ilent technologies, Santa Clara, CA, US)進(jìn) 掃描，用 Feature Extraction software 10. 7 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)讀取數(shù)據(jù)，軟件設(shè)置 Scan resolution = 5μηι，ΡΜΤ 100 % ,5% 最后米用 Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為 Quantile。
[0083] 結(jié)果如附圖2所示。
[0084] 實施例4 :
[0085] 芯片實驗質(zhì)控情況
[0086] 所有27張芯片的技術(shù)重復(fù)的變異系數(shù)（CV值）均〈10,說明該芯片檢測體系穩(wěn)定； 各芯片檢出率范圍為20%-40%，符合正常檢出率要求；各芯片雜交數(shù)據(jù)的箱線圖分析說 明分布和分散程度較好。以上各質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)說明芯片結(jié)果穩(wěn)定性好，靈敏度高，結(jié)果可靠。
[0087] 實施例5 :
[0088] 1)不同病理分期遠(yuǎn)端正常組織之間的差異表達(dá)microRNA
[0089] 比較IaN，IlaN，IIIaN 3組之間的差異表達(dá)microRNA，發(fā)現(xiàn)IaN和IIaN之間未 發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)microRNA ;IaN+IIaN組和IIIaN組之間有11個差異表達(dá)的microRNA，包括 hsa-miR-205, hsa_miR-34b，hsa_miR-34b*，hsa-miR-34c_3p，hsa_miR-376a，hsa-miR-429， hsa_miR-449a，hsa_miR-449b，hsa-miR-495, hsa_miR-500a，hsa-miR-650。初步研宄說明 Ia和IIa期病人的遠(yuǎn)端正常組織未出現(xiàn)顯著的microRNA變化，但是IIIa期病人的遠(yuǎn)端正 常組織已經(jīng)開始出現(xiàn)microRNA表達(dá)量的改變。
[0090] 結(jié)果如附圖3所示。
[0091] 2)不同病理分期癌旁組織之間的差異表達(dá)microRNA
[0092] 比較IaP，IlaP，IIIaP 3組之間的差異表達(dá)microRNA，發(fā)現(xiàn)IIaP和IIIaP之間有 3個microRNA差異表達(dá)；但是IaP和IIaP之間有9個microRNA差異表達(dá)，與IIIaP之間 有23個microRNA差異表達(dá)；初步研宄說明與Ia期病人相比，IIa期和IIIa病人的癌旁組 織已經(jīng)開始出現(xiàn)microRNA表達(dá)量的改變。
[0093] 結(jié)果如附圖4所示。
[0094] 3)不同病理分期癌組織之間的差異表達(dá)microRNA
[0095] IaC，IlaC，IIIaC 3組之間的差異表達(dá)microRNA并不比遠(yuǎn)端正常組織和癌旁組 織組間差異表達(dá)的microRNA多，其中IIaC和IIIaC之間僅hsv2-miR-H7-3p表達(dá)有差異； hsa_miR-23a*在IIaC和IIIaC中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于IaC。
[0096] 結(jié)果如附圖5所示。
[0097] 4)遠(yuǎn)端正常組織，癌旁組織和癌組織之間的差異表達(dá)microRNA
[0098] 遠(yuǎn)端正常組織和癌旁組織之間幾乎沒有出現(xiàn)microRNA表達(dá)量的改變，僅發(fā)現(xiàn) hsa-miR-338-5p在癌旁組織的表達(dá)量顯著低于遠(yuǎn)端正常組織；但是癌旁組織和癌組織之 間有36個microRNA的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化；遠(yuǎn)端正常組織和癌組織之間的差異表達(dá)的 microRNA有55個，說明癌組織與遠(yuǎn)端正常組織相比microRNA的表達(dá)量發(fā)生了廣泛的變化。 以上述篩選出的55個microRNA為對象，對27個樣本進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示根據(jù)該差異 表達(dá)的microRNA表達(dá)譜可以將27個樣本很好地分為癌組織和非癌組織兩大類。
[0099] 結(jié)果如附圖6，附圖7所示。
[0100] 特別地，篩選到一種與非小細(xì)胞肺癌非常相關(guān)的hsa-miR-1280基因。
[0101] 所述hsa-miR-1280基因的序列為：5' -UCCCACCGCUGCCACCC-3'，其在癌組織和遠(yuǎn) 端正常組織有極為顯著的表達(dá)量差別。
[0102] 5)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間的差異表達(dá)microRNA
[0103] 發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中表達(dá)量發(fā)生顯著變化的micr〇RNA3個，包括 hsa_miR-1260b，hsa-miR-423_3p，hsa-miR23a_5p，如附圖 8 所不。
[0104] 以上述篩選出的3個microRNA為對象，對9個癌組織樣本進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯 示根據(jù)該差異表達(dá)的microRNA表達(dá)譜可以將9個樣本很好地分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移組兩大類。
[0105] 實施例6:
[0106] 擴(kuò)大腫瘤樣本驗證microRNA芯片實驗結(jié)果
[0107] (I)RNA抽提及質(zhì)量控制
[0108] 選擇 78 例 NSCLC 患者組織標(biāo)本對 hsa-miR-145, hsa-miR-182 和 hsa-miR-213 進(jìn) 行microRNA芯片的驗證工作，RNA抽提及質(zhì)量控制方法同上。
[0109] (2)反轉(zhuǎn)錄和 Real-PCR
[0110] 使用 ReverAid First cDNA strand kit (Fermentas)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取 lug total RNA，加入Iul random hexamer primer，補(bǔ)水到12ul，在65°C水浴5min后，立即放于冰 上。加入 4ul 5*reaction buffer, RiboLock Rnase inhibitor Iul，IOmM dNTP Mix 2ul， ReverAid M-MuLV Reverse Transcriptase lul〇 25°C 5min 后，42°C 60min，7CTC 5min 后 結(jié)束反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在ABI 9700 PCR儀上進(jìn)行。產(chǎn)物放于-20°C短期保存或_70°C長期 保存。使用時，將cDNA產(chǎn)物稀釋20倍。microRNA引物由ABI公司合成。系統(tǒng)反應(yīng)體系： 2ul cDNA，10ul SYBR ? Premix Ex TaqTM II(2X)，0.4ul IOuM 上下游引物，0.4ulR0X II，加水至20ul。在ABI 7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，95°C IOsec后40個循環(huán) 的 95°C 5s, 60°C 34sec〇
[0111] (3)實驗結(jié)果
[0112] 分別定量分析3個microRNA在78例NSCLC患者的遠(yuǎn)端正常組織、癌旁組織和癌組 織中的表達(dá)量；研宄發(fā)現(xiàn)hsa-miR-21在66例遠(yuǎn)端正常組織和癌旁組織中的表達(dá)量顯著低 于癌組織中的表達(dá)量，hsa-miR-145在75例遠(yuǎn)端正常組織和癌旁組織中的表達(dá)量顯著高于 癌組織中的表達(dá)量，該研宄結(jié)果與芯片結(jié)果基本相符，因此我們計劃選擇這2個microRNA 進(jìn)行后續(xù)研宄。
[0113] 實施例7:
[0114] hsa-miR-1280在肺癌組織和遠(yuǎn)端正常組織中的表達(dá)差異
[0115] 在72對非小細(xì)胞癌組織和其遠(yuǎn)端正常組織中進(jìn)行q-PCR驗證，結(jié)果顯示miR-1280 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)量顯著高于遠(yuǎn)端正常組織。這證明可通過檢測組織中 hsa-miR-1280的表達(dá)量來檢測非小細(xì)胞肺癌。
[0116] 結(jié)果如表1所示。
[0117] 表 1
[0118]
【主權(quán)項】
1. 一種與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的hsa-miR-1280基因，所述hsa-miR-1280基因的序列為： 5' -UCCCACCGCUGCCACCC-3'。
2. 權(quán)利要求1所述的hsa-miR-1280基因在制備非小細(xì)胞肺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
3. -種非小細(xì)胞肺癌診斷試劑盒，所述試劑盒中包含權(quán)利要求1所述的hsa-miR-1280 基因。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種hsa-miR-1280在非小細(xì)胞肺癌診斷中的作用及其應(yīng)用。本發(fā)明旨在利用hsa-miR-1280在肺癌組織和遠(yuǎn)端正常組織中的顯著性表達(dá)差異對非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行早期的診斷。對miRNA1280在癌組織和遠(yuǎn)端正常組織敏感性和特異性方面進(jìn)行比較，AUC=0.772，最佳臨界點時的敏感度為46.4%，特異性為95.7%，因此具有很強(qiáng)的可行性。
【IPC分類】C12N15-113, C12Q1-68
【公開號】CN104726454
【申請?zhí)枴緾N201510055487
【發(fā)明人】戴利成, 許麗敏, 李麗琴
【申請人】湖州市中心醫(yī)院
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年2月3日