本發(fā)明涉及芽孢促生菌株b3分離篩選方法，具體涉及一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法。

背景技術(shù)：

1、鹽脅迫是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的主要非生物因素之一，全球鹽漬化土地面積約為8.31×109hm2，嚴(yán)重制約著全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展，植物根際促生菌在緩解非生物脅迫中也能起到一定作用，它能夠在一定程度上提高植物對(duì)干旱、鹽堿等非生物脅迫的耐受性，接種bacillus?subtilis?cnbg-pgpr-1可以顯著改善了番茄細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和葉片光合效率，降低了鹽對(duì)番茄的離子毒性和滲透脅迫，bacillus?safensis?ts3菌株可以去除部分鹽堿化對(duì)蘿卜和燕麥帶了的負(fù)面影響。

2、芽孢桿菌是一類分布廣泛，能夠產(chǎn)生抗逆內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，主要分布于土壤、水、空氣、發(fā)酵食品和動(dòng)物腸道等各種環(huán)境中，芽孢桿菌具有較好的環(huán)境適應(yīng)性，在營(yíng)養(yǎng)缺乏或其他惡劣環(huán)境條件下可以通過(guò)產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生芽孢的方式使其存活，大多芽孢桿菌均易分離培養(yǎng)，并能夠以廉價(jià)的碳源為底物，在發(fā)酵過(guò)程中表現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，更重要的是很多芽孢桿菌不致病，不含外部毒素和內(nèi)毒素，并能分泌多種胞外物質(zhì)，故芽孢桿菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品等多個(gè)領(lǐng)域中均有應(yīng)用。

3、因此分離篩選到具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3，探究在鹽脅迫下耐鹽芽孢桿菌b3對(duì)谷子的促生效果，為鹽堿地專用微生物菌肥的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)尤為重要，為解決上述問(wèn)題，我們提出一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，解決背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

2、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

3、一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，包括以下步驟：

4、s1、耐鹽芽孢桿菌的分離，通過(guò)梯度稀釋和培養(yǎng)，篩選出能夠在高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)的芽孢桿菌，以獲取具備耐鹽能力的菌株；

5、s2、耐鹽菌株的鑒定，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色和16s?rrna序列分析對(duì)篩選出的耐鹽菌株進(jìn)行鑒定，確定其分類地位和特征；

6、s3、盆栽實(shí)驗(yàn)，將鑒定出的耐鹽芽孢促生菌株b3應(yīng)用于鹽脅迫條件下的植物實(shí)驗(yàn)，評(píng)估其在實(shí)際農(nóng)業(yè)環(huán)境中的促生效果；

7、s4、結(jié)果與分析，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，驗(yàn)證芽孢促生菌株b3在鹽脅迫條件下對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，并得出結(jié)論。

8、所述s1步驟包括初篩，其中初篩步驟具體包括：

9、從咸菜樣品中取1.0ml樣品加入9.0ml無(wú)菌水中，稀釋成10-1菌懸液；

10、按上述方法繼續(xù)進(jìn)行梯度稀釋，制成10-2和10-3菌懸液；

11、將不同濃度梯度的菌懸液，80℃處理15min，冷卻至室溫后取100μl涂布在lb固體培養(yǎng)基上；

12、挑選不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行多次劃線，得到純化的細(xì)菌；

13、所述s1步驟包括復(fù)篩，其中復(fù)篩步驟具體包括：

14、用接種環(huán)從平板上反復(fù)挑取單菌落于鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5-15％范圍內(nèi)的lb固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h；

15、通過(guò)逐級(jí)提高鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)，觀察菌株的生長(zhǎng)情況，選取隨鹽濃度增加仍然生長(zhǎng)的菌株，最終得到最耐鹽的細(xì)菌；

16、樣品采自西省長(zhǎng)治市三種不同腌制咸菜汁，以5％nacl的lb固體培養(yǎng)基為選擇性培養(yǎng)基，采用稀釋平板法進(jìn)行耐鹽細(xì)菌的分離；

17、將初篩到的菌株在不同nacl濃度下培養(yǎng)，分析其耐鹽能力；

18、最終選取耐鹽能力最強(qiáng)的菌種b3進(jìn)行研究。

19、優(yōu)選地，所述s2步驟具體包括：

20、對(duì)篩選出的耐鹽菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察和革蘭氏染色，觀察菌落的顏色、含水狀態(tài)、邊緣、外觀形態(tài)、隆起程度、與培養(yǎng)基結(jié)合程度和透明度；

21、通過(guò)16s?rrna序列分析對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定，測(cè)序結(jié)果用blast軟件在genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相似序列，確認(rèn)其為芽孢桿菌b3。

22、優(yōu)選地，所述s3步驟具體包括：

23、將芽孢促生菌株b3制成菌液，用于處理鹽脅迫下的谷子幼苗；

24、實(shí)驗(yàn)分為b3菌液處理組和對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)平行樣本；

25、處理28天后測(cè)量株高、根長(zhǎng)、莖粗及生物量。

26、優(yōu)選地，所述s4步驟具體包括：

27、記錄并分析b3菌液處理組與對(duì)照組的株高、根長(zhǎng)、莖粗及生物量差異；

28、通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析驗(yàn)證芽孢促生菌株b3在鹽脅迫條件下對(duì)谷子幼苗的促生效果。

29、進(jìn)一步的，所述初篩步驟中菌懸液的稀釋倍數(shù)為10-1、10-2和10-3，80℃處理15min，冷卻后將稀釋液分別涂布在lb固體培養(yǎng)基上，倒置在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。

30、進(jìn)一步的，所述復(fù)篩步驟中鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍為5％-15％，其中nacl的重量在50-150g范圍內(nèi)。

31、進(jìn)一步的，所述純化的細(xì)菌通過(guò)16s?rrna序列分析確定為bacillus?sp.strainb3，且其16s?rrna序列與bacillus?proteolyticus?mccc?1a00365t的相似性為99.86％。

32、進(jìn)一步的，所述盆栽實(shí)驗(yàn)中b3菌液處理組通過(guò)每隔7天灌根處理一次，處理28天后測(cè)量谷子幼苗的株高、根長(zhǎng)、莖粗及生物量。

33、進(jìn)一步的，所述結(jié)果與分析步驟中通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析驗(yàn)證b3菌液處理組與對(duì)照組在株高、根長(zhǎng)、莖粗及生物量上的顯著差異，證明芽孢促生菌株b3在鹽脅迫條件下對(duì)谷子幼苗的促生效果。

34、綜上所述，本發(fā)明主要具有以下有益效果：

35、1、b3菌株可以提高植物在鹽脅迫下的耐受性，促進(jìn)植物在鹽堿環(huán)境中的生長(zhǎng)；

36、2、使用b3菌液處理后，谷子的生長(zhǎng)顯著增加，具體表現(xiàn)為株高、莖粗、總鮮重、總干重、根尖計(jì)、根系表面積、根體積和根系長(zhǎng)度的增加；

37、3、芽孢桿菌b3具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，能在不同溫度、ph值和鹽濃度下生長(zhǎng)，適應(yīng)范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng)；

38、4、這種菌株不致病，不含外部毒素和內(nèi)毒素，并能分泌多種胞外物質(zhì)，適合在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用，特別是作為鹽堿地專用微生物菌肥，能有效提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量。

技術(shù)特征：

1.一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，所述s1步驟包括初篩，其中初篩步驟具體包括：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，所述s2步驟具體包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，所述s3步驟具體包括：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，所述s4步驟具體包括：

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，所述初篩步驟中菌懸液的稀釋倍數(shù)為10-1、10-2和10-3，80℃處理15min，冷卻后將稀釋液分別涂布在lb固體培養(yǎng)基上，倒置在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，所述復(fù)篩步驟中鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍為5％-15％，其中nacl的重量在50-150g范圍內(nèi)。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，所述純化的細(xì)菌通過(guò)16s?rrna序列分析確定為bacillussp.strain?b3，且其16srrna序列與bacillus?proteolyticus?mccc?1a00365t的相似性為99.86％。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，所述盆栽實(shí)驗(yàn)中b3菌液處理組通過(guò)每隔7天灌根處理一次，處理28天后測(cè)量谷子幼苗的株高、根長(zhǎng)、莖粗及生物量。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株b3分離篩選方法，其特征在于，所述結(jié)果與分析步驟中通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析驗(yàn)證b3菌液處理組與對(duì)照組在株高、根長(zhǎng)、莖粗及生物量上的顯著差異，證明芽孢促生菌株b3在鹽脅迫條件下對(duì)谷子幼苗的促生效果。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有耐鹽能力的芽孢促生菌株B3分離篩選方法，其技術(shù)方案要點(diǎn)是，包括以下步驟：S1、耐鹽芽孢桿菌的分離；S2、耐鹽菌株的鑒定；S3、盆栽實(shí)驗(yàn)；S4、結(jié)果與分析；本發(fā)明B3菌株可以提高植物在鹽脅迫下的耐受性，促進(jìn)植物在鹽堿環(huán)境中的生長(zhǎng)；使用B3菌液處理后，谷子的生長(zhǎng)顯著增加，具體表現(xiàn)為株高、莖粗、總鮮重、總干重、根尖計(jì)、根系表面積、根體積和根系長(zhǎng)度的增加；芽孢桿菌B3具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，能在不同溫度、pH值和鹽濃度下生長(zhǎng)，適應(yīng)范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng)；這種菌株不致病，不含外部毒素和內(nèi)毒素，并能分泌多種胞外物質(zhì)，適合在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用，特別是作為鹽堿地專用微生物菌肥，能有效提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量。

技術(shù)研發(fā)人員：李進(jìn),王娟,劉凱麗,李寶寶
受保護(hù)的技術(shù)使用者：長(zhǎng)治學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21