抑制晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的方法，該方法采用聚乳酸防粘連膜。與現(xiàn)有的相比，本發(fā)明保護(hù)的方法可以抑制晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、粘附、遷移或成血管功能，減少新生血管的形成，從而預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生。
【專利說明】抑制晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抑制晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的方法、一種減少新生血管的形成的方法以及一種模擬預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]感染或手術(shù)易引起粘連，粘連的過程相對(duì)較為復(fù)雜，除受到纖維蛋白溶解機(jī)制失調(diào)的影響外，各種細(xì)胞因素和生長因子等也對(duì)粘連的形成產(chǎn)生一定的影響。研究表明，術(shù)后粘連如持續(xù)3天未能溶解，則有成纖維細(xì)胞增生，伴隨新生毛細(xì)血管長入其中，在相互接觸的組織間形成永久性纖維性粘連。
[0003]現(xiàn)有的關(guān)于粘連的研究基本上集中在成纖維細(xì)胞，但新生血管的生成是永久性粘連形成的一個(gè)重要過程?，F(xiàn)有的研究顯示，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitorcells, EPCs)，特別是晚期EPCs，具有和成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞相似的特性，在一定條件下，能在組織損傷部位、機(jī)體缺血區(qū)及肉芽形成過程中形成新生血管。
[0004]術(shù)后粘連是外科手術(shù)中亟待解決的難題，由于組織的創(chuàng)傷，結(jié)締組織纖維與相鄰的器官或組織結(jié)合在一起，從而形成異常結(jié)構(gòu)，造成關(guān)節(jié)活動(dòng)受限或畸形、粘連性腸梗阻、不孕癥及盆腔炎癥等嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥。受損組織和與其相接觸的臟器間形成的暫時(shí)性纖維蛋白性粘連，正常情況下可被間皮及間皮下毛細(xì)血管內(nèi)存在的纖維蛋白裂解酶所溶解，但這些粘連如持續(xù)3天未能溶解，則有成纖維細(xì)胞增生，伴隨新生毛細(xì)血管長入其中，在相互接觸的組織間形成永久性纖維性粘連。
[0005]目前臨床上使用的防粘連膜殼聚糖，其缺點(diǎn)在于殼聚糖防粘連膜材料活性保持時(shí)間較短。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明中，聚乳酸防粘連膜購自廣州市弘健生物醫(yī)用制品科技有限公司；SD大鼠(體重100-150g，雌雄不限)購自中國人民解放軍第八十九醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；EGM-2培養(yǎng)基購自美國(Invitrogen,);胎牛血清(0.25%胰蛋白酶)購自美國(HyClone);纖維粘連蛋白(Fibronectin, FN)購自德國(Roche);CCK_8 購自日本(Dojindo) ；Matrigel 膠，AnnexinV/PI凋亡試劑購自美國(BD) ;β-半乳糖苷酶試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；Boyden小室購自江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠；酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories)購自美國；C02培養(yǎng)箱購自美國(Thermo);熒光顯微鏡購自德國(Leica);流式細(xì)胞儀購自美國(BD FACSCaliburX
[0007]本發(fā)明的目的之一就在于提供一種抑制晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的方法。
[0008]技術(shù)方案是:一種抑制晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的方法，該方法采用聚乳酸防粘連膜。
[0009]作為優(yōu)選，所述晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能為增殖、粘附、遷移或/和成血管功能。
[0010]本發(fā)明的目的之二在于提 供一種減少新生血管的形成的方法。
[0011]技術(shù)方案是:一種減少新生血管的形成的方法，該方法采用上述方法減少新生血管的形成。
[0012]本發(fā)明的目的之三在于提供一種預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的模擬方法。
[0013]技術(shù)方案是:一種預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，該方法包括:
[0014]大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定；
[0015]用胰蛋白酶消化、完全EGM-2培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，接種于六孔板中，六孔板孔中預(yù)先放入聚乳酸防粘連膜膜片，置于培養(yǎng)箱中，每隔3天換一次液。
[0016]作為優(yōu)選，所述大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定為采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單核細(xì)胞，以完全EGM-2培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將其接種于預(yù)先經(jīng)FN打底的培養(yǎng)瓶中，置37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中；4天后更換培養(yǎng)液，以后每隔3天換一次液；待細(xì)胞生長到80%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶按1:1比例傳代；以傳至第三代的EPCs，即晚期EPCs為靶細(xì)胞，細(xì)胞行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1染色，雙染陽性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VEGFR2、vWF、CD31及VE-Cadherin等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。
[0017]作為優(yōu)選，所述聚乳酸防粘連膜膜片為無菌的聚乳酸防粘連膜膜片。
[0018]作為優(yōu)選，所述聚乳酸防粘連膜膜片規(guī)格為1.5cmX 1.5cm。
[0019]作為優(yōu)選，所述細(xì)胞懸液密度為5X104/ml的或所述胰蛋白酶為0.25%胰蛋白酶。
[0020]作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)箱為溫度為37°C、含5%C02的培養(yǎng)箱。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0022]EPCs又稱為血管內(nèi)皮干細(xì)胞，作為一種原始細(xì)胞，EPCs具有較強(qiáng)的分化增殖能力和生物活性。研究發(fā)現(xiàn)EPCs至少分為早期EPCs和晚期EPCs兩種類型[19]。早期EPCs出現(xiàn)于單個(gè)核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的早期，表達(dá)⑶14、⑶45及⑶133等干細(xì)胞標(biāo)記，不具有體外成血管能力，晚期EPCs多出現(xiàn)于培養(yǎng)2~4周，表達(dá)VEGFR2，vWF,⑶31及VE-鈣黏素等成熟內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記，因其典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和高增殖潛力被認(rèn)為是真正的EPCs，能在組織損傷部位、機(jī)體缺血區(qū)及肉芽形成過程中形成新生血管。因此抑制晚期EPCs的功能有利于抑制永久性纖維性粘連的產(chǎn)生。
[0023]相對(duì)于殼聚糖防粘連膜材料活性保持時(shí)間較短的缺點(diǎn)，聚乳酸防粘連膜植入人體后，在手術(shù)創(chuàng)面愈合時(shí)間內(nèi)始終保持活性，將會(huì)在預(yù)先設(shè)計(jì)的時(shí)間內(nèi)逐漸降解、吸收，最終形成二氧化碳和水，以呼吸和體液的形式排出體外，無任何殘留和蓄積。
[0024]本發(fā)明將晚期EPCs種植于聚乳酸防粘連膜上培養(yǎng)一定時(shí)間后，細(xì)胞的增殖、粘附、遷移、成血管功能均降低，衰老比率增高。該研究結(jié)果提示聚乳酸防粘連膜除在手術(shù)創(chuàng)面和周圍組織之間形成自然屏障，抑制成纖維細(xì)胞對(duì)手術(shù)創(chuàng)面的入侵外，尚可通過抑制晚期EPCs的功能來減少新生血管的形成。
[0025]本發(fā)明中，由于聚乳酸及其共聚物的物理和化學(xué)性能俱佳，具有可降解性和生物相容性，它能夠在體內(nèi)完全代謝無蓄積，最終的降解產(chǎn)物是CO2和H2O,對(duì)人體無毒、無刺激，因此本發(fā)明方法對(duì)增殖、粘附、遷移、體外成血管、細(xì)胞衰老等指標(biāo)測(cè)定結(jié)果均表明聚乳酸防粘連膜對(duì)晚期EPCs的功能有抑制作用，提示聚乳酸防粘連膜亦可通過抑制EPCs的功能，減少新生血管的形成，預(yù)防手術(shù)后永久性粘連的發(fā)生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1聚乳酸防 粘連膜對(duì)晚期EPCs細(xì)胞形態(tài)的影響示意圖；[0027]圖2聚乳酸防粘連膜對(duì)晚期EPCs增殖的影響示意圖；
[0028]圖3聚乳酸防粘連膜對(duì)晚期EPCs粘附的影響示意圖；
[0029]圖4聚乳酸防粘連膜對(duì)晚期EPCs遷移的影響示意圖；
[0030]圖5聚乳酸防粘連膜對(duì)晚期EPCs體外成血管能力的影響示意圖；
[0031]圖6聚乳酸防粘連膜對(duì)晚期EPCs凋亡的影響示意圖；
[0032]圖7聚乳酸防粘連膜對(duì)晚期EPCs衰老的影響示意圖；
[0033]圖1-7中，Control是對(duì)照組，PLLA是實(shí)驗(yàn)組；圖3中，A為熒光顯微鏡下遷移細(xì)胞圖像(X 100)，B為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果；圖4中，A為熒光顯微鏡下遷移細(xì)胞圖像(X100)，B為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果；圖5中，A為光鏡下晚期EPCs體外成血管圖像(X 100)，B為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果；圖6中，A為EPCs凋亡的流式散點(diǎn)圖，B為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果；圖7中，A為光鏡下晚期EPCs β -gal細(xì)胞衰老染色圖像(X 100)，B為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0035]實(shí)施例1
[0036]①大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定
[0037]采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單核細(xì)胞，以完全EGM-2培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將其接種于預(yù)先經(jīng)FN打底的培養(yǎng)瓶中，置37°C含5%C02 (體積百分比)的培養(yǎng)箱中。4天后更換培養(yǎng)液，以后每隔3天換一次液。待細(xì)胞生長到80%左右時(shí)，用0.25% (重量百分比)胰蛋白酶按1:1比例傳代。以傳至第三代的EPCs，即晚期EPCs為靶細(xì)胞，細(xì)胞行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1染色，雙染陽性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VEGFR2、vWF、CD31及VE-Cadherin等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。
[0038]②取上面①制取的晚期EPCs，用0.25%胰蛋白酶消化、完全EGM-2培養(yǎng)基重懸制成密度為5X104/ml的細(xì)胞懸液，接種于六孔板中，本發(fā)明組六孔板孔中預(yù)先放入無菌的聚乳酸防粘連膜膜片(1.5cmXl.5cm)，對(duì)照組孔中不放置，置于37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中，每隔3天換一次液，6天后進(jìn)行形態(tài)觀察及下面的功能檢測(cè)。
[0039]形態(tài)觀察1-晚期EPCs細(xì)胞形態(tài)觀察(本發(fā)明組與對(duì)照組)
[0040]觀察結(jié)果見圖1和圖2。
[0041]由圖1-圖2可見，種植于聚乳酸防粘連膜上晚期EPCs胞體略大于對(duì)照組，有偽足形成，總體細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組。
[0042]功能檢測(cè)1-增殖功能檢測(cè)
[0043]采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。向96孔板中均勻加入細(xì)胞(4000個(gè)細(xì)胞/100 μ I/孔)，置37°C 5%C02培養(yǎng)箱48h后取出，棄去各孔培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑和培養(yǎng)基的混合液(按1:10比例)，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60min，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm波長的吸光度。
[0044]將晚期EPCs分別種植于聚乳酸防粘連膜上或普通培養(yǎng)板。6天后以CCK-8法檢測(cè)EPCs的增殖能力。檢測(cè)結(jié)果見圖2。
[0045]如圖2所示，聚乳酸防粘連膜抑制晚期EPCs的增殖能力(Ρ〈0.01)。
[0046]功能檢測(cè)2-粘附能力檢測(cè)
[0047]用10mg/L的FN預(yù)包被12孔板2h，PBS洗3遍。將I X 104晚期EPCs種植于預(yù)先包被的培養(yǎng)板中，置37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中30min后取出，IXPBS洗掉未貼壁的細(xì)胞，每孔隨機(jī)取6個(gè)視野(XlOO)計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。
[0048]將晚期EPCs分別種植于聚乳酸防粘連膜上或普通培養(yǎng)板。6天后，細(xì)胞再次接種于經(jīng)FN預(yù)處理的培養(yǎng)板中，30min后觀測(cè)粘附細(xì)胞數(shù)，結(jié)果見圖3。
[0049]由圖3可知，聚乳酸防粘連膜抑制晚期EPCs的粘附能力(Ρ〈0.01)。
[0050]功能檢測(cè)3-遷移功能檢測(cè)
[0051]采用改良的Boyden小室法觀察細(xì)胞遷移情況，用ΕΒΜ-2培養(yǎng)基制成懸液計(jì)數(shù)，50 μ I細(xì)胞(2X 104)懸浮液注入上室，用培養(yǎng)基加滿下室。置于37°C、5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。8h后，刮去濾膜上面的未移動(dòng)細(xì)胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(X 100)，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，取其平均數(shù)。
[0052]以改良Boyden小室法檢測(cè)聚乳酸防粘連膜對(duì)晚期EPCs遷移能力的影響。結(jié)果見圖4。
[0053]由圖4可知，本發(fā)明組遷移的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(P〈0.01)，提示聚乳酸防粘連膜抑制晚期EPCs的遷移能力。
[0054]功能檢測(cè)4-衰老功能檢測(cè)
[0055]采用β_半乳糖苷酶法檢測(cè)細(xì)胞衰老。按說明書進(jìn)行洗滌、固定、染色，置37°C無CO2恒溫箱中20h后取出，光學(xué)顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。表達(dá)β-gal活性的地方呈藍(lán)色，計(jì)算視野中的染成藍(lán)色的細(xì)胞陽性率。
[0056]體外成血管實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。
[0057]由圖5可知，聚乳酸防粘連膜可抑制晚期EPCs在Matrigel上形成管腔樣結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組比較，其形成的血管腔數(shù)量較少，細(xì)胞連接比較松散。圖像及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組晚期EPCs形成的血管樣結(jié)構(gòu)管腔數(shù)明顯低于對(duì)照組(P〈0.01)。
[0058]功能檢測(cè)5-凋亡功能檢測(cè)
[0059]采用Annexin V-FITC和PI雙染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)。
[0060]收集對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組晚期EPCs行AnnexinV/PI染色，F(xiàn)ASC檢測(cè)細(xì)胞凋亡，設(shè)定AnnexinV (+)PI(_)細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。結(jié)果見圖6。
[0061]由圖6可知，聚乳酸防粘連膜對(duì)晚期EPCs凋亡無明顯影響。
[0062]功能檢測(cè)6-體外成血管功能檢測(cè)
[0063]吸取100 μ I/孔基質(zhì)膠加入96孔板，37 V，5%C0 2孵育Ih后，將晚期EPCs以2X 104/ml密度接種于基質(zhì)膠，8h后，倒置顯微鏡下拍照觀察。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus (Media Cybernetics, USA)分析形成管腔數(shù)。
[0064]結(jié)果見圖7。
[0065]由圖7可知，β -gal細(xì)胞衰老染色顯示:與對(duì)照組相比，聚乳酸防粘連膜實(shí)驗(yàn)組晚期EPCs藍(lán)染細(xì)胞數(shù)較多，其染色陽性細(xì)胞百分比率為(22.19±2.37)%，顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(15.03 ±2.30)%(Ρ〈0.01)。
[0066]本發(fā)明中，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的所有數(shù)據(jù)以x±χ表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，P 〈0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
【權(quán)利要求】
1.一種抑制晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的方法，其特征在于:該方法采用聚乳酸防粘連膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的方法，其特征在于:所述晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能為增殖、粘附、遷移或/和成血管功能。
3.一種減少新生血管的形成的方法，其特征在于:該方法通過權(quán)利要求1或2所述的方法減少新生血管的形成。
4.一種預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的方法，其特征在于:該方法采用聚乳酸防粘連膜。
5.一種預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，該方法包括: 大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定； 用胰蛋白酶消化、完全EGM-2培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，接種于六孔板中，六孔板孔中預(yù)先放入聚乳酸防粘連膜膜片，置于培養(yǎng)箱中，每隔3天換一次液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定為采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單核細(xì)胞，以完全EGM-2培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將其接種于預(yù)先經(jīng)FN打底的培養(yǎng)瓶中，置37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中；4天后更換培養(yǎng)液，以后每隔3天換一次液；待細(xì)胞生長到80%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶按1:1比例傳代；以傳至第三代的EPCs，即晚期EPCs為靶細(xì)胞，細(xì)胞行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1染色，雙染陽性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VEGFR2、vWF、CD31及VE-Cadherin等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述聚乳酸防粘連膜膜片為無菌的聚乳酸防粘連膜膜片。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述聚乳酸防粘連膜膜片規(guī)格為1.5cmX 1.5cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述細(xì)胞懸液密度為5 X 104/ml的或所述胰蛋白酶為0.25%胰蛋白酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防感染或手術(shù)后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述培養(yǎng)箱為溫度為37°C、含5%C02的培養(yǎng)箱。
【文檔編號(hào)】A61K31/765GK103784469SQ201410027874
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】成敏, 官秀梅, 李鑫 申請(qǐng)人:濰坊醫(yī)學(xué)院