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基于her-2/neu抗原的dc細(xì)胞、靶向性免疫細(xì)胞群及其制備方法和用圖

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基于her-2/neu抗原的dc細(xì)胞、靶向性免疫細(xì)胞群及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體地,本發(fā)明涉及DC細(xì)胞、靶向性免疫細(xì)胞群及其 制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是人類(lèi)主要的致死性疾病類(lèi)型,死亡率居高不下。衛(wèi)生部最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù) 表明惡性腫瘤居我國(guó)居民前十位死因首位。2010年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病患者268萬(wàn)人,死亡 197萬(wàn)人;目前全國(guó)共有惡性腫瘤患者600余萬(wàn)人。每年用于惡性腫瘤病人的醫(yī)療費(fèi)用約 占衛(wèi)生總費(fèi)用的20%,是全社會(huì)最大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前的治療手段對(duì)于達(dá)到治愈、延長(zhǎng)惡性 腫瘤患者生存期以及改善生活質(zhì)量等目標(biāo)的作用仍然十分有限,尤其對(duì)于某些類(lèi)型的惡性 腫瘤即使是早期診斷也難以獲得滿意的療效,至于轉(zhuǎn)移性、全身性或進(jìn)展期的惡性腫瘤則 更難以治愈。
[0003] 目前的腫瘤治療策略中,手術(shù)和放療等局部治療對(duì)局限性腫瘤有較好的療效,而 對(duì)于全身性、轉(zhuǎn)移性或局部治療后的微小殘留病灶則主要依靠化療或免疫療法進(jìn)行系統(tǒng)性 治療。腫瘤發(fā)病是多步驟、多基因作用的結(jié)果,腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出生長(zhǎng)、分化與凋亡的失控。臨 床上病人癥狀的多樣性和個(gè)體遺傳異質(zhì)性,以及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶的出現(xiàn),使腫瘤治療必 須以全身性疾病的觀點(diǎn),采用個(gè)體化的綜合治療方案。即根據(jù)每個(gè)腫瘤病人的特點(diǎn),采用局 部治療結(jié)合全身治療;不僅要消除局部病灶的腫瘤,還要控制腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)及腫瘤 對(duì)重要臟器的侵襲,才能真正有效地提高腫瘤病人的治愈率和生存期。通常腫瘤局部病灶 的治療可采取手術(shù)和物理治療(包括射頻消融、熱療、放療、冷凍、超聲波及激光治療等)方 法消除,然而對(duì)于影像學(xué)不能發(fā)現(xiàn)的腫瘤微小病灶(如轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)灶、局部治療后的殘留病 灶、血液中的癌細(xì)胞),以上局部治療手段則無(wú)能為力,必須通過(guò)全身性治療手段加以解決。 由于腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、擴(kuò)散更為致命,因此全身性治療顯得尤為重要和緊迫。目前全身性 治療有傳統(tǒng)化學(xué)治療、分子祀向藥物治療、生物治療(包括干細(xì)胞移植治療和免疫細(xì)胞治 療)以及基因治療等。傳統(tǒng)化療雖然在某些腫瘤治療方面取得了一些進(jìn)展,但對(duì)延長(zhǎng)腫瘤 病人生存期方面仍然貢獻(xiàn)不大。而且腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的天然耐藥和獲得性多藥耐藥以及 化療毒性,使化學(xué)治療的發(fā)展受到了嚴(yán)重的妨礙。多年來(lái)的臨床實(shí)踐證明它并非是全身治 療的優(yōu)勢(shì)項(xiàng)目。
[0004] 免疫細(xì)胞治療是近二十年發(fā)展起來(lái)的,免疫細(xì)胞治療主要包括CIK和DC細(xì)胞。由 于它治療范圍廣(可用于實(shí)體腫瘤及白血?。?,特別對(duì)腫瘤微小病灶(包括轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)灶、 血液中的癌細(xì)胞)更為有效,無(wú)毒副作用,而且適用于腫瘤各階段(如晚期放、化療不能使 用);因此它是全身治療的一個(gè)優(yōu)勢(shì)項(xiàng)目。免疫細(xì)胞治療對(duì)提高生命質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期有顯 著的效果,倍受?chē)?guó)內(nèi)外推崇,是目前全身治療的最佳手段之一,臨床潛力巨大。
[0005] 然而,目前用于進(jìn)行免疫細(xì)胞治療的免疫細(xì)胞的制備方法仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此,本發(fā)明的一個(gè)目的 在于提出一種安全、高效的制備DC細(xì)胞和靶向性免疫細(xì)胞群的方法。
[0007] 需要說(shuō)明的是,本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:
[0008] 隨著生物治療技術(shù)的發(fā)展,對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行免疫治療已成為研宄熱點(diǎn),免疫治療 是腫瘤治療的一種嶄新模式,尤其是細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)繼免疫治療已較為成熟已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng) 用階段,并取得了明顯的治療效果。細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)繼免疫治療已成為腫瘤患者放、化療后輔 助治療的重要手段之一,其對(duì)于促進(jìn)患者免疫系統(tǒng)的重建、消除殘留病灶及骨髓凈化都具 有良好效果。人們通過(guò)研宄淋巴因子一激活的殺傷(LAK)細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴(TIL)細(xì)胞、 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞等,表明CIK細(xì)胞是一種新型、高效、具有廣譜殺瘤活性的 非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性免疫效應(yīng)細(xì)胞,在腫瘤免疫治療中顯露出巨大的應(yīng) 用價(jià)值。樹(shù)突狀細(xì)胞OC)是人體內(nèi)功能強(qiáng)大的主要的抗原遞呈細(xì)胞,能誘導(dǎo)出抗原特異性 細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)并可通過(guò)直接或間接方式影響0細(xì)胞(胰腺的胰島中能產(chǎn)生 胰島素的細(xì)胞)的增殖,活化體液免疫應(yīng)答。將CIK細(xì)胞和DC聯(lián)合治療惡性腫瘤,有助于 解除腫瘤患者的T細(xì)胞免疫無(wú)能,有協(xié)同抗腫瘤的作用。越來(lái)越多的試驗(yàn)和臨床實(shí)踐表明 的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞聯(lián)合樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)惡性腫瘤的治療(CIK/DC細(xì)胞治療)顯示出 良好的治療效果,有著巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。
[0009] 其中,CTL細(xì)胞是⑶8+的T細(xì)胞亞群,為一種特異T細(xì)胞,對(duì)某些病毒、腫瘤細(xì)胞 等具有直接殺傷作用,與自然殺傷細(xì)胞構(gòu)成機(jī)體抗病毒、抗腫瘤的重要防線。CTL殺傷機(jī)制 有:①釋放穿孔素,顆粒酶,裂解靶細(xì)胞。②通過(guò)FasL介導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。
[0010] 基于DC的抗原負(fù)載技術(shù)主要類(lèi)型有:腫瘤抗原肽沖擊DC;腫瘤細(xì)胞性抗原沖擊 DC;腫瘤細(xì)胞RNA沖擊DC;基因修飾DC的免疫治療。發(fā)明人發(fā)現(xiàn),腫瘤抗原多肽負(fù)載DC是 應(yīng)用腫瘤抗原多肽在體外沖擊致敏DC,然后回輸或免疫接種至荷瘤宿主,能明顯誘導(dǎo)機(jī)體 產(chǎn)生抗原特異性CTL,產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng),目前所有的dc負(fù)載抗原作為疫苗來(lái)開(kāi)發(fā)的,在 機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生抗體及CTL,沒(méi)有在體外制備CTL細(xì)胞。由于抗原在體內(nèi)激起的免疫反應(yīng)有可能 產(chǎn)生系統(tǒng)性字體免疫的可能,發(fā)明人利用該技術(shù)在體外制備CTL細(xì)胞及綜合免疫細(xì)胞群, 可以解決目前的問(wèn)題。另外,目前有用各種載體作為抗原,rAAv等病毒類(lèi)載體負(fù)載抗原制 備CTL技術(shù)的,ACTL技術(shù)就是其中之一,但是由于病毒的整合特性,導(dǎo)致DC細(xì)胞的基因組 毒性問(wèn)題一直解決不了,所以發(fā)明人利用mRNA抗原技術(shù)替代病毒類(lèi)或DNA類(lèi)的載體,從安 全性上超過(guò)了病毒類(lèi)載體,同時(shí)從產(chǎn)業(yè)化角度上來(lái)看,mRNA體外轉(zhuǎn)錄更能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,操作 簡(jiǎn)單,質(zhì)控及質(zhì)檢可以標(biāo)準(zhǔn)化。
[0011] 換言之,本發(fā)明利用mRNA-DC-CTL技術(shù)制備靶向性免疫細(xì)胞群,具體地:將腫 瘤相關(guān)抗原決定簇的mRNA轉(zhuǎn)染患者的外周血單核細(xì)胞(Monocytes),經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo), 單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)大抗原提呈功能的DC細(xì)胞。將經(jīng)此技術(shù)獲得的DC細(xì)胞,在體 外刺激患者的T淋巴細(xì)胞,產(chǎn)生有效殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CytotoxicT lymphocytes,CTL)。所產(chǎn)生的CTL具有腫瘤抗原特異性,即祀向性,僅針對(duì)某種或數(shù)種特定 腫瘤相關(guān)抗原陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用,對(duì)抗原陰性的細(xì)胞無(wú)任何作用。
[0012] 進(jìn)而,根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種制備DC細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā) 明的實(shí)施例,該方法包括以下步驟:將單核細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng),以便獲得未成熟的 DC細(xì)胞;利用HER-2/NEU抗原mRNA轉(zhuǎn)染所述未成熟的DC細(xì)胞,以便獲得經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的未成 熟DC細(xì)胞;以及將所述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng),以便獲得成熟的 DC細(xì)胞,其中,所述單核細(xì)胞是從樣本的外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離獲得的。
[0013] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn),利用本發(fā)明的方法能夠安全高效地制備DC細(xì)胞(即樹(shù)突狀細(xì) 胞),且本發(fā)明的方法成本低、效率高、且能夠有效地解決細(xì)胞毒性問(wèn)題,獲得的DC細(xì)胞回 輸患者后安全無(wú)毒,能夠有效用于免疫細(xì)胞治療,且該DC細(xì)胞還能夠有效用于刺激同樣患 者來(lái)源的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生富含大量CTL細(xì)胞的靶向性免疫細(xì)胞群,進(jìn)而用于腫瘤免疫治療后 效果更好。
[0014] 另外,根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的制備DC細(xì)胞的方法還可以具有如下附加的技術(shù) 特征:
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述HER-2/NEU抗原mRNA是通過(guò)以下步驟獲得的:制備 HER-2/NEU抗原cDNA質(zhì)粒,所述HER-2/NEU抗原cDNA的核酸序列如SEQIDNO: 1所示;將 所述HER-2/NEU抗原cDNA質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理,以便獲得經(jīng)過(guò)線性化處理的HER-2/NEU抗 原cDNA質(zhì)粒;以及將所述經(jīng)過(guò)線性化處理的HER-2/NEU抗原cDNA質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,以便 獲得HER-2/NEU抗原mRNA。由此,能夠有效制備獲得HER-2/NEU抗原mRNA。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,以pcDNA3. 1載體為骨架載體,制備所述HER-2/NEU抗原 cDNA質(zhì)粒。由此,制備效率高,效果好。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述pcDNA3. 1載體具有BamhI、Xbal和Bstll07I酶切位 點(diǎn)。由此,能夠有效進(jìn)行質(zhì)??寺『秃罄m(xù)的線性化處理。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,基于酶切位點(diǎn)Bstll07I進(jìn)行所述線性化處理。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,利用ITMessageMachine試劑盒進(jìn)行所述體外轉(zhuǎn)錄。由此, 轉(zhuǎn)錄效率高、效果好。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,在進(jìn)行所述體外轉(zhuǎn)錄后,進(jìn)一步包括除雜純化的步驟。由 此,有利于后續(xù)HER-2/NEU抗原mRNA轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,利用電轉(zhuǎn)或PEI法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染。由此,轉(zhuǎn)染效率高、效果 好。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,利用PEI法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染,其中,PEI與所述HER-2/NEU抗 原mRNA的混合質(zhì)量比為3:1。由此,轉(zhuǎn)染效果突出。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,利用DC培養(yǎng)基進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)和所述第二誘 導(dǎo)分化培養(yǎng)。由此,能夠有效誘導(dǎo)獲得DC細(xì)胞。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述DC培養(yǎng)基包含:無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基;100~1000U/ml 的CTL4因子;以及2體積%~10體積%的自體血清,其中,所述血清來(lái)源于所述樣本。由 此,培養(yǎng)效果好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,所述無(wú)血清培養(yǎng)基為T(mén)akara的無(wú)血清培養(yǎng)基。根 據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例,所述無(wú)血清培養(yǎng)基中添加有0. 5體積%~5體積%的抗生素,優(yōu) 選慶大霉素。由此,培養(yǎng)效果突出。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天,每2-3天半換液一次。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,進(jìn)行所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-5天,每2-3天半換液一次。由此,培 養(yǎng)效果好。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面,本發(fā)明還提供了一種制備靶向性免疫細(xì)胞群的方法。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,該方法包括以下步驟:提供樣本的外周血單個(gè)核細(xì)胞;將所述樣本的 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞;將所述淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化培養(yǎng),以便獲得 經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞;將單核細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng),以便獲得未成熟的DC細(xì) 胞;利用HER-2/NEU抗原mRNA轉(zhuǎn)染所述未成熟的DC細(xì)胞,以便獲得經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的未成熟DC 細(xì)胞;將所述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的未成熟DC細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng),以便獲得成熟的DC細(xì)胞; 以及將所述成熟的DC細(xì)胞與所述經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng),以便獲得靶向 性免疫細(xì)胞群。<
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