基于高分辨透射電子顯微學(xué)的單分子dna測(cè)序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基于高分辨透射電子顯微學(xué)的單分子DNA測(cè)序方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2002年，通過(guò)六個(gè)國(guó)家超過(guò)十年的合作研宄，人類(lèi)獲得了第一組人類(lèi)遺傳物質(zhì)一一DNA序列圖譜，這宣布了人類(lèi)正式邁向后基因組時(shí)代。人類(lèi)自身DNA序列圖譜的測(cè)定，對(duì)于健康預(yù)測(cè)、疾病診斷、個(gè)體化醫(yī)療等領(lǐng)域具有其余技術(shù)不可替代的作用，即將對(duì)人類(lèi)的生存和繁衍產(chǎn)生愈來(lái)愈廣泛和深遠(yuǎn)的影響。
[0003]到2014年為止，DNA序列檢測(cè)技術(shù)(簡(jiǎn)稱(chēng)測(cè)序)的發(fā)展歷程大致可以分為三代。第一代測(cè)序技術(shù)基于Sanger化學(xué)終止法和大規(guī)?？寺〖夹g(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確率高，但其效率極其低下、成本巨大；第二代測(cè)序技術(shù)基于鳥(niǎo)槍片段化法、短序列拼接的生物信息學(xué)技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是效率顯著提高，成本也下降了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，但因其仍然需要大規(guī)模的DNA復(fù)制，成本非普通人可以負(fù)擔(dān)，而且短序列的拼接準(zhǔn)確率不夠高，因此第二代測(cè)序技術(shù)仍然無(wú)法滿(mǎn)足讓每個(gè)人類(lèi)個(gè)體都擁有自己DNA序列數(shù)據(jù)的需求。第三代測(cè)序技術(shù)，又稱(chēng)單分子測(cè)序技術(shù)，以納米孔測(cè)序技術(shù)為代表。其特點(diǎn)是，徹底放棄DNA復(fù)制的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)單拷貝DNA序列直接讀取，因此理論上在速度和成本方面都可以滿(mǎn)足個(gè)體DNA測(cè)序的需求。然而，第三代測(cè)序技術(shù)難度極高，發(fā)展至今遇到了理論和實(shí)驗(yàn)上的諸多瓶頸。例如，DNA過(guò)孔速度為隨機(jī)過(guò)程，無(wú)法控制納米孔的俘獲率和過(guò)孔速度，造成了無(wú)法識(shí)別單堿基攜帶的信息；此外，納米孔的制備過(guò)程成本仍然極高、費(fèi)時(shí)、至今尚不具備規(guī)?；a(chǎn)條件。目前為止，還沒(méi)有僅僅使用第三代技術(shù)完成過(guò)人類(lèi)基因組的測(cè)序的相關(guān)報(bào)道。
[0004]由此可見(jiàn)，基因測(cè)序發(fā)展的關(guān)鍵，在于節(jié)省成本、提高效率。而實(shí)現(xiàn)這一目的的技術(shù)途徑，是必須放棄大規(guī)模擴(kuò)增的方法。換言之，只有單分子(單拷貝)的測(cè)序技術(shù)，才是真正能夠?qū)崿F(xiàn)低成本、普及化的人類(lèi)個(gè)性化測(cè)序技術(shù)。但雖然歷經(jīng)二十余年發(fā)展，基因測(cè)序技術(shù)目前仍無(wú)法走進(jìn)普通人的生活，原因也就在于單分子測(cè)序技術(shù)還沒(méi)有突破其技術(shù)瓶頸，走向?qū)嵱?。因此，我們亟需在前人的基礎(chǔ)上發(fā)展一種相對(duì)簡(jiǎn)易可行，成本適中的單分子測(cè)序方法。
[0005]透射電子顯微技術(shù)(TEM)是以高壓加速電子作為成像源，對(duì)納米尺度的樣品進(jìn)行高分辨成像和成分分析的技術(shù)。TEM發(fā)展至今，其信息分辨率普遍已經(jīng)優(yōu)于0.24納米，小于DNA相鄰堿基之間的距離(0.34nm)。裝備有球差(Cs)校正裝置的TEM，分辨率更可以達(dá)到0.05-0.08nm，足以對(duì)單原子進(jìn)行成像。隨著Cs-TEM技術(shù)的不斷完善和成本的持續(xù)降低，我們有理由相信，基于單原子標(biāo)記的超高分辨TEM的單分子DNA直讀測(cè)序技術(shù)將成為一種簡(jiǎn)單可行、成本適中的單分子測(cè)序技術(shù)。
[0006]單個(gè)原子標(biāo)記是一種濕法化學(xué)標(biāo)記法。標(biāo)記物三個(gè)維度的尺寸都在I納米以下，僅有單個(gè)或數(shù)個(gè)原子構(gòu)成，外觀恰似一極小的點(diǎn)狀物，其內(nèi)部電子在各方向上的運(yùn)動(dòng)都受到局限，所以量子局限效應(yīng)(quantum confinement effect)特別顯著。由于單原子尺寸小，單分散性好，尤其適合進(jìn)行DNA等生物樣品標(biāo)記，由于重金屬化學(xué)元素的原子序數(shù)和晶體結(jié)構(gòu)都具有明顯差異，在超高分辨透射電鏡之中易于以衍射襯度、Z-襯度的成像模式予以分辨，因此單原子標(biāo)記方法特別適合用于DNA序列在高分辨TEM中的標(biāo)記成像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明目的是提供了一種基于高分辨透射電子顯微學(xué)的單分子DNA測(cè)序方法，使用不同的重元素單原子對(duì)單鏈DNA進(jìn)行單原子標(biāo)記；再發(fā)展透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)，對(duì)標(biāo)記物-DNA復(fù)合物進(jìn)行高分辨成像，實(shí)現(xiàn)DNA序列在TEM中的直接可讀化。
[0008]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種基于高分辨透射電子顯微學(xué)的單分子DNA測(cè)序方法，所述測(cè)序方法是通過(guò)使用重元素標(biāo)記物的單個(gè)原子或少量原子對(duì)核酸單拷貝序列進(jìn)行標(biāo)記，并采用高分辨透射電子顯微鏡進(jìn)行成像和結(jié)果分析。
[0009]其中，上述核酸單拷貝是指直接從生物細(xì)胞或組織中分離純化所得的核酸產(chǎn)物；核酸單拷貝制備方法請(qǐng)見(jiàn)F.M.奧斯伯等主編《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第四版)》科學(xué)出版社2005年第一版。
[0010]其中，上述重元素標(biāo)記物為金、銀、鉑、鎢、汞、鉛、鈾或具有高原子序數(shù)的常見(jiàn)金屬及其無(wú)機(jī)或有機(jī)化合物、復(fù)合物、螯合物。
[0011]其中，上述重元素標(biāo)記物的三維特征尺寸小于I納米，即僅由單原子或數(shù)個(gè)原子組成，并能夠與不同類(lèi)型的堿基進(jìn)行特異性結(jié)合。
[0012]其中，上述測(cè)序方法通過(guò)使用高分辨透射電子顯微鏡的明場(chǎng)、暗場(chǎng)、掃描透射法、高角環(huán)形暗場(chǎng)、電子特征X射線(xiàn)能譜、電子能量損失譜、能量過(guò)濾成像技術(shù)中的一種或兩種以上技術(shù)的組合體進(jìn)行成像分析。
[0013]上述的一種基于高分辨透射電子顯微學(xué)的單分子DNA測(cè)序方法，具體包括以下步驟:
[0014]I)單原子標(biāo)記物溶液的準(zhǔn)備:準(zhǔn)備3種或3種以上具有不同原子序數(shù)的重金屬鹽溶液；將其稀釋后分別與不同的dNTP或其單體的寡聚物溶液反應(yīng)，得到單原子標(biāo)記物溶液；
[0015]2)待測(cè)DNA的寡核苷酸雜交標(biāo)記:將待測(cè)雙鏈DNA的解鏈后與步驟I)的單原子標(biāo)記物溶液混合反應(yīng)，即得到標(biāo)記DNA樣品溶液；
[0016]3) TEM樣品制備:取步驟2)得到的DNA樣品溶液制備于電鏡載網(wǎng)上，得到用于TEM觀察的電鏡樣品；
[0017]4) TEM成像:取電鏡樣品TEM成像即可得到待測(cè)DNA片段的序列信息。
[0018]所述重金屬鹽溶液可包括但不限于硝酸銀溶液、高氯酸金溶液、醋酸鈾溶液、氯酸鉻溶液、醋酸鉛溶液、氯化汞溶液、氯化鋇溶液和四氧化鋨溶液中的3種或3種以上的溶液。
[0019]所述TEM觀察的電鏡樣品的制備方法為:取步驟2)的DNA樣品溶液滴于電鏡專(zhuān)用銅網(wǎng)上，熱風(fēng)快速干燥或者用50°C以下低溫烘烤法得到用于TEM觀察的電鏡樣品。
[0020]所述TEM成像模式為將電鏡樣品在透射電鏡下成高分辨明場(chǎng)像直接觀察，或以高分辨STEM模式高角環(huán)形暗場(chǎng)檢測(cè)器進(jìn)行暗場(chǎng)成像；或先成明場(chǎng)像再使用特征X譜圖的方式對(duì)關(guān)注的區(qū)域進(jìn)行特征元素譜圖成像；或先成明場(chǎng)像再使用電子能量損失譜譜圖的方式對(duì)關(guān)注的區(qū)域進(jìn)行特征元素譜圖成像。
[0021]具體的測(cè)序方法如下:
[0022]1.單原子標(biāo)記物溶液的的準(zhǔn)備
[0023]101.單原子標(biāo)記物應(yīng)為具有不同原子序數(shù)的重金屬鹽溶液?？梢詫⒔饘冫}分散于有機(jī)相、水相中，要求為純度高(色譜純以上)，新鮮制備，至少需準(zhǔn)備3種具有不同原子序數(shù)的重金屬鹽溶液，如硝酸銀、高氯酸金、醋酸鈾、氯酸鉻等，但不局限于此四種鹽溶液。
[0024]102.DNA寡核苷酸的修飾:將上述四種鹽溶液用0.2M磷酸鹽緩沖液(pH = 7.4)稀釋至0.lmmol/L，4種dNTP (dA、dT、dC、dG)或其單體的寡聚物溶液稀釋至0.2mmol/L (相對(duì)于標(biāo)記物過(guò)量)。4種標(biāo)記物分別與4種dNTP等體積混合，25攝氏度條件下反應(yīng)2小時(shí)；15000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘后棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液重新分散標(biāo)記物-寡核苷酸沉淀至0.lmmol/L濃度。
[0025]2.待測(cè)DNA的寡核苷酸雜交標(biāo)記
[0026]201.待測(cè)DNA的磷酸鹽緩沖液置于95攝氏度水浴中，保持30分鐘后取出，立即置于冰水混合物中I分鐘(解鏈)；
[0027]202.待測(cè)DNA溶液逐次與修飾過(guò)的四種標(biāo)記寡核苷酸混合，保持冰水混合物溫度下反應(yīng)30分鐘后，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心7分鐘，取上清液；
[0028]203.在冰水混合物溫度條件下反復(fù)201操作3次；保留上清液；
[0029]3.TEM樣品制備
[0030]301.取步驟203得到的上清液10_20微升，滴在1000-2000目的電鏡專(zhuān)用銅網(wǎng)上，熱風(fēng)或50攝氏度以下低溫烘烤法快速干燥，得到適用于TEM觀察的樣品；
[0031]4.TEM 成像
[0032]401.取步驟301得到的電鏡樣品，在透射電鏡下以高分辨TEM模式或STEM高角環(huán)形暗場(chǎng)(HAADF)模式進(jìn)行成像，應(yīng)能夠觀察到4種不同的原子襯度，分別代表不同的堿基(A/T/C/G中的一種)。將堿基信息順序記錄，即得到待測(cè)基因片段的序列信息。
[0033]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0034]1.與完成人類(lèi)基因組測(cè)序使用的Sanger末端終止法相比，本發(fā)明無(wú)需進(jìn)行大規(guī)模的DNA細(xì)胞克隆(體內(nèi)擴(kuò)增)，時(shí)間和成本均下降6個(gè)數(shù)量級(jí)以上；
[0035]2.與目前廣泛使用的第二代測(cè)序技術(shù)，如454、焦磷酸測(cè)序、鳥(niǎo)槍法等技術(shù)相比，本發(fā)明無(wú)需進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行體外擴(kuò)增，而僅需單分子DNA拷貝即可直接讀取序列，時(shí)間和成本均下降3個(gè)數(shù)量級(jí)以上；也省略了將DNA片段打碎成為20-100bp的短堿基序列再拼接的步驟，一次性讀長(zhǎng)可提高100倍以上，并且無(wú)需后續(xù)大規(guī)模拼接，所需時(shí)間下降兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上，序列信息準(zhǔn)確率從90%左右提高到99%以上；
[0036]3.與目前正在開(kāi)發(fā)的，以納米孔測(cè)序?yàn)榇淼?