抗藥性癌細(xì)胞的抑制的制作方法
【專利說明】抗藥性癌細(xì)胞的抑制
[0001] 領(lǐng)域
[0002] 所提供的是使用組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase, HDAC)抑制劑抑制或防 止抗藥性癌細(xì)胞生長的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC抑制劑是羅米地辛。
[0003] 背景
[0004] 對抗癌藥物的抗性代表成功癌癥治療的主要障礙。各種抗性機(jī)制和替代存活 途徑已有描述（Redmond等人，F(xiàn)ront Biosci 13:5138-5154,2008)。最新發(fā)現(xiàn)揭示出抗 藥性的非突變性機(jī)制。Trumpp 和 Wiesletler(Nat Clin Prac Oncol 5,337-347,2008) 描述了可通過增強(qiáng)的藥物流出而內(nèi)在地更頑固對抗多種抗癌藥物作用的"癌癥干細(xì)胞" 的一個(gè)小群體。其他研宄牽涉到外遺傳機(jī)制，提示獲得性抗藥性不一定需要穩(wěn)定的可 遺傳的基因改變（Glasspool等人，Br J Cancer, 94:1087-1092, 2006)。在對用表皮 生長因子受體（EGFR)酪氨酸激酶抑制劑（TKIs)治療反應(yīng)良好及后來經(jīng)歷治療失敗的 非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)患者中得到證明，但是又證明在"藥物假日（drug holiday)"后 對 EGFR TKI 再治療有二次反應(yīng)（Kurata 等人，Ann Oncol 15:173-174, 2004 ;Yano 等 人，Oncol Res 15:107-111,2005)。對若干其他抗癌藥物良好建立了類似的再治療反應(yīng) (Cara&Tannock, Ann Oncol 12:23-37,2001)。這些發(fā)現(xiàn)提示對癌癥藥物的獲得性抗性涉及 可逆的"耐藥性（drug-tolerant) "狀態(tài)。
[0005] 最新的數(shù)據(jù)指出稱為耐藥性存留（drug-tolerant persisters, DTPs)細(xì)胞的癌 細(xì)胞亞群體的先存性，耐藥性存留（DTPs)細(xì)胞表現(xiàn)出對高濃度的化療藥物的外遺傳介導(dǎo) 的抗性（Sharma等人，Cell 141:69-80,2010)。雖然DTPs多半是休眠的，但是這些細(xì)胞 中有一小分部恢復(fù)生長，甚至在100X IC5tl藥物濃度存在下，從而產(chǎn)生耐藥性擴(kuò)增的存留 (drug-tolerant expanded persisters, DTEPs)細(xì)胞。組蛋白 H3 賴氨酸 4(H3K4)甲基化和 H3K14乙酰基化的水平在DTPs和DTEPs中顯著降低。
[0006] 由于對抗癌藥物的抗性仍然是抗癌療法中的主要挑戰(zhàn)，因此存在對能夠克服這種 抗性的化合物的需求。
[0007] 概述
[0008] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是通過克服癌細(xì)胞對藥物的抗性來治療癌癥患者 的癌癥的方法，包括向所述患者給予有效量的（i) EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑 制劑，和（ii)HDAC抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑制 劑以及HDAC抑制劑同時(shí)給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC抑制劑在用EGFR酪氨酸激酶抑 制劑或B-Raf激酶抑制劑預(yù)治療之后給予。
[0009] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是用于克服患者的癌細(xì)胞的抗藥性的方法，包 括向所述患者給予有效量的（i)EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑制劑，和（ii)HDAC 抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑制劑以及HDAC抑制 劑同時(shí)給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC抑制劑在用EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激 酶抑制劑預(yù)治療之后給予。
[0010] 用于本文提供的方法中的HDAC抑制劑包括但不限于曲古抑菌素 A(richostatin A) (TSA)、伏林司他（Vorinostat) (SAHA)、丙戊酸（Valproic Acid) (VPA)、羅米地辛 (romidepsin)和MS-275。在一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC抑制劑是羅米地辛。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物是EGFR酪氨酸激酶抑制劑。適合用于本文提 供的方法中的EGFR酪氨酸激酶抑制劑包括但不限于厄洛替尼（Erlotinib)、吉非替尼 (Getifinib)、拉帕替尼（Lapatinib)、阿法替尼（Afatinib)、卡納替尼（Canertinib)、來那 替尼（Neratinib)、培利替尼（Pelitinib)、CP-724714、CUDC-101 和 WZ4002。在一個(gè)實(shí)施方 案中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑是厄洛替尼。
[0012] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物是B-Raf激酶抑制劑。適合用于本文提供的方 法中的B-Raf激酶抑制劑包括但不限于維羅非尼（Vemurafenib) (PLX4032)、索拉非尼 (Sorafenib) (AZ628)、達(dá)拉非尼（Dabrafenib)、PLX4720、⑶C-0879、RAF-265 和 SB690885。 在一個(gè)實(shí)施方案中，B-Raf激酶抑制劑是維羅非尼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，B-Raf激酶抑制 劑是索拉非尼。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過本文提供的方法治療的癌癥是實(shí)體腫瘤。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述癌癥是皮膚癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是肺癌。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是用于抑制或防止對EGFR酪氨酸激酶抑制劑或 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-Raf(B-Raf)激酶抑制劑有抗性的耐藥性存留細(xì)胞（DTP)增殖 的方法，包括使DTPs接觸（i) EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑制劑，和（ii) HDAC抑 制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑制劑以及HDAC抑制劑 同時(shí)添加到癌細(xì)胞中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞在與EGFR酪氨酸激酶抑制劑或 B-Raf激酶抑制劑接觸之后用HDAC抑制劑治療。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是用于抑制或防止對EGFR酪氨酸激酶抑制劑 或B-RAF激酶抑制劑有抗性的耐藥性擴(kuò)增的存留細(xì)胞（DTEP)的集落形成的方法，包括使 DTEPs接觸（i)EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑制劑，和（ii)HDAC抑制劑。在一個(gè) 實(shí)施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑制劑以及HDAC抑制劑同時(shí)添加到癌 細(xì)胞中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞在與EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑制 劑接觸之后用HDAC抑制劑治療。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑是任何EGFR酪氨酸激酶抑制劑。適 合用于本文提供的方法中的EGFR酪氨酸激酶抑制劑包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼、拉 帕替尼、阿法替尼、卡納替尼、來那替尼、培利替尼、CP-724714、CUDC-101和WZ4002。在一個(gè) 實(shí)施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑是厄洛替尼。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，B-Raf激酶抑制劑是任何B-Raf激酶抑制劑。適合用于本文 提供的方法中的B-Raf激酶抑制劑包括但不限于維羅非尼（PLX4032)、索拉非尼（AZ628)、 達(dá)拉非尼、PLX4720、⑶C-0879、RAF-265和SB690885。在一個(gè)實(shí)施方案中，B-Raf激酶抑制 劑是維羅非尼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，B-Raf激酶抑制劑是索拉非尼。
[0018] 用于本文提供的方法中的HDAC抑制劑包括但不限于曲古抑菌素 A(TSA)、伏林司 他（SAHA)、丙戊酸（VPA)、羅米地辛和MS-275。在一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC抑制劑是羅米地 辛。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是用于治療患者的抗藥性癌癥的藥物組合物。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含（i) EGFR酪氨酸激酶抑制劑或B-Raf激酶抑制劑， 和（ii)HDAC抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC抑制劑是羅米地辛。在另一個(gè)實(shí)施方案中， EGFR酪氨酸激酶抑制劑是厄洛替尼。在又一個(gè)實(shí)施方案中，B-Raf激酶抑制劑是維羅非尼。 在又一個(gè)實(shí)施方案中，B-Raf激酶抑制劑是索拉非尼。
[0020] 參照發(fā)明詳述和實(shí)施例可以更全面地理解本實(shí)施方案，這些實(shí)施例旨在具體說明 非限制性的實(shí)施方案。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖1顯示AZ628和羅米地辛的組合對黑色素瘤細(xì)胞系（M14)中的DTEP突現(xiàn) (emergence)的影響。在"連續(xù)"時(shí)間表（45天）期間，在2 μΜ(對于AZ628)和0· 5nM(對 于羅米地辛）的濃度下，每3天將兩種藥劑加入到細(xì)胞中。在選擇日，使用CellTiter-Gl0 測量細(xì)胞活力。
[0023] 圖2顯示厄洛替尼和羅米地辛的組合對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（HCC827)中的DTEP 突現(xiàn)的影響。在"連續(xù)"時(shí)間表（27天）期間，在2 μΜ(對于厄洛替尼）和1.0 nM(對于羅 米地辛）的濃度下，每3天將兩種藥劑加入到細(xì)胞中。在選擇日，使用CellTiter-Glo測量 細(xì)胞活力。
[0024] 圖3A和3B描繪有限數(shù)目的羅米地辛劑量對防止黑色素瘤細(xì)胞系M14中的DTEP 生長的影響。羅米地辛以〇. 5nM的濃度使用，AZ628以2 μΜ的濃度使用。圖3C描繪有限 數(shù)目的羅米地辛劑量對防止非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（HCC827)中的DTEP生長的影響。羅米地 辛以1.0 nM的濃度使用，厄洛替尼以2 μ M的濃度使用。
[0025] 圖4Α顯示6小時(shí)羅米地辛暴露（洗脫（wash-out))對防止黑色素瘤細(xì)胞系（Μ14) 中的DTEP生長的影響。將羅米地辛和AZ628每3天分別以0. 5nM和2 μ M的濃度加入到細(xì) 胞培養(yǎng)物中，同時(shí)無洗脫。在洗脫實(shí)驗(yàn)中，在添加藥物后6小時(shí)，從細(xì)胞中吸出含有ΑΖ628 和羅米地辛的條件培養(yǎng)基并且更換為含有ΑΖ628的培養(yǎng)基。羅米地辛以0. 5ηΜ(Α)、2ηΜ(Β) 或IOnM(C)的濃度使用。圖4Β顯示6小時(shí)羅米地辛暴露（洗脫）對防止非小細(xì)胞肺癌細(xì) 胞系（HCC827)中的DTEP生長的影響。將羅米地辛和厄洛替尼每3天分別以1.0 nM和2 μΜ 的濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，同時(shí)無洗脫。在洗脫實(shí)驗(yàn)中，在添加藥物后6小時(shí)，從細(xì)胞中 吸出含有厄洛替尼和羅米地辛的條件培養(yǎng)基并且更換為含有厄洛替尼的培養(yǎng)基。羅米地辛 以1、5和20ηΜ的濃度使用。
[0026] 圖5顯示在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（HCC827)中，在用厄洛替尼預(yù)治療之后，羅米地 辛對防止DTEP突現(xiàn)的影響。條件培養(yǎng)基每三天更換為新鮮的含有藥物的培養(yǎng)基。在第12 天，將羅米地辛以InM的濃度加入到含有藥物的培養(yǎng)基中。
[0027] 詳述
[0028] 定義
[0029] 應(yīng)當(dāng)理解，以上一般性描述和以下詳細(xì)描述僅僅是示例性的和解釋性的且不構(gòu)成 對請求保護(hù)的任何主題的限制。在本申請中，單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)，除非另有明確說明。必 須注意到，如英文說明書和附上的權(quán)利要求書中所使用的，不定冠詞"a"和"an"（ "一個(gè)"、 "一種"及定冠詞"the"（ "該"）包括復(fù)數(shù)形式以及單數(shù)所指物，除非正文中另外清楚地指 明。還應(yīng)當(dāng)注意到，"或"的使用意指"和/或"，除非另有說明。此外，術(shù)語"包括"以及其 他形式（例如，"包含"、"含有"）的使用不是限制性的。
[0030] 術(shù)語"癌癥"是指皮膚組織、器官、血液和血管的疾病，包括但不限于膀胱、骨或血 液、腦、乳腺、子宮頸、胸、結(jié)腸、子宮內(nèi)膜、食管、眼、頭、腎、肝臟、淋巴結(jié)、肺、口、頸、卵巢、胰 腺、前列腺、直腸、胃、睪丸、咽喉和子宮的癌癥。
[0031] 如本文所用的術(shù)語"增殖性紊亂或疾病"是指在多細(xì)胞生物體中的細(xì)胞的一個(gè) 或多個(gè)亞群（subset)不需要的細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致對該多細(xì)胞生物體有害（即，不適或 預(yù)期壽命減少）。例如，如本文所用的，增殖性紊亂或疾病包括贅生性疾?。╪eoplastic disorders)和其他增殖性疾?。╬roliferative disorders) 〇
[0032] 如本文所用的術(shù)語"增殖"是指細(xì)胞（例如癌細(xì)胞）分裂的快速和重復(fù)演替。
[0033] 如本文所用的術(shù)語"化學(xué)抵抗性癌癥（chemoresistant cancer) "意指一直對某種 療法有反應(yīng)，然后因?yàn)榘┘?xì)胞對化學(xué)療法的作用無反應(yīng)而開始生長的癌癥類型。
[0034] 如本文所用的術(shù)語"黑色素瘤"意指黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤。黑色素瘤起源于黑 色素細(xì)胞主要存在的皮膚，但也可以起源于身體中含有黑色素細(xì)胞的任何部位。
[0035] 如本文所用的術(shù)語"非小細(xì)胞肺癌"是指除小細(xì)胞肺癌以外的任何類型的上皮性 肺癌。
[0036] 如本文所用的術(shù)語"治療"意指與紊亂或疾?。ɡ?，癌癥或腫瘤綜合征）相關(guān)的 癥狀的整體或部分減輕，或者使那些癥狀的進(jìn)一步進(jìn)展或惡化減慢或停止。
[0037] 如本文所用的術(shù)語"抑制"意指使細(xì)胞或細(xì)胞系（例如，癌細(xì)胞或癌細(xì)胞系）的生 長減慢或降低。
[0038] 如本文所用的術(shù)語"防止"意指細(xì)胞或細(xì)胞系（例如，癌細(xì)胞或癌細(xì)胞系）的生長 不存在或缺乏。
[0039] 如本文所用的術(shù)語"突現(xiàn)（emergence) "意指癌細(xì)胞群體中的抗藥性癌細(xì)胞的出現(xiàn) (occurrence)或復(fù)現(xiàn)（recurrence) 〇
[0040] 術(shù)語"藥物"、"治療劑"和"化學(xué)治療劑"是指給予對象以治療、預(yù)防或減輕病癥、 紊亂或疾病的一種或多種癥狀的化合物或其藥物組合物。
[0041] 如本文所用的術(shù)語"耐藥性存留細(xì)胞（drug-tolerant persisters, DTPs) "是指對 高濃度的化療藥物具有耐受性的癌細(xì)胞，即，當(dāng)藥物以比IC5tl高數(shù)百倍的濃度使用時(shí)，對癌 癥藥物治療具有抗性的癌細(xì)胞。
[0042] 如本文所用的術(shù)語"耐藥性擴(kuò)增的存留細(xì)胞（drug-tolerant expanded persisters，DTEPs) "是指能夠在高濃度的連續(xù)癌癥藥物治療下增殖的癌細(xì)胞。
[0043] 如本文所用的術(shù)語"癌細(xì)胞"是指以不受調(diào)節(jié)的、加快的節(jié)奏生長和分裂的任何來 源的細(xì)胞。
[0044] 如本文所用的術(shù)語"癌細(xì)胞系"是指從原代癌細(xì)胞建立的細(xì)胞系，其中所有的細(xì)胞 都具有相同的特性。
[0045] 如本文所用的術(shù)語"藥物"、"治療劑"和"化學(xué)治療劑"是指給予對象以治療、預(yù)防 或減輕病癥、紊亂或疾病的一種或多種癥狀的化合物或其藥物組合物。
[0046] 如本文所用的術(shù)語"表皮生長因子受體（epidermal growth factor rec印tor，EGFR) "是指表皮生長因子家族（EGF-家族）成員的細(xì)胞表面受體。
[0047] 如本文所用的術(shù)