本發(fā)明涉及的是美容整形技術領域，具體涉及一種體內重建毛囊的方法。
背景技術：
目前有三種常用重建毛囊方法：小室法、注射法和移植法，這些方法都有各自的缺陷，實用價值不高。比如小室法是將含有細胞的小室植入小鼠背部，該方法花費的時間較長，且針對不同的傷口形態(tài)需要制作不同大小的小室，在傷口愈合之前，被試動物需要一直帶著這個沉重的小室，不適用于臨床大規(guī)模應用。注射法是將毛囊混合細胞注射到小鼠皮內或皮下，該方法簡便易操作，但不適合注射團塊細胞和數量較多的細胞，而且重建的毛發(fā)生長方向雜亂，不易穿出皮膚，再生毛發(fā)效率較低，因此，該方法將來也不能用于臨床實踐。移植法是最近改良的一種新的移植方法能，有效再生毛發(fā)，但它跟小室法相似，需要大片切除宿主的皮膚(創(chuàng)傷大)，移植操作比較復雜，實際應用，特別是開發(fā)臨床治療脫發(fā)的應用受限?；诖?，設計一種新型的體內重建毛囊的打洞法尤為必要。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術上存在的不足，本發(fā)明目的是在于提供一種體內重建毛囊的方法(孔洞法)，操作簡便，創(chuàng)傷小，毛囊形成效率高，適合注射團塊細胞和數量較多的細胞，易于推廣使用，并且可開發(fā)應用于臨床或美容領域來解決脫發(fā)問題。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過如下的技術方案來實現(xiàn)：一種體內重建毛囊的方法，其步驟為：
(1)細胞分離：取出生1-3天的c57小鼠，剪去四肢和尾巴，用鑷子把整塊皮剝下，浸泡在含有2.5mg/ml解離酶的pbs中4℃孵育過夜，機械法將表皮細胞和真皮細胞分離。
(2)細胞培養(yǎng)：將上步新鮮分離的細胞按照以下方法培養(yǎng)擴增：
①表皮細胞培養(yǎng)：用含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸細胞，接種到事先用包被基質處理過的細胞培養(yǎng)瓶(細胞數大約在300萬-500萬每t75細胞培養(yǎng)瓶)中，培養(yǎng)三天，之后換成cnt07或其它表皮培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2天換液一次，顯微鏡下觀察細胞，待細胞長滿時進行傳代或后續(xù)研究，表皮按1：3傳代。
②真皮細胞培養(yǎng)：10%胎牛血清的dmem并帶有fgf生長因子的真皮培養(yǎng)基重懸細胞，接種在100mm細胞培養(yǎng)皿，每5天換一次液，細胞長滿后傳代或直接進行第3步，真皮按1：3-10倍傳代。
(3)細胞球培養(yǎng)：取分離或培養(yǎng)好的真皮和表皮細胞按一定比例混合，重懸在含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem真皮培養(yǎng)基中，接種到不能貼壁的培養(yǎng)皿(6孔板)進行懸浮培養(yǎng)，在37度培養(yǎng)箱孵育16-24小時，形成細胞球狀。
(4)細胞團塊培養(yǎng)：取分離或培養(yǎng)好的真皮和表皮細胞按一定比例混合，重懸在含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem真皮培養(yǎng)基中，接種到薄膜如硅膠膜上，在37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時形成細胞團塊。
(5)移植前細胞準備：可以直接取步驟(1)中的新鮮分離的皮膚單細胞，或步驟(2)中的培養(yǎng)擴增的表皮和真皮細胞按一定比例混合的單細胞，或步驟(3)中的細胞球，又或步驟(4)中的細胞團塊，將其重懸在5-10ulf12培養(yǎng)液，細胞數可以控制在1000-100萬/ul的濃度進行移植。
(6)在裸鼠皮膚上打洞：將免疫缺陷小鼠(裸鼠)麻醉，用21g針頭或取皮器進行皮膚打洞，洞的大小可根據需要而定。
(7)細胞移植：將第5步準備好的細胞用移液管槍頭轉移到打好的洞內，轉移好所有細胞，蓋上硅膠膜，必要時可縫合皮膚與膜片，然后鋪一層凡士林紗布，包扎小鼠。
(8)觀察處理：及時觀察小鼠，7-10天去掉包扎，3周后可見毛發(fā)生長。
作為優(yōu)選，所述步驟(1)表皮細胞分離的步驟為：將c57乳鼠的表皮組織切成均勻的粘稠狀，置于含有0.025%胰酶的dpbs中，37℃水浴震蕩消化20-30分鐘，100um過濾器過濾，細胞懸液用含10%fbs的dmem中和，低速離心，沉淀用f12培養(yǎng)基洗一次，然后再用f12培養(yǎng)基重懸，細胞計數。
真皮細胞分離的步驟為：用手術刀將乳鼠真皮組織切成粘稠狀，用含2.5mg/ml一型膠原酶的dmem在37℃水浴中震蕩消化25min，然后加入dnase繼續(xù)消化5min，100um過濾器過濾，細胞懸液用含10%fbs的dmem中和，離心，沉淀用f12培養(yǎng)基洗一次，然后再用f12培養(yǎng)基重懸，細胞計數。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)中真皮和表皮細胞的混合比例為真皮：表皮=1-5：1。
作為優(yōu)選，所述步驟(4)中真皮和表皮細胞的混合比例為真皮：表皮=1-5：1。
作為優(yōu)選，所述步驟(6)中洞的大小在0.1-2mm之間，洞的數量根據洞的大小決定，洞與洞之間距離在0.5-1mm左右。
本發(fā)明的有益效果：
(1)操作簡單方便；
(2)創(chuàng)傷小，洞可大可小，靈活性好；
(3)毛囊形成效率高；
(4)可以注射的細胞數目范圍大；
(5)可以注射單細胞，也可用細胞團塊；
(6)可以形成正常的皮膚結構；
(7)符合美容要求，實際應用前景廣。
具體實施方式
為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施方式，進一步闡述本發(fā)明。
本具體實施方式采用以下技術方案：一種體內重建毛囊的方法，其步驟為：
(1)細胞分離：取出生1-3天的c57小鼠，剪去四肢和尾巴，用鑷子把整塊皮剝下，浸泡在含有2.5mg/ml解離酶的pbs中4℃孵育過夜，機械法將表皮細胞和真皮細胞分離。
①表皮細胞分離的步驟為：將c57乳鼠的表皮組織切成均勻的粘稠狀，置于含有0.025%胰酶的dpbs中，37℃水浴震蕩消化20-30分鐘，100um過濾器過濾，細胞懸液用含10%fbs的dmem中和，低速離心，沉淀用f12培養(yǎng)基洗一次，然后再用f12培養(yǎng)基重懸，細胞計數。
②真皮細胞分離的步驟為：用手術刀將乳鼠真皮組織切成粘稠狀，用含2.5mg/ml一型膠原酶的dmem在37℃水浴中震蕩消化25min，然后加入dnase繼續(xù)消化5min，100um過濾器過濾，細胞懸液用含10%fbs的dmem中和，離心，沉淀用f12培養(yǎng)基洗一次，然后再用f12培養(yǎng)基重懸，細胞計數。
(2)細胞培養(yǎng)：上步新鮮分離的細胞可以直接進行第五步細胞的移植前準備，也可按照以下方法培養(yǎng)擴增：
①表皮細胞培養(yǎng)：用含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸細胞，接種到事先用包被基質處理過的細胞培養(yǎng)瓶(細胞數大約在300萬-500萬每t75細胞培養(yǎng)瓶)中，培養(yǎng)三天，之后換成cnt07或其它表皮培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2天換液一次，顯微鏡下觀察細胞，待細胞長滿時進行傳代或后續(xù)研究，表皮按1：3傳代。
②真皮細胞培養(yǎng)：10%胎牛血清的dmem并帶有fgf生長因子的真皮培養(yǎng)基重懸細胞，接種在100mm細胞培養(yǎng)皿，每5天換一次液，細胞長滿后傳代或直接進行第3步，真皮按1：3-10倍傳代。
(3)細胞球培養(yǎng)：取分離或培養(yǎng)好的真皮和表皮細胞按一定比例混合(真皮：表皮=1-5：1)，重懸在含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem真皮培養(yǎng)基中，接種到不能貼壁的培養(yǎng)皿(6孔板)進行懸浮培養(yǎng)，在37度培養(yǎng)箱孵育16-24小時，形成細胞球狀。
(4)細胞團塊培養(yǎng)：取分離或培養(yǎng)好的真皮和表皮細胞按一定比例混合(真皮：表皮=1-5：1)，重懸在含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem真皮培養(yǎng)基中，接種到薄膜如硅膠膜上，在37度培養(yǎng)箱孵育2小時形成細胞團塊。
(5)移植前細胞準備：可以直接取步驟(1)中的新鮮分離的皮膚單細胞，或步驟(2)中的培養(yǎng)擴增的表皮和真皮細胞按一定比例混合的單細胞，或步驟(3)中的細胞球，又或步驟(4)中的細胞團塊，將其重懸在5-10ulf12培養(yǎng)液，細胞數可以控制在1000-100萬/ul的濃度進行移植。
(6)在裸鼠皮膚上打洞：將免疫缺陷小鼠(裸鼠)麻醉，用21g針頭或取皮器進行皮膚打洞，洞的大小在0.1-2mm之間，洞的數量根據洞的大小決定，洞與洞之間距離在0.5-1mm左右。
(7)細胞移植：將第5步準備好的細胞用移液管槍頭轉移到打好的洞內，轉移好所有細胞，蓋上硅膠膜，必要時可縫合皮膚與膜片，然后鋪一層凡士林紗布，包扎小鼠。
(8)觀察處理：及時觀察小鼠，7-10天去掉包扎，3周后可見毛發(fā)生長。
本具體實施方式通過先在皮膚上打洞，然后再把單細胞或細胞團塊用移液管或注射器打到洞內來達到重建毛囊的目的，該方法簡稱孔洞法，相比傳統(tǒng)的小室法、注射法和移植法，不僅操作簡便，創(chuàng)傷小，而且可以注射的細胞數目范圍大，可以形成正常的皮膚結構，毛囊形成效率高，符合現(xiàn)代美容要求，適合開發(fā)應用于臨床上或醫(yī)美上治療脫發(fā)疾病，具有廣闊的應用前景。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。