熒光定量pcr法檢測(cè)top2a基因表達(dá)的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生物技術(shù)以及臨床分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及熒光 定量PCR法檢測(cè)T0P2A基因 mRNA表達(dá)的引物、探針及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在西方國家其發(fā)病率和病死率居腫瘤之首。 近年來，在我國發(fā)病率也呈直線上升的趨勢(shì)，目前浸潤(rùn)性乳腺癌已被視為全身性疾病，其預(yù) 后的判斷及與預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物備受關(guān)注，由于許多患者亞臨床轉(zhuǎn)移灶，以及化療 耐藥的出現(xiàn)，導(dǎo)致患者無瘤生存期縮短，檢測(cè)有關(guān)乳腺癌耐藥相關(guān)基因，對(duì)指導(dǎo)規(guī)范化治療 尤為重要。
[0003] 在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TOPO II α的基因表達(dá)和腫瘤細(xì)胞對(duì)拓樸異構(gòu)酶抑制劑 的敏感性明顯相關(guān)，Τ0Ρ2Α基因異常的病人可以明顯受益于含有拓樸異構(gòu)酶抑制劑的輔助 化療方案，Τ0Ρ2Α高表達(dá)的病人使用CEF方案進(jìn)行治療可以降低61 %的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和51 %的 死亡風(fēng)險(xiǎn)，而Τ0Ρ2Α低表達(dá)的患者使用CEF方案只能降低6%的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和10 %的死亡風(fēng) 險(xiǎn)。
[0004] TOP2A 基因 （Topoisomerase II alpha，TOP II α )定位于 l7qll. 2_22 區(qū)域，編碼 DNA拓樸異構(gòu)酶II α，是核基質(zhì)成分之一，在核內(nèi)發(fā)揮作用，能調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變 化，參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及修復(fù)過程。
[0005] 依托泊苷為細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物，作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II，形成藥 物-酶-DNA穩(wěn)定的可逆性復(fù)合物，阻礙DNA修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，依托泊苷的敏感性依賴于其 細(xì)胞TOPO II α蛋白的表達(dá)水平。TOPOII α高表達(dá)的患者可以從依托泊苷治療中獲益。 因此使用Τ0Ρ2Α基因 mRNA水平來評(píng)判患者對(duì)含蒽環(huán)類藥物治療方案，更為準(zhǔn)確。
[0006] 目前用于檢測(cè)T0P2AmRNA水平的方法主要有免疫組織化學(xué)法，該方法檢測(cè)時(shí)間 長(zhǎng)，判讀受主觀因素影響大，不能準(zhǔn)確反映 T0P2A的表達(dá)水平；而cDNA微陣列mRNA表達(dá)譜 分析（基因芯片）方法又存在靈敏度低、易污染等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明提供了一種熒光定量檢測(cè)T0P2A基因 mRNA的引物對(duì)和Taqman探針，特異性強(qiáng)、靈敏度高，重復(fù)性好。
[0008] 本發(fā)明提供的熒光定量檢測(cè)T0P2A基因 mRNA的引物對(duì)A和Taqman探針A，其引物 對(duì)A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~2所示，Taqman探針A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3 所示。
[0009] 本發(fā)明采用熒光PCR結(jié)合Taqman探針法，基于熒光定量PCR技術(shù)來檢測(cè)T0P2A的 基因表達(dá)水平，設(shè)計(jì)了目的基因的cDNA擴(kuò)增引物和特異性Taqman探針，當(dāng)然地，Taqman探 針的5'端標(biāo)記有焚光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有焚光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明優(yōu)選報(bào)告基團(tuán)為FAM， 淬滅基團(tuán)為MGB。引物和探針的核苷酸序列具體為：
[0010] 引物對(duì) A :F :5'-AAGTTACCTGAAGCTC-3'（SEQ ID N0:1);
[0011] R :5' -GGAAGGTGTTTTTAG-3'（SEQ ID N0:2);
[0012] Taqman 探針 A :5' FAM-TCCCCTCTGAATT-MGB3'（SEQ ID N0:3)。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種熒光定量PCR法檢測(cè)T0P2A基因表達(dá)的試劑盒，其包括以上 所述的熒光定量檢測(cè)T0P2A基因的引物對(duì)A和Taqman探針A。
[0014] 優(yōu)選地，上述試劑盒中，還包括用于檢測(cè)內(nèi)參基因 B2M mRNA的引物對(duì)B和Taqman 探針B，引物對(duì)B的核苷酸序列如SEQ ID N0:4~5所示，Taqman探針B的核苷酸序列如 SEQ ID NO:6所示。優(yōu)選Taqman探針B的報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為MGB。選擇內(nèi)參基 因 B2M的目的是為了增加檢測(cè)的準(zhǔn)確性。相較于其它內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)表明，B2M較GAPDH及 GUSB等為內(nèi)參的腫瘤和正常組內(nèi)及組間的表達(dá)差異最小，穩(wěn)定性最佳。
[0015] 引物對(duì) B :F:5' -ATGCTTATACACTTACA-3'（SEQ ID N0:4)，
[0016] R:5' -ACATGGACATGATCTTC-3，（SEQ ID N0:5);
[0017] Taqman 探針 B :5'FAM-GTAGGGTTATAATA-MGB 3'（SEQ ID N0:6)。
[0018] 優(yōu)選地，上述試劑盒中，還包括B2M標(biāo)準(zhǔn)品、T0P2A標(biāo)準(zhǔn)品。T0P2A標(biāo)準(zhǔn)品為含有梯 度濃度T0P2A基因組質(zhì)粒DNA的溶液，B2M標(biāo)準(zhǔn)品為含有梯度濃度B2M基因組質(zhì)粒DNA的 溶液，標(biāo)準(zhǔn)品是作為該試劑盒的陽性對(duì)照及用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。
[0019] 優(yōu)選地，上述試劑盒中，還包括第一鏈cDNA合成體系，具體包括反轉(zhuǎn)錄酶1~5U、 反轉(zhuǎn)錄10XRT Buffer適量、dNTPs 1~2mM、T0P2A基因反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)1~10pM、內(nèi)參基 因 B2M反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)1~10pM，用DEPC水補(bǔ)足至19. 5 μ L ;使用時(shí)加入樣本RNA0. 5 μ g。其 中兩基因的反轉(zhuǎn)錄引物可以根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)，或直接購買商品，只要能夠獲得其對(duì)應(yīng)的 cDNA即可，無其他要求。10XRT Buffer為反轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液，可直接購買市售商品。
[0020] 優(yōu)選地，上述試劑盒內(nèi)共有五管試劑，分別為：
[0021 ] 第一鏈cDNA合成體系；
[0022] 熒光定量PCR檢測(cè)反應(yīng)液：含有TaqDNA聚合酶1~2U、2. 0~5. OmmolMgCljP 0· 2 ~0· 8mmol dNTPs 的 Premix ;引物對(duì) A 1 ~IOpM ;Taqman 探針 A 1 ~IOpM ;引物對(duì) B 1 ~IOpM Jaqman 探針 B 1 ~IOpM ;DEPC 水適量；
[0023] T0P2A 標(biāo)準(zhǔn)品；
[0024] B2M 標(biāo)準(zhǔn)品；
[0025] 陰性對(duì)照品：DEPC水。
[0026] 本發(fā)明所述的A和B僅用于區(qū)別不同的引物對(duì)和探針，并沒有其他特別的意義。
[0027] 本發(fā)明還提供了以上任一所述的熒光定量PCR法檢測(cè)T0P2A基因表達(dá)的試劑盒的 使用方法，其包括以下步驟：
[0028] (1)以腫瘤組織和癌旁正常組織為待檢樣品，提取待檢樣品中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成樣 品 cDNA ;
[0029] (2)以樣品cDNA作為模板，用引物對(duì)A、Taqman探針A、引物對(duì)B和Taqman探針B 進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；T0P2A標(biāo)準(zhǔn)品和B2M標(biāo)準(zhǔn)品也分別進(jìn)行與樣品cDNA同樣的操作， 并根據(jù)T0P2A標(biāo)準(zhǔn)品和B2M標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0030] (3)結(jié)果分析：分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2在0. 99以上，T0P2A基因和B2M基因擴(kuò)增效率 應(yīng)在90-100%范圍，再根據(jù)熒光定量PCR儀器給出的Ct值，進(jìn)行如下計(jì)算：
[0031] Λ Ct (腫瘤組織）=Ct (待檢腫瘤組織樣品）-Ct (B2M基因）；
[0032] Λ Ct (癌旁正常組織）=Ct (待檢癌旁正常組織樣品）-Ct (B2M基因）；
[0033] ΛΛ Ct = Λ Ct (腫瘤組織）-Λ Ct (癌旁正常組織）；
[0034] 相對(duì)表達(dá)率=2 ΔΔ %相對(duì)表達(dá)率> 1判斷為乳腺癌Τ0Ρ2Α基因高表達(dá)。
[0035] 優(yōu)選地，上述使用方法中，步驟（2)中熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性 2min ;95°C 15s，60°C 30s 40個(gè)循環(huán)；當(dāng)熒光基團(tuán)選擇FAM時(shí)在60°C 30s時(shí)采集熒光信號(hào)。
[0036] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0037] 本發(fā)明提供的熒光定量檢測(cè)T0P2A基因 mRNA的引物對(duì)和Taqman探針，特異性強(qiáng)、 靈敏度高，重復(fù)性好?；诖说臒晒舛繖z測(cè)試劑盒，也具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好 等特點(diǎn)，同時(shí)還具有定量準(zhǔn)確、預(yù)混酶、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)：
[0038] 1、操作性：操作簡(jiǎn)便，一步加樣，無需將樣本與酶混合，從樣本提取到出檢測(cè)報(bào)告 只需要2小時(shí)。
[0039] 2、靈敏度：該試劑盒可對(duì)Ing的樣本進(jìn)行有限擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果可信。
[0040] 3、特異性：設(shè)計(jì)的上下游引物均為特異性引物，使用Taqman探針法進(jìn)行定量，具 有很尚的特異性。
[0041] 4、準(zhǔn)確度：以正常組織作為定量媒介，同步PCR反應(yīng)過程，在同等實(shí)驗(yàn)條件下的測(cè) 量實(shí)現(xiàn)Ct值相互比較，可以減少實(shí)驗(yàn)過程造成的誤差，實(shí)現(xiàn)熒光定量PCR檢測(cè)T0P2A基因 的mRNA水平檢測(cè)。
[0042] 5、應(yīng)用范圍：本發(fā)明的能檢測(cè)新鮮冰凍組織、石蠟包埋樣本、血液，具有較高的靈 敏度及特異性，臨床適用范圍寬。
【附圖說明】
[0043] 圖I :T0P2A標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0044] 圖2 :B2M標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0045] 圖3 :T0P2A低表達(dá)擴(kuò)增曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 下面結(jié)合優(yōu)選的具體