本發(fā)明生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制ctla-4表達促進cik細胞體外增殖方法。

背景技術(shù)：

腫瘤生物治療，是除傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療、化療之外的第四種主要治療模式。其治療方法，簡言之，就是通過調(diào)動宿主的天然防御機制或應(yīng)用生物學(xué)物質(zhì)或生物制劑等刺激機體自身的抗腫瘤生物學(xué)反應(yīng)，從而達到殺傷腫瘤、抑制或消除腫瘤生長的目的。需要指出的是，腫瘤生物治療是傳統(tǒng)治療腫瘤手段的重要補充，目前還不能取代傳統(tǒng)治療手段的作用，主要在腫瘤治療維持階段發(fā)揮作用。

cik細胞，即細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine-inducedkiller，cik)是一種新型的免疫活性細胞，cik增殖能力強，細胞毒作用強，具有一定的免疫特性，是目前國際上公認用于腫瘤生物治療最有效的細胞之一。與過去過繼免疫治療所使用過的淋巴因子激活的殺傷細胞(lymphokine-activatedkiller，lak)和cd3單抗活化的殺傷細胞(cd3ak)相比，cik細胞具有更強的細胞增殖能力和更強的抗腫瘤細胞作用，且毒副作用較小。

其中細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokineinducedkillercells,cik)是將人的外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細胞，由于該種細胞同時表達cd3和cd56兩種膜蛋白分子，故又被稱為nk細胞樣t淋巴細胞，兼具t淋巴細胞的抗腫瘤活性和nk細胞的非mhc限制性殺瘤優(yōu)點。cik細胞能以不同的機制識別和殺傷腫瘤細胞：①自然殺傷：cik細胞是非mhc限制性的細胞毒細胞可通過分泌穿孔素和顆粒酶直接裂解腫瘤細胞；②炎癥細胞因子作用：cik細胞活化后能分泌多種抗腫瘤的細胞因子，具有抑瘤殺瘤作用，且對正常組織無毒性作用；③cik細胞誘導(dǎo)腫瘤凋亡殺傷腫瘤細胞；④cik細胞回輸后可以激活機體免疫系統(tǒng)，通過增強t細胞功能起作用，提高機體的免疫功能。目前cik細胞的研究亟待解決的問題包括，治療效果不穩(wěn)定，腫瘤免疫反應(yīng)有待近一步提高。細胞毒性t淋巴細胞相關(guān)抗原-4(cytotoxictlymphocyteassociatedantigen4，ctla-4)與cd28分子都是共刺激分子b7的受體，主要表達于被激活t細胞的表面。而ctla-4與b7結(jié)合后能抑制小鼠和人t細胞的激活，在t細胞活化中起負調(diào)節(jié)作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抑制ctla-4表達促進cik細胞體外增殖方法，通過生物手段抑制免疫反應(yīng)負調(diào)控因子ctla-4，以期提高cik細胞的體外增殖。

為了解決上述技術(shù)問題，采用如下技術(shù)方案：

一種抑制ctla-4表達促進cik細胞體外增殖方法，包括以下步驟：

(1)從外周血中采集和分離單核細胞，將單核細胞放在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

(2)將培養(yǎng)后的單核細胞用細胞因子誘導(dǎo)，抑制了ctla-4分子表達，促進了cik細胞的體外增殖。

(3)將得到的cik細胞分別用基因水平驗證法和蛋白水平驗證法進行檢驗，確定cik細胞的體外增殖量。

進一步，單核細胞放在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)時間為8-12天。

進一步，細胞因子為shctla-4慢病毒，shctla-4慢病毒含干擾序列為5’-ggaatgagttgaccttcctagatga-3’。

進一步，細胞因子的誘導(dǎo)時間為92-100h。

進一步，基因水平驗證法采用pcr法，具體過程：使用qiagerneaseminikit純化總rna，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，以正向引物5’-gacctggccctgcactctcctgttt-3’和反向引物5'-actgtcacccggacctcagtggctt-3'擴增ctla-4分子，內(nèi)參gapdh的擴增引物為5'-tgcctcctgcaccaccaact-3'和5'-cccgttcagctcagggatga-3'。

優(yōu)選后，pcr法的反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為94℃，反應(yīng)時間為30seconds，55℃。

優(yōu)選后，pcr法的反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時間為30seconds，30℃。

優(yōu)選后，pcr法的反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為94℃，反應(yīng)時間為72seconds，30℃。

進一步，蛋白水平驗證法采用westernblot法，westernblot法的具體過程：先以ripa裂解緩沖液裂解1×107個cik細胞，然后再以10％sds-page進行電泳和轉(zhuǎn)膜；之后用2.5％脫脂奶粉封閉膜1h，接著以兔抗-ctla4、gapdh抗體孵育2小時，以羊抗兔igg孵育1小時，最后加入發(fā)光液進行顯影發(fā)光，通過在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞表達綠色熒光蛋白情況確定細胞的感染效率。

由于采用上述技術(shù)方案，具有以下有益效果：

本發(fā)明為一種抑制ctla-4表達促進cik細胞體外增殖方法，利用shctla-4慢病毒感染cik細胞下調(diào)cik細胞ctla-4表達。通過pcr法分析，得到發(fā)現(xiàn)shctla-4慢病毒感染可以顯著抑制cik細胞的ctla-4表達。進一步通過westernblot法分析，shctla-4慢病毒感染可以顯著抑制cik細胞ctla-4蛋白表達，這些結(jié)果表明shctla-4慢病毒感染cik細胞可以顯著抑制cik細胞ctla-4表達。通過用shctla-4慢病毒誘導(dǎo)單核細胞抑制了ctla-4分子表達，促進了cik細胞的體外增殖，并通過基因水平驗證法和蛋白水平驗證法檢驗了cik細胞的體外增殖的效果，使cik細胞具有很強地殺傷癌細胞的能力，殺傷活性高、安全性好。cik細胞的體外增殖比例超過使用傳統(tǒng)擴增方法所獲得的數(shù)量，且細胞因子的使用量較小，降低了細胞培養(yǎng)成本，增加了培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性、簡單易行、成本低廉、使用效果好。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明：

圖1為本發(fā)明中ctla-4mrna表達的pcr法擴增結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明中westernblot法分析ctla-4蛋白表達結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明中將培養(yǎng)10天的cik細胞用慢病毒感染，96小時后收集各組細胞進行計數(shù)的結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明中感染shctla-4慢病毒的cik細胞體外增殖明顯快于感染對照慢病毒的cik細胞的結(jié)果表達圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明了，下面結(jié)合具體實施方式并參照附圖，對本發(fā)明進一步詳細說明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。此外，在以下說明中，省略了對公知技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。

本發(fā)明提供一種抑制ctla-4表達促進cik細胞體外增殖方法，包括以下步驟：

(1)從外周血中采集和分離單核細胞，將單核細胞放在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

(2)將培養(yǎng)后的單核細胞用細胞因子誘導(dǎo)，抑制了ctla-4分子表達，促進了cik細胞的體外增殖。

(3)將得到的cik細胞分別用基因水平驗證法和蛋白水平驗證法進行檢驗，確定cik細胞的體外增殖量。

單核細胞放在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)時間為8-12天。

細胞因子為shctla-4慢病毒，shctla-4慢病毒含干擾序列為5’-ggaatgagttgaccttcctagatga-3’。

細胞因子的誘導(dǎo)時間為92-100h。

基因水平驗證法采用pcr法，具體過程：使用qiagerneaseminikit純化總rna，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，以正向引物5’-gacctggccctgcactctcctgttt-3’和反向引物5'-actgtcacccggacctcagtggctt-3'擴增ctla-4分子，內(nèi)參gapdh的擴增引物為5'-tgcctcctgcaccaccaact-3'和5'-cccgttcagctcagggatga-3'。pcr法的反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為94℃，反應(yīng)時間為30seconds，或者反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時間為30seconds，或者pcr法的反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為94℃，反應(yīng)時間為72seconds。

蛋白水平驗證法采用westernblot法，westernblot法的具體過程：先以ripa裂解緩沖液裂解1×107個cik細胞，然后再以10％sds-page進行電泳和轉(zhuǎn)膜；之后用2.5％脫脂奶粉封閉膜1h，接著以兔抗-ctla4、gapdh抗體孵育2小時，以羊抗兔igg孵育1小時，最后加入發(fā)光液進行顯影發(fā)光，通過在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞表達綠色熒光蛋白情況確定細胞的感染效率。

下面結(jié)合實施例來進一步闡明本發(fā)明的技術(shù)方案：

實施例1：

(1)從外周血中采集和分離單核細胞，將單核細胞放在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10天。

(2)將培養(yǎng)后的單核細胞不用細胞因子誘導(dǎo)。

(3)將得到的cik細胞分別用基因水平驗證法和蛋白水平驗證法進行檢驗，確定cik細胞的體外增殖量。

實施例2：

(1)從外周血中采集和分離單核細胞，將單核細胞放在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10天。

(2)將培養(yǎng)后的單核細胞用shcontrol慢病毒誘導(dǎo)，shcontrol慢病毒的誘導(dǎo)時間為96h。

(3)將得到的cik細胞分別用基因水平驗證法和蛋白水平驗證法進行檢驗，確定cik細胞的體外增殖量。

實施例3：

(1)從外周血中采集和分離單核細胞，將單核細胞放在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10天。

(2)將培養(yǎng)后的單核細胞用shctla-4慢病毒誘導(dǎo)，shctla-4慢病毒的誘導(dǎo)時間為96h。

(3)將得到的cik細胞分別用基因水平驗證法和蛋白水平驗證法進行檢驗，確定cik細胞的體外增殖量。

其中實施例1未采用細胞因子誘導(dǎo)，實施例2作為對照組，采用shcontrol慢病毒誘導(dǎo)，實施例3作為實驗組，采用shctla-4慢病毒誘導(dǎo)。

其中圖1為ctla-4mrna表達的pcr擴增結(jié)果，上面為pcr法結(jié)果電泳圖，下面為根據(jù)電泳條件灰度值分析所得的相對表達差異。

其中圖2為westernblot法分析ctla-4蛋白表達結(jié)果，上面為westernblot圖，下面為根據(jù)圖中條帶灰度值分析所得的蛋白相對表達差異。

圖3和圖4為將培養(yǎng)10天的cik細胞用慢病毒感染，96小時后收集各組細胞進行計數(shù)。

其中圖3為熒光顯微鏡放大倍數(shù)40×的條件下觀測到的圖形，左邊為未感染慢病毒的cik細胞圖，中間為感染對照慢病毒的cik細胞圖，右邊為感染shctla-4慢病毒的cik細胞圖。

由圖4可知，感染shctla-4慢病毒的cik細胞體外增殖明顯快于感染對照慢病毒的cik細胞

本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是通過生物手段抑制免疫反應(yīng)負調(diào)控因子ctla-4，以期提高cik細胞的體外增殖。用shctla-4慢病毒感染cik細胞下調(diào)cik細胞ctla-4表達。通過pcr法分析，發(fā)現(xiàn)shctla-4慢病毒感染可以顯著抑制cik細胞的ctla-4表達。進一步通過westernblot分析，發(fā)現(xiàn)shctla-4慢病毒感染可以顯著抑制cik細胞ctla-4蛋白表達。這些結(jié)果提示shctla-4慢病毒感染cik細胞可以顯著抑制cik細胞ctla-4表達。為進一步研究抑制cik細胞ctla-4表達是否影響cik細胞的體外增殖能力，通過實施例比較了shctla-4慢病毒或shcontrol慢病毒感染72小時后的cik細胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)shctla-4慢病毒感染的cik細胞增殖明顯高于對照慢病毒感染的cik細胞，且細胞成簇狀更明顯。進一步進行活細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，shctla-4慢病毒感染的cik細胞增殖能力明顯高于對照慢病毒感染的cik細胞。綜上所述，采用shctla-4慢病毒誘導(dǎo)，抑制了ctla-4分子表達，促進了cik細胞的體外增殖。

以上僅為本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的技術(shù)特征并不局限于此。任何以本發(fā)明為基礎(chǔ)，為解決基本相同的技術(shù)問題，實現(xiàn)基本相同的技術(shù)效果，所作出地簡單變化、等同替換或者修飾等，皆涵蓋于本發(fā)明的保護范圍之中。