本發(fā)明涉及應(yīng)用生物技術(shù)原理人工培育真菌的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蛹蟲(chóng)草的培育，更具體地涉及一種蛹蟲(chóng)草液體菌種的培育方法和應(yīng)用及其使用的培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

蛹蟲(chóng)草（cordycepsmilitaris）隸屬于真菌界（fungi）、子囊菌門（ascomycota）、子囊菌綱（ascomycetes）、糞殼菌亞綱（sordariomycetidae）、肉座菌目（hypocreales）、麥角菌科（clavicipitaceae）、蟲(chóng)草屬（cordyceps）。蛹蟲(chóng)草是非常著名的藥食兩用的子囊真菌，也是獲得蟲(chóng)草素的主要來(lái)源，具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。近年來(lái)，隨著野生冬蟲(chóng)夏草資源的日漸枯竭，其價(jià)格不斷攀升，從而促使人們尋找野生冬蟲(chóng)夏草的替代品。由于蛹蟲(chóng)草具有與冬蟲(chóng)夏草相近的藥用與食用價(jià)值，加之蛹蟲(chóng)草更加容易馴化，因此受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。

但是，由于傳統(tǒng)工藝中液體配方的營(yíng)養(yǎng)不全面，導(dǎo)致蛹蟲(chóng)草發(fā)菌慢，菌絲較易老化，長(zhǎng)勢(shì)弱，菌絲體色澤較暗，子實(shí)體產(chǎn)量低。因此，我們對(duì)液體菌種的培養(yǎng)液配方、液體菌種的培育方法進(jìn)行了改良。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種蛹蟲(chóng)草液體菌種的培育方法，該方法包括：

將蛹蟲(chóng)草的純菌種接種到液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)得到液體菌種；

所述液體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計(jì)，包括：馬鈴薯9-10份，鮮蠶蛹9-10份的浸出液，葡萄糖0.8-1份，蛋白胨0.8-1份，酵母浸粉0.8-1份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，氫氧化鈉0.0005-0.0006份，水45-60份，維生素b10.01-0.02份；

所述水的重量份數(shù)包含蠶蛹浸出液中的水。

本發(fā)明通過(guò)液體菌種的特定配方并結(jié)合搖床培養(yǎng)，可良好保持菌種的遺傳特性，減少菌種在菌絲分解斷裂中出現(xiàn)的退化，保持菌種活力和發(fā)菌速度，促進(jìn)后續(xù)菌絲體的轉(zhuǎn)色，增加子實(shí)體產(chǎn)量。解決了蛹蟲(chóng)草菌種退化、發(fā)菌弱、后期轉(zhuǎn)色慢、子實(shí)體產(chǎn)量少等問(wèn)題。

進(jìn)一步，所述液體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計(jì)，包括：馬鈴薯9.5份，鮮蠶蛹9.5份的浸出液，葡萄糖0.95份，蛋白胨0.95份，酵母浸粉0.95份，磷酸二氫鉀0.095份，硫酸鎂0.048份，脫脂蠶蛹粉0.095份，氫氧化鈉0.00057份，水47份，維生素b10.014份；所述水的重量份數(shù)包含蠶蛹浸出液中的水。

進(jìn)一步，所述搖床培養(yǎng)的條件為：以200-250r/min搖床培養(yǎng)5-6天，培養(yǎng)溫度為20-22℃。

進(jìn)一步，所述蠶蛹浸出液為將鮮蠶蛹煮制25-35min后得到的蠶蛹過(guò)濾液。

進(jìn)一步，所述馬鈴薯的蛋白質(zhì)含量不低于3%，淀粉含量不低于13%，優(yōu)選13%-15%。

進(jìn)一步，所述蛋白胨的總氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%。

進(jìn)一步，所述脫脂蠶蛹粉的蛋白質(zhì)含量為60%-80%，脂肪含量為5%-8%。

本發(fā)明蛹蟲(chóng)草液體菌種的培育方法可廣泛用于蛹蟲(chóng)草的培育中，從而提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。

本發(fā)明還提供一種培育蛹蟲(chóng)草的方法，包括：將上述蛹蟲(chóng)草液體菌種的培育方法制備的液體菌種轉(zhuǎn)接至子實(shí)體培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

進(jìn)一步，將蠶蛹浸出液使用過(guò)的蠶蛹放入子實(shí)體培養(yǎng)基中。

本發(fā)明提供一種培育蛹蟲(chóng)草液體菌種的培養(yǎng)液，按照重量份數(shù)計(jì)，包括：馬鈴薯9-10份，鮮蠶蛹9-10份的浸出液，葡萄糖0.8-1份，蛋白胨0.8-1份，酵母浸粉0.8-1份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，氫氧化鈉0.0005-0.0006份，水45-60份，維生素b10.01-0.02份；所述水的重量份數(shù)包含蠶蛹浸出液中的水。

本發(fā)明上述的培養(yǎng)液可用于蛹蟲(chóng)草液體菌種的培育，使獲得的菌種不易退化，保持菌種活力和發(fā)菌速度，促進(jìn)后續(xù)菌絲體的轉(zhuǎn)色，增加子實(shí)體產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

在蛹蟲(chóng)草的液體菌種培育方法中，按照不同的配方進(jìn)行培養(yǎng)制作得到的菌種的退化程度和抵抗力不同。其將固體試管種轉(zhuǎn)接到液體搖床培養(yǎng)液中，通過(guò)有一段時(shí)間的培養(yǎng)得到搖床液體菌種，再將液體菌種再轉(zhuǎn)接到子實(shí)體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間見(jiàn)光，進(jìn)行子實(shí)體培養(yǎng)即可得到污染率低、高產(chǎn)的蟲(chóng)草子實(shí)體。通過(guò)不同的培養(yǎng)液培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草菌種的生長(zhǎng)特性和子實(shí)體產(chǎn)量有很大差別，通過(guò)本發(fā)明培養(yǎng)液配方制作的液體菌種使得菌種菌絲體多，菌種特性穩(wěn)定，能夠高效的繁殖和生長(zhǎng)。

本發(fā)明的實(shí)施例提供了一種采用特定配方的培養(yǎng)液進(jìn)行蛹蟲(chóng)草液體菌種培育的方法，包括配制液體培養(yǎng)基，然后在無(wú)菌環(huán)境下將固體試管菌種轉(zhuǎn)接到液體菌種中，再將液體菌種放置搖床上以250r/min搖制5-6天，避光培養(yǎng)溫度為20-22℃，再將搖制好的液體菌種轉(zhuǎn)接到子實(shí)體培養(yǎng)基上。

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但這些內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。其中未具體載明的操作方法依照本領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，使用的試劑、原料和菌種等均市售獲得。其中培養(yǎng)基的組分如無(wú)特別說(shuō)明，則購(gòu)自北京奧博星。

實(shí)施例

首先配制液體培養(yǎng)基，具體包括：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘?jiān)玫今R鈴薯浸出液。將活蠶蛹200g放入鍋中加入1200ml左右水進(jìn)行煮制，大約30分鐘后過(guò)濾得到蠶蛹浸出液。控制馬鈴薯浸出液和蠶蛹浸出液的液體總量為1000ml并混合到一起，然后分別加入葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸20g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、脫脂蠶蛹粉2g、氫氧化鈉0.012g、b10.3g，溶解攪拌均勻分裝在500l三角瓶中，每瓶大約裝取營(yíng)養(yǎng)液200l，封口時(shí)在瓶口位置放一塊2cm*2cm的無(wú)菌棉，以便為后期液體菌種增加氧氣。

將裝有液體的三角瓶放置于滅菌鍋中，0.12-0.18mpa下進(jìn)行蒸汽滅菌，溫度為118-121℃滅菌30分鐘，待壓力降到常壓時(shí)打開(kāi)鍋取出滅菌好的三角瓶營(yíng)養(yǎng)液，然后取出放涼備用。

將滅菌好的三角瓶放入超凈工作臺(tái)中，在紫外線燈下滅菌30-40min，然后在超凈工作臺(tái)中將固體試管種轉(zhuǎn)接到滅好的三角瓶中，再將三角瓶放到滅菌好的暗培室中，在搖床上以250r/min搖制6天，避光培養(yǎng)溫度為21℃，即可得到搖制好的液體菌種。

將液體菌種接到子實(shí)體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)菌轉(zhuǎn)色及子實(shí)體培養(yǎng)，40-55天得到子實(shí)體。

在本實(shí)施例中，液體培養(yǎng)基中添加了蠶蛹粉和蠶蛹浸出液可使菌種的遺傳性得以良好的保持，減少菌種在菌絲分解斷裂中出現(xiàn)的退化，使菌種保持最原始的狀態(tài)。蠶蛹浸出液中使用過(guò)的蠶蛹可以放入子實(shí)體培養(yǎng)基中，再接種液體菌種進(jìn)行子實(shí)體培養(yǎng)，這樣可避免浪費(fèi)。選擇色澤、品相比較單純的小麥或大米的子實(shí)體好，產(chǎn)量也相對(duì)高。

各培養(yǎng)基的原料經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選，如蠶蛹粉、蛋白胨、活體蠶蛹和馬鈴薯都要求質(zhì)量過(guò)關(guān)，為正規(guī)的生產(chǎn)廠家。其中，馬鈴薯的采購(gòu)相對(duì)要嚴(yán)格一些：要求無(wú)腐爛、無(wú)霉變、無(wú)發(fā)芽、無(wú)損傷、無(wú)綠變、完整無(wú)損傷的新鮮馬鈴薯，其蛋白質(zhì)含量為5%，淀粉含量為25%。蠶蛹選取當(dāng)季活體蠶蛹：新鮮、大小均勻、無(wú)傷、無(wú)異味，使用前已進(jìn)行清洗消毒。蛋白胨的總氮含量為18.5%，氨基酸含量為4.5%。脫脂蠶蛹粉的蛋白質(zhì)含量為75%，脂肪含量為7%。

對(duì)比例

按照實(shí)施例的步驟培育蛹蟲(chóng)草，所不同的是采用以下組成的液體培養(yǎng)基：20%馬鈴薯，2%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.09%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂，余量為水，其中馬鈴薯的處理與實(shí)施例相同。并且，將對(duì)比例的菌種搖床培養(yǎng)8天，以使其更充分發(fā)菌。

比較實(shí)施例與對(duì)比例的發(fā)菌和采收情況，結(jié)果如下：實(shí)施例搖床培養(yǎng)6天，對(duì)比例搖床培養(yǎng)8天，但實(shí)施例的菌球仍明顯比對(duì)比例的菌球更濃密、更均勻。比較轉(zhuǎn)色時(shí)間，實(shí)施例接種的后期需要4天轉(zhuǎn)色，而對(duì)比例接種的后期需要6天轉(zhuǎn)色。最后比較采收的產(chǎn)量，實(shí)施例的平均產(chǎn)量為300g/盒，對(duì)比例的平均產(chǎn)量為270g/盒。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的科技人員，本發(fā)明可以有更多的改變和變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)均包含在本發(fā)明之內(nèi)。