鵝絨成分的實時熒光pcr檢測用的引物和探針的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種利用核酸擴增技術進行動物源性成分快速檢測的方法，具體是一 種鶴絨成分的實時巧光PCR檢測用的引物和探針序列。
【背景技術】
[0002] 羽絨是長在鶴、鴨的腹部，成蘆花朵狀的絨毛，成片狀的叫羽毛。由于羽絨是一種 動物性蛋白質(zhì)纖維，比棉花、羊毛、蠶絲保溫性高，且羽絨球狀纖維上密布千萬個=角形的 細小氣孔，能隨氣溫變化而收縮膨.脹，產(chǎn)生調(diào)溫功能，可吸收人體散發(fā)流動的熱氣，隔絕 外界冷空氣的入侵。因此，羽絨是優(yōu)良的填充料，歷來受到國內(nèi)外人們的歡迎。我國作為世 界上最大的羽絨羽毛制品生產(chǎn)、出口和消費大國，羽絨及制品總量占據(jù)了國際市場70% W 上的份額。在羽絨產(chǎn)業(yè)中，占極大部分的是鶴絨和鴨絨產(chǎn)業(yè)。鶴絨與鴨絨相比較而言，鶴 絨絨朵大，中空度高，蓬松性好，回彈性優(yōu)，保暖性強。一般來講鶴絨在各項指標上都優(yōu)于鴨 絨，因而在市場上鶴絨比鴨絨更受歡迎，鶴絨毛的價格比鴨絨毛高1. 6倍左右。由于鶴絨與 鴨絨外觀形態(tài)十分相似，所W很難區(qū)分，使一些商家有機可乘，W鴨絨代替鶴絨或在鶴絨中 混入鴨絨來牟取暴利。鶴絨鴨絨兩者都屬于蛋白質(zhì)纖維，對兩種羽絨纖維的化學成分進行 分析，發(fā)現(xiàn)兩者的氨基酸種類與含量基本相同，所W用化學的方法很難分辨鴨絨和鶴絨。國 內(nèi)對于羽絨種類分析主要是采用現(xiàn)行的標準GB/T 10288-2003《羽絨羽毛檢驗方法》及紡織 行業(yè)標準FZ/T 800(U-2002《水洗羽毛羽絨試驗方法》，國外羽絨種類分析常用標準有JIS L 1903和EN 12131。該些標準對于羽絨結構特征只進行了定性說明，難W有效指導鴨絨和 鶴絨的種類鑒別。方法對檢驗人員要求高、主觀性大，容易產(chǎn)生誤判。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是針對鶴絨線粒體CYTB基因序列，設計一組特異性引物和探針，進 而建立一種快速檢測鶴絨DNA方法，W克服傳統(tǒng)的顯微鏡法難W準確判定的局限性，為鶴 絨成分檢測提供有效工具，W期與傳統(tǒng)鑒別方法相結合，提高羽絨鑒別的客觀性和準確度。 [0004] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案如下：
[000引鶴絨成分的實時巧光PCR檢測用的引物和探針：
[0006] 上游引物；5 ' -GCTACTAGCCATACACTAC-3，
[0007] 下游引物；5 ' -GTTGGATTGTCTACTGAGA-3 '
[000引 探針；5 ' -CGCAGACACTTCACTCGCCT-3，。
[0009] 所述探針為化qMan探針，其5'端標記有報告巧光集團，3'端有澤滅巧光集團。
[0010] 所述引物和探針應用于鶴絨成分的PCR檢測，其體積比為：上游引物；下游引物： 探針=1 ;1 ;1 ;其檢測過程如下：
[0011] (1)待檢樣品DNA的提取
[0012] 采用普通酪-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒提取羊駝毛的DNA ;
[001引 （2)鶴絨成分的實時巧光PCR擴增
[0014] A.在反應管中加入 Premix Ex Taq (2 X) 12. 5 y L Primer F (10 y M) 1 y L Primer R (10 y M) 1 y L，Probe (5 y M) 1 y L，DNA*2 y L，地207. 5 y L，Total 25 y L。
[0015] B.將PCR反應管放入巧光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增；95°C 30sec， 1個循環(huán)，95°[53日。，60°[303日(3,40個循環(huán)，？〔1?擴增。爬肖31:;[￥日00]1化〇1反應時，加入 RNase free地20;Positive反應時，做2個平行樣。
[0016] 做應用巧光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果
[0017] 反應結束后，應設置無效基線范圍?；€范圍選擇在3~15個循環(huán)，如果有強陽 性樣本，應根據(jù)實際情況調(diào)整基線范圍。闊值設置原則W基線剛好超過正常陰性對照擴增 曲線的最高點，且Ct值=40為準，設置闊值后，分析樣品的檢測結果。
[0018] 待測樣品鶴絨成分檢測ct值大于或等于40,陰性對照、陽性對照和空白對照結果 正常者，則可判定該樣品未檢出鶴絨成分。
[0019] 待測樣品鶴絨成分檢測ct值小于或等于36,陰性對照、陽性對照和空白對照結果 正常者，則可判定該樣品檢出鶴絨成分。
[0020] 待測樣品鶴絨成分檢測ct值在36~40之間，應重做實時巧光PCR擴增。再次擴 增后的結果Ct值仍小于40者，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常，則可判定該樣 品檢出鶴絨成分；再次擴增后結果Ct值大于40,且陰性對照、陽性對照和空白對照結果正 常，可判定該樣品未檢出鶴絨成分。
[0021] 本發(fā)明采用實時巧光PCR技術，該技術特異性強、靈敏度高、操作簡便，特別適用 于一些成分復雜的纖維制品中鶴絨成分的檢測。
【附圖說明】
[002引 圖1PCR特異性檢測結果；
[002引圖2鶴絨DNA巧光PCR結果；
[0024] 圖3巧光PCR靈敏度檢測結果；
[002引 圖4重復性PCR結果；
[0026] 圖5重復性巧光PCR結果；
[0027] 圖6重復性巧光PCR結果；
[002引 圖7重復性巧光PCR結果。
【具體實施方式】
[0029] 鶴絨成分的實時巧光PCR檢測用的引物和探針：
[0030] 上游引物；5，-GCTACTAGCCATACACTAC-3，
[0031] 下游引物；5' -GTTGGATTGTCTACTGAGA-3，
[0032] 探針；5 ' -CGCAGACACTTCACTCGCCT-3，。
[0033] 所述探針為化qMan探針，其5'端標記有報告巧光集團，3'端有澤滅巧光集團。
[0034] 所述引物和探針應用于鶴絨成分的PCR檢測，其體積比為：上游引物；下游引物： 探針=1 ;1 ;1。
[00對 實施例1
[0036] 1、從羽絨服或其他羽絨制品的不用部位取樣，共取約Ig試樣。用剪刀將樣品剪 碎，經(jīng)分析研磨機打散混勻，再用剪刀盡量剪碎至2mm W下，再次用分析研磨機混勻。
[0037] 2、從混勻的樣品中稱取約5mg試樣，放入2mL離屯、管中，每個樣平行提取2管，加 入180 y L的緩沖液化炬uffer化）、20 y L的蛋白酶K(Proteinase K)和10 y L的核糖核酸 酶A(RNase A，lOmg/mL)，于56°C水浴溫浴至組織完全裂解3小時。如殘存纖維狀組織無法 完全裂解，裂解之后先12, OOOrpm離屯、2分鐘，去除雜質(zhì)之后再進行后續(xù)操作。向裂解液中 加入200 y L緩沖液GB炬uffer GB)和200 y L 100 %己醇，充分吸打混勻。溫浴時可時常將 樣品取出進行振蕩或吸打W加速裂解。將離屯、管（Spin Column)安置于收集管（Collection Tube)上，溶液移至Spin Column中，12, 00化pm離屯、2分鐘，棄濾液。將500 y L的緩沖液 WA炬uffer WA)加入至Spin Column中，12, 000巧m離屯、1分鐘，棄濾液。將700 y L的緩沖 液WB炬uffer WB)加入至Spin Column中，12, 000巧m離屯、1分鐘，棄濾液。確認Buffer WB中已經(jīng)加入了指定體積的100%己醇。沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，該樣 有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份。然后重復上述加緩沖液WB操作步驟一次。將Spin Column安置于Collection I\ibe上，12, 000巧m離屯、2分鐘。將Spin Column安置于新 的1. 5mL的離屯、管上，在Spin Column膜的中央處加入50 y L的滅菌水或洗脫液巧lution Buffer)，室溫靜置5分鐘。將滅菌蒸饋水或Elution Buffer加熱至65°C使用時有利于提 高洗脫效率。12, 0(K)巧m離屯、2分鐘洗脫DNA。如需獲得更大收量，可將離下液重新加入 到Spin Column膜的中央或再加入50 yL的滅菌水或Elution Buffer,室溫靜置5分鐘 后，12, 000巧m 離屯、2 分鐘洗脫 DNA。W上操作中的 Buffer GL、Buffer WA、Buffer WB W 及Spin columruCollection I\ibe均來自寶生物工程（大連）有限公司TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver. 5. 0 試劑盒。
[0038] 3、PCR反應體系
[0039]
【主權項】
1. 鵝絨成分的實時熒光PCR檢測用的引物和探針，其特征在于： 上游引物：5' -GCTACTAGCCATACACTAC-3' 下游引物：5 ' -GTTGGATTGTCTACTGAGA-3 ' 探針：5' -CGCAGACACTTCACTCGCCT-3'。
2. 根據(jù)權利要求1所述的鵝絨成分的實時熒光PCR檢測用的引物和探針，其特征在于： 所述探針為TaqMan探針，其5'端標記有報告熒光集團，3'端有淬滅熒光集團。
3. 如權利要求1所述的鵝絨成分的實時熒光PCR檢測用的引物和探針，其特征在于： 其應用于鵝絨成分的PCR檢測，其體積比為：上游引物：下游引物：探針=1 :1 :1。
【專利摘要】本發(fā)明屬于羽絨制品中動物源性成分的定性檢測技術，具體地說是檢測羽絨制品中鵝絨成分的引物/探針組。本發(fā)明選取鵝絨的線粒細胞色素B(CYTB)基因序列，設計一組特異性引物和探針。使用該引物和探針，采用實時熒光PCR技術，可快速、靈敏、特異地檢測羽絨制品中的鵝絨成分。該引物和探針也可以試劑盒的形式和其他試劑一起提供，用于核酸擴增反應。該法操作簡便、重復性好。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104630345
【申請?zhí)枴緾N201410835824
【發(fā)明人】王玫, 任亮, 孔平, 楊春光, 顏懷玉, 肇慧君, 李晶泉, 張 浩
【申請人】中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局, 寶生物工程（大連）有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2014年12月29日