分；來源于所述微生物的抗原性分子；或腫瘤相關(guān)抗原。56.權(quán)利要求55的人源化免疫球蛋白，其中所述細(xì)菌選自金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、腸球菌、腸桿菌、或肺炎克雷白氏菌。57.權(quán)利要求55的人源化免疫球蛋白，其中所述真菌選自白色假絲酵母，近平滑假絲酵母，熱帶假絲酵母，或新型隱球酵母。58.權(quán)利要求55的人源化免疫球蛋白，其中所述病毒選自呼吸道合胞病毒(RSV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、EBV或HSV。59.權(quán)利要求55的人源化免疫球蛋白，其中所述抗原選自Her-2-neu抗原，CD20，CD22，CD53，前列腺特異性膜抗原(PMSA)或17-1A分子。60.一種抗體制劑，包含權(quán)利要求46-55的任一項的人源化免疫球蛋白。61.權(quán)利要求60的抗體制劑，其中所述制劑是單克隆抗體制劑。62.權(quán)利要求60的抗體制劑，其中所述制劑是多克隆抗體制劑。63.權(quán)利要求62的抗體制劑，其中所述制劑對人基本無免疫原性。64.一種藥物組合物，包含可藥用載體和權(quán)利要求60的抗體制劑。65.一種治療人類主體的疾病的方法，包括給予所述主體治療有效量的權(quán)利要求60的抗體制劑。66.權(quán)利要求59的方法，其中所述疾病由細(xì)菌、真菌或病毒感染所導(dǎo)致，或所述疾病為癌。全文摘要本發(fā)明涉及由轉(zhuǎn)基因非人動物產(chǎn)生的人源化抗體。對非人動物進行基因工程化，以獲得含一種或多種人源化免疫球蛋白基因座，該基因座能夠在轉(zhuǎn)基因非人動物中進行基因重排和基因轉(zhuǎn)變，以產(chǎn)生各種人源化免疫球蛋白。本發(fā)明進一步涉及一種新穎的序列、重組載體和用于產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)基因動物的轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明的人源化抗體對人具有最小的免疫原性，適用于人類主體的治療性處理。文檔編號C07K16/00GK1468250SQ01816723公開日2004年1月14日申請日期2001年8月3日優(yōu)先權(quán)日2000年8月3日發(fā)明者溫姆一范·斯庫坦,羅蘭·比洛,約瑟夫·普拉澤,詹斯－烏爾里克·比洛,普拉澤,比洛,溫姆一范斯庫坦,詼錕恕け嚷申請人:溫姆一范·斯庫坦,羅蘭·比洛,約瑟夫·普拉澤,詹斯－烏爾里克·比洛,溫姆一范斯庫坦