本發(fā)明屬于生物工程，涉及一種具有良好抑菌效果的營養(yǎng)型微生物菌劑的制備方法。

背景技術(shù)：

1、 ε-聚賴氨酸（ ε-poly-l-lysine，簡寫 ε-pl，下同）是目前國際范圍內(nèi)獲得批準且被廣泛使用的微生物來源的天然食品防腐劑。 ε-pl是由幾個至幾十個l-賴氨酸單體通過其 α-羧基和 ε-氨基縮合而成的多陽離子同型氨基酸聚合物，其中關(guān)鍵合酶是聚賴氨酸合酶，編碼基因是 pls。 ε-pl因富含陽離子和異形肽鍵（ ε型肽鍵）而展現(xiàn)出對g+細菌、g-細菌、酵母菌、霉菌和病毒的廣譜抑制活性。同時，它還具有水溶性好、耐高溫、無毒性、可食用且可生物降解等特點。因此， ε-pl被首先開發(fā)成防腐保鮮劑應用于食品領域。此外，作為陽離子生物聚合物，它還被用作藥物載體、基因載體、保濕材料和生物芯片等。在我國， ε-聚賴氨酸也被國家衛(wèi)生計生委正式批準用于果蔬及果蔬汁制品、米面及其制品、雜糧制品、肉及肉制品、調(diào)味品、飲料、焙烤食品等食品防腐保鮮的應用，是一種營養(yǎng)型抑菌劑。

2、乳酸鏈球菌素（nisin，下同）也是一種被廣泛應用于食品工業(yè)中的安全天然的防腐劑。nisin是一種由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的陽離子多肽，具有廣泛的抗菌活性，可有效地抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細菌，對其孢子有強烈的抑制作用且對人體無副作用。nisin表現(xiàn)了廣泛的對革蘭氏陽性菌的抑制作用，包括腐敗和食源性病原體，如葡萄球菌、桿菌、肉毒梭菌、單增李斯特菌和多種抗藥性細菌。nisin于1969年被糧農(nóng)組織與世界健康組織（fao/who）確定為安全的食品添加劑，已被50多個國家用作食品防腐劑。nisin已被多國批準，其廣泛應用在食品工業(yè)中作為一種安全高效的食品防腐劑已有幾十年的歷史，廣泛應用于各種食品中。我國批準其列入國標gb2760-86的1990年增補品種中，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中。

3、 ε-pl和nisin都是對環(huán)境友好的天然抑菌成分，抑菌效果顯著，同時它們都是目前被批準加入食品中的生物防腐劑，安全性高，抑菌效果在之前的許多研究中被證實。對于這兩種天然成分的復配，有助于提高抑菌劑的抑菌效果，增加抑菌譜，減少用量而降低成本。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種具有抑菌效果的營養(yǎng)型微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：（1）將 ε-聚賴氨酸編碼基因在枯草芽孢桿菌中進行異源表達，獲得產(chǎn)生 ε-聚賴氨酸的重組質(zhì)粒pma5- pls。（2）在乳酸鏈球菌中過表達 asnh基因，獲得高產(chǎn)乳酸鏈球菌素的重組質(zhì)粒mg36e-asnh。（3）將兩種質(zhì)粒pma5- pls和mg36e- asnh經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后得到的菌劑按比例復配，采用checkerboard法獲得了最佳抑菌效果的復配比例。

2、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒pma5- pls是以pma5為載體，連接聚賴氨酸合酶 pls的編碼基因后轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌wb800中進行表達。

3、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒pma5- pls的培養(yǎng)條件為初始ph?7.0，溫度32℃，接種量5%，震蕩速度200?rpm。培養(yǎng)基的組分為玉米粉15?g/l，大豆粉15?g/l，kno3?5?g/l，mgso4?2?g/l，kh2po4?0.5?g/l，l-賴氨酸?10?g/l。

4、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒pma5- pls的培養(yǎng)時間為36小時，產(chǎn)生的 ε-聚賴氨酸濃度約為501.8?mg/l。

5、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒pmg36e-asnh是以pmg36e為載體，連接天冬酰胺合成酶 asnh基因后制備而成。

6、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒pmg36e-asnh是以乳酸鏈球菌2021rs為宿主菌，所含 asnh基因為多拷貝基因，拷貝數(shù)為6拷貝/基因組。

7、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒pmg36e-asnh的培養(yǎng)條件為初始ph?7.0，溫度30℃，接種量6%，震蕩速度220?rpm。培養(yǎng)基組分為酵母提取物15?g/l，大豆粉15?g/l，蔗糖?20?g/l，nacl1.5?g/l，mgso4?1.5?g/l，kh2po4?1?g/l。

8、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒pmg36e-asnh的培養(yǎng)時間為48小時，產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素的效價為7216?iu/ml。

9、優(yōu)選的，所述兩種質(zhì)粒pma5- pls和mg36e- asnh經(jīng)發(fā)酵后得到的菌劑按比例復配，具有最佳抑菌效果的復配比例為1:12。

10、實施方式

11、實施例1：重組質(zhì)粒pma5- pls的制備

12、（1）取攜帶 pls基因的白色鏈霉菌，采用基因組試劑盒提取白色鏈霉菌的基因，pcr擴增 pls基因；（2）取攜帶pma5載體的 e.?coli?top10，用質(zhì)粒小提試劑盒提取載體pma5；（3）分別對 pls基因和載體pma5進行雙酶切后進行連接，連接成功后通過熱激法將重組質(zhì)粒pma5- pls轉(zhuǎn)化到芽孢桿菌wb800中進行表達。

13、實施例2：重組質(zhì)粒pma5- pls的發(fā)酵培養(yǎng)

14、種子培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基，主要成分為蛋白胨10?g/l，酵母粉5?g/l，氯化鈉10?g/l。發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為玉米粉15?g/l，大豆粉15?g/l，kno3?5?g/l，mgso4?2?g/l，kh2po4?0.5g/l，l-賴氨酸?10?g/l。

15、培養(yǎng)條件為初始ph?7.0，溫度32℃，接種量5%，震蕩速度200?rpm，培養(yǎng)時間為36小時。

16、實施例3： ε-聚賴氨酸含量以及轉(zhuǎn)化率的測定

17、按照itzhaki法將聚賴氨酸標品配成20，40，60，80，100?μg/ml的溶液，取?10?ml不同濃度的聚賴氨酸溶液分別與10?ml甲基橙溶液(l?mmol/l）混合，用0.1?mol/l的磷酸緩沖液加甲基橙作為空白對照，將各混合溶液于30℃水浴振蕩30?min后離心?15?min，取上清液l?ml，稀釋50倍后在465?nm波長的分光光度計中測定吸光值，并繪制標準曲線。取適量經(jīng)離心去菌后的待測樣品，按itzhaki方法計算聚賴氨酸產(chǎn)生量。

18、 ε-聚賴氨酸的轉(zhuǎn)化率公式如下；

19、

20、式中：m ε-聚賴氨酸＝反應液中 ε-聚賴氨酸的濃度×反應液的體積，δml-賴氨酸＝(反應液中初始l-賴氨酸的濃度-反應液中剩余l(xiāng)-賴氨酸的濃度)×反應液的體積。

21、實施例4：重組質(zhì)粒pmg36e-asnh的制備

22、在結(jié)合pmg36e表達載體的開放閱讀框，在多克隆位點處的酶切位點進行引物設計，擴增 asnh基因，并進行電泳檢測和測序驗證。

23、（1）根據(jù)genbank報道的 asnh序列，由基因公司合成該基因片段；（2）取攜帶pmg36e載體的 e.?coli?top10，用質(zhì)粒小提試劑盒提取載體pmg36e；（3）分別對 asnh基因和載體pmg36e進行雙酶切后進行連接，連接成功后通過電轉(zhuǎn)法將重組質(zhì)粒pmg36e-asnh轉(zhuǎn)化到乳酸鏈球菌2021rs中進行表達。

24、實施例5：重組質(zhì)粒pmg36e-asnh的發(fā)酵培養(yǎng)

25、種子培養(yǎng)基的主要成分為：酵母提取物?15?g/l，蛋白胨15?g/l，蔗糖?10?g/l，nacl?1?g/l，mgso4?1?g/l，kh2po4?1?g/l。發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分為酵母提取物15?g/l，大豆粉15?g/l，蔗糖?20?g/l，nacl?1.5?g/l，mgso4?1.5?g/l，kh2po4?1?g/l。

26、培養(yǎng)條件為初始ph?7.0，溫度30℃，接種量6%，震蕩速度220?rpm，培養(yǎng)時間48小時。

27、實施例6：微生物菌劑復配的抑菌效果檢測

28、以常見致病菌（如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等）為抑菌試驗對象，將致病菌接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24?h，菌液離心后傾去上清液，回收沉淀的菌體，加入無菌生理鹽水混勻，制備成菌懸液備用。吸取1?ml制備好的菌懸液，與含瓊脂的液體培養(yǎng)基混合后倒入培養(yǎng)皿中，搖勻，凝固后用7?mm打孔器打孔，分別加入單含質(zhì)粒pma5- pls的菌液、單含質(zhì)粒mg36e- asnh的菌液以及含兩種質(zhì)粒的不同復配比例的菌液，以無菌水為空白對照，適溫條件下培養(yǎng)20?h后觀察并記錄抑菌圈大小，抑菌圈最大時所使用的菌液濃度和復配比例為理想值。

29、采用checkerboard法檢測兩種質(zhì)粒pma5- pls和mg36e- asnh的協(xié)同抑菌效果。計算公式如下：

30、fici值=（質(zhì)粒pma5- pls與mg36e- asnh聯(lián)用/質(zhì)粒pma5- pls單用）+（質(zhì)粒pma5- pls與mg36e- asnh聯(lián)用/質(zhì)粒mg36e- asnh單用），其中fic?≤?0.5時為有協(xié)同作用，0.5＜fici≤1時為有疊加作用。