鴨rig-1多克隆抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和如SEQ ID NO:3所示的多肽以及利用這些多肽制備鴨RIG?1多克隆抗體的方法及所得多克隆抗體。本發(fā)明所得抗體可達到進行Western Blot檢測和免疫組化檢測的要求，可定性和定量檢測鴨組織中的RIG?1。
【專利說明】
鴨RIG-1多克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及鴨RIG-1多克隆抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然免疫系統(tǒng)是動物抵御病原入侵的第一道防線，模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs)是天然免疫系統(tǒng)的重要成分，在動物機體的抗病毒免疫反 應(yīng)中發(fā)揮重要作用。一系列模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)對病原 體的識別啟動了機體的抗病毒免疫機制。PRRs主要包括膜結(jié)合受體，如Toll樣受體(1'〇11_ 1 ike receptors，TLRs)，另一類是細胞內(nèi)模式識別受體，包括核苷酸寡聚化域樣受體 (nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)和維甲酉愛誘導(dǎo)基 因 I樣受體（the retinoic acid inducible gene-I-like receptors，RLRs)。維甲酸誘導(dǎo) 基因 l(RIG-l)是RLRs家族的重要成員，屬于胞內(nèi)識別受體，能有效地識別逃避細胞膜上 TLRs識別而入侵到細胞質(zhì)中的病毒RNA，通過信號通路級聯(lián)放大作用誘導(dǎo)細胞因子、趨化因 子和干擾素（11^6奸61'011，正1'〇等的產(chǎn)生 。
[0003] 從目前的研究來看，RIG-1可能是水禽類動物或鴿子能抵抗流感病毒的原因之一。 然而，現(xiàn)有的相關(guān)研究還不多。雖然有少量研究發(fā)現(xiàn)在一些物種上的RIG-1對于禽流感病毒 和法氏囊病病毒具有一些聯(lián)系，但由于缺乏相應(yīng)的對RIG-1天然蛋白的檢測手段，阻礙了進 一步的研究。
[0004] 因此，尋求一種能夠用于鴨組織RIG-1的定性和定量檢測的多克隆抗體，對于研究 鴨的抗病毒免疫系統(tǒng)及開發(fā)相應(yīng)醫(yī)藥用產(chǎn)品而言顯得極為迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的之一在于提供一種分離的多肽，該多肽的序 列如SEQ ID N0:1所示。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供提供一種分離的多肽，該多肽的序列如SEQ ID N0:2 所示。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供提供一種分離的多肽，該多肽的序列如SEQ ID N0:3 所示。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述任一多肽的多核苷酸序列。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備鴨RIG-1多克隆抗體的方法，該方法包括使 用上述任一種分離的多肽免疫哺乳動物。
[0010]如本發(fā)明的一個實施例所示，本發(fā)明所得的多克隆抗體可以用于Western Blot檢 測和免疫組化檢測，可以用于后續(xù)更為深入的研究和相應(yīng)產(chǎn)品的開發(fā)。
[0011]在一個具體實施例中，所述方法包括如下步驟：
[0012] (1)人工合成多肽，所述多肽的序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3 所示；
[0013] ⑵純化多肽；
[0014] (3)使用所得多肽免疫哺乳動物，并從哺乳動物中純化抗體，得到所述多克隆抗 體。
[0015] 值得指出的是，本發(fā)明對于人合成所述多肽的方法并無特別的限制。本發(fā)明實施 例中的合成方法僅僅提供其中的一種具體方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的基礎(chǔ)上， 對各步驟參數(shù)進行合理的調(diào)整。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的在于提供由上述方法制備得到的多克隆抗體。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：
[0018] 本發(fā)明所得抗體可達到進行Western Blot檢測和免疫組化檢測的要求，可定性和 定量檢測鴨組織中的RIG-1。
【附圖說明】
[0019] 圖1為血清Western Blot實驗和Block驗證實驗結(jié)果圖；
[0020]圖2為兔血清RIG-1多克隆抗體純化圖；
[0021]圖3為純化抗體蛋的Western Blot檢測結(jié)果；
[0022] 圖4為免疫組化實驗結(jié)果，其中，（1)圖A~D為1日齡法氏囊組織，B、D分別為A、C的 陰性對照，A、B放大倍數(shù)為200，C、D放大倍數(shù)為400;(2)圖E~Η為4周齡法氏囊組織，F(xiàn)、Η分別 為E、G的陰性對照，E、F放大倍數(shù)為200，G、H放大倍數(shù)為400; (3)圖I~J為4周齡脾臟組織，J、 L分別為I、K的陰性對照，I、J放大倍數(shù)為200，K、L放大倍數(shù)為400。
【具體實施方式】
[0023] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0024] 本發(fā)明的實施除非另外說明，將使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)、生物化學(xué)和免 疫學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻中有完整的解釋。參見，如《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe編）；《實驗免疫學(xué)手冊》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷（D·Μ.Weir和C·C·Blackwel1編，Blackwel1 Scientific Publ i cat ions); T · E · Creighton，《蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)和分子特性》（Proteins : Structures and Molecular properties)(ff.H.Freeman and Company，1993); A.L.Lehninger，《生物化學(xué)》（Biochemistry) (Worth Publishers，Inc ·最新版）；Sambrook 等，《分子克?。簩嶒炇沂謨浴罚∕olecular Cloning: a Laboratory Manual)，第二版，1989; 《酶學(xué)方法》（Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press， Inc.)〇
[0025] 實施例1
[0026] 多肽的合成
[0027] 設(shè)計并在體外合成3段多肽序列，分別為SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 1所示。
[0028] 具體步驟如下；
[0029] 1、樹脂的稱取:將稱取好的樹脂放入反應(yīng)柱里面，然后用DCM溶脹半個小時。DCM加 的量為樹脂高度的2~3倍，也就是把樹脂充分溶脹完全?？梢晕⒘抗臍?。
[0030] 2、去保護:先把DCM抽干，然后用DMF洗滌3遍，去除DCM，然后用20%六氫吡啶去保 護，5+10即共兩遍，第一遍5分鐘，第二遍10分鐘，中間用DMF洗滌一遍。
[0031] 3、去保護后洗滌:用DMF洗滌6遍。
[0032] 4、偶聯(lián):按照3倍量投氨基酸，如0.2mmol的樹脂，我們投氨基酸的量為0.2mmol*3 = 0.6mmol乘以其分子量就是要稱取的質(zhì)量。此外我們還要稱取激活劑。
[0033] 5、偶聯(lián)時檢測：用滴管取樹脂（少許，約15粒左右，只要檢測可以辨認即可)與小試 管中，分別滴加2滴A液、2滴B液、2滴C液，放到加熱3分鐘。然后取出來看樹脂是否透明，如溶 液顏色深影響觀察，可以倒掉溶液，加少許DMF洗凈，再觀察。若樹脂檢測透明，即可以偶聯(lián) 下一個氨基酸。若樹脂不透明，延長反應(yīng)時間，若還不透明，可以進行復(fù)投。一定要保證每一 步都反應(yīng)完全再偶聯(lián)下一個氨基酸。
[0034] 6、偶聯(lián)后洗滌:偶聯(lián)完畢后，DMF洗滌3遍。
[0035] 7、以上是偶聯(lián)一個氨基酸的步驟，接下來依稀依次類推，也就是重復(fù)第3步驟一一 第6步過程直到最后一個氨基酸偶聯(lián)完畢。
[0036] 8、最后一個氨基酸偶聯(lián)好后，再去保護，去保護完后收縮，DMF洗滌3遍，DCM3遍，甲 醇3遍，抽干肽樹脂。
[0037] 9、稱取完成的干肽樹脂，裝入15ml或50ml的離心管中，加入裂解液(每克10倍ml) 如：lg肽樹脂加 l〇ml的裂解液。反應(yīng)2個小時，每10~15分鐘搖蕩一下，讓其充分反應(yīng)，可放 入搖床中。溫度最好控制再25 °C左右。反應(yīng)好后，抽濾，溶液倒入冰乙醚中沉淀，然后離心， 離心時要平衡。一般離心3~4遍。
[0038] 10、抽干:把離心好后的肽先放通風櫥中吹一會，然后放入真空干燥器中抽干。 [0039] 11、取少量到樣品管中，進行質(zhì)譜檢測，正確多肽進行HPLC純化。
[0040] 實施例2
[0041] 將上述所得三條多肽分別免疫兩只兔子，11周后分別收集每只兔子的血清進行 ELISA檢測，具體實驗步驟如下：抗原先以lyg/mL的濃度包被，4°C包被過夜；然后加入1 % BSA，37°C 下孵育 1 小時；兔多抗血清分別以 1:200，1:1000，1:5000，1:10000，1: 20000，1: 60000,1:240000等稀釋度稀釋，稀釋后樣品以50yL/孔加樣，放在37°C下孵育1小時;然后用 TBST以200yL/孔洗滌2遍后，加入HRP標記的羊抗兔二抗，稀釋5000倍后使用;在37°C下孵育 45分鐘后，用TBST以200yLl/孔洗滌3遍;再以lOOyL/孔加入TMB顯色液，靜置5分鐘；最后使 用酶標儀測定〇D450nm讀書并記錄數(shù)據(jù)。
[0042]通過ELISA檢測各多肽免疫兔子產(chǎn)生可能目的蛋白的相對濃度，詳細數(shù)據(jù)如表1所 不。
[0043]表 1
[0044]
[0046] 實施例3
[0047] Western Blot檢測與Block驗證
[0048] 使用各兔子血清，應(yīng)用Western Blot方法分別檢測鴨法氏囊(F)、脾臟(P)組織中 RIG-1蛋白，實驗步驟如下：使用4%的濃縮膠和8%的分離膠，上樣后先150V電壓至樣品跑 平，然后調(diào)小電壓到80V，以裂解液中的指示劑溴酚藍跑出玻璃板的下沿時停止電泳;取出 凝膠進行轉(zhuǎn)膜，條件為75V、90min;然后將各血清用脫脂奶粉稀釋200倍后，加入適量于膜 上，室溫孵育2小時;使用TBST洗滌5次，每次10分鐘；加入適量稀釋5000倍后的HRP標記羊抗 兔二抗，放入室溫孵育1小時;使用TBST洗滌5次，每次10分鐘;最后膜于暗室中化學(xué)發(fā)光檢 測試劑(ECL)反應(yīng)3分鐘后放入已經(jīng)鋪好保鮮膜的暗盒中，包好PVDF膜，暗室中用柯達X膠片 曝光1分鐘。
[0049] 血清Block檢測驗證反映呈陽性的條帶極為目的蛋白，具體步驟和Western Blot 實驗大體一致，只將加入一抗那一步改為：設(shè)置正常檢測組與Block檢測組，在正常檢測組 中加入lml 5%脫脂奶粉與2μ1血清;在Block檢測組中加入950μ1 5%脫脂奶粉，50μ1該項 目多肽（多肽濃度為lmg/mL)與2ul血清。此時不要馬上加入膜，讓多肽與血清先反應(yīng)結(jié)合1 小時，再加入膜反應(yīng)1小時。
[0050]分離6只兔子血清，分別用第4周鴨子脾臟和法氏囊組織蛋白樣品進行Western Blot實驗，結(jié)果顯示只有編號5427兔子的血清在脾臟組織蛋白中的陽性蛋白條帶與預(yù)測 RIG-1 蛋白大小相近（106KD，http: //web · expasy · org/protparam/ )，具體結(jié)果如圖 1A 顯示。 然后使用5427兔的血清在脾臟組織蛋白中進行Block實驗，結(jié)果顯示目的蛋白條帶符合 RIG-1目的蛋白大小；陰性對照（圖1B左）中相對于陽性對照（圖1B右）中的相同位置沒有蛋 白條帶，說明目的條帶不是假陽性。
[0051 ] 實施例4
[0052] 將制作好的親和層析柱依次用20mL純水和1 xroS(pH7.4)，流速70mL/h充分清洗； 然后將純化的血清10mL置于50mL離心管中，用孔徑0.45μπι，直徑25mm微孔濾膜抽濾;將抽濾 過的血清樣品以40mL/h流速上樣，重復(fù)一次；用20mL 1 X roS(pH7.4)以70mL/h的流速清洗 柱子，清洗過程中調(diào)節(jié)儀器透光率(T檔)示數(shù)為100, 10min后連接蛋白檢測儀。調(diào)節(jié)蛋白檢 測儀吸光率(1A檔)示數(shù)為0，此時打開電腦桌面的HD-A電腦采集器，并將滿屏量程調(diào)到5，用 甘氨酸溶液(pH 2.7，0.2M)以40mL/h的速度洗脫抗體，此時按下綠色的洗脫記錄按鈕開始 洗脫，當儀器的示數(shù)開始升高時開始收集抗體。并在抗體收集過程中以1M的碳酸氫鈉及時 調(diào)節(jié)抗體的pH值至7左右，并記錄洗脫峰的最高峰值;抗體收集完后，調(diào)節(jié)pH值至7左右，并 記錄洗脫的抗體體積，之后用純凈水沖洗連接收集器的橡膠管;依次用20mL 1 X PBS和純水 以70mL/h的速度清洗親和層析柱，之后加入20 %乙醇，封口，4°C冰箱保存。
[0053] 如圖2所示，抗體純化峰圖為單峰，表明純化得到蛋白為單一抗體蛋白，純度較高， 符合要求。
[0054] 實施例5
[0055] 純化抗體用于鴨多種組織中RIG-1天然蛋白的檢測
[0056] 1、ELISA檢測純化抗體蛋白，確定蛋白相對濃度
[0057] 結(jié)果顯示純化抗體蛋白試劑中IgG濃度為0.36mg/mL，稀釋比例為1:10000時，檢測 值為0.873,符合要求。
[0058] 表3純化抗體Elisa檢測結(jié)果
[0059]
[0061] 2、純化抗體蛋白分別用于法氏囊和脾臟組織蛋白樣品的Western Blot實驗驗證
[0062] 如圖3所示使用純化抗體蛋白，在第4周鴨脾臟和法氏囊組織蛋白樣品中均有陽性 目的條帶，說明純化抗體可以適用于Western Blot檢測。
[0063] 3、純化抗體蛋白分別用于第1周和第4周的鴨法氏囊和第4周的脾臟蛋白樣品的免 疫組化實驗驗證，具體步驟如下:組織樣品被包埋成石蠟塊后被切成石蠟切片;石蠟切片完 全烘干后進行脫蠟，然后放入0.3%過氧化氫甲醇溶液，室溫避光孵育10分鐘;將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次3分鐘；再將切片用EDTA緩沖液進行抗原修 復(fù)，100 °C20分鐘;然后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次3分鐘；切 片稍甩干后，純化蛋白抗體用1%BSA稀釋50倍后滴加于切片，放在濕室內(nèi)室溫孵育1小時； 切片稍甩干后再圈內(nèi)滴加組化試劑盒內(nèi)反應(yīng)增強液，室溫孵育10分鐘；切片稍甩干后滴加 組化試劑盒內(nèi)酶標羊抗兔IgG聚合物覆蓋組織，室溫孵育30分鐘;PBS洗滌3次，每次3分鐘， 切片稍甩干后滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水 沖洗切片終止顯色;蘇木素復(fù)染4分鐘左右，自來水洗，促藍液促藍lmin，自來水沖洗;最后 進行脫水，然后用中性樹脂封片。
[0064] 如圖4所示，在第1日齡、4周齡法氏囊組織和第4周齡脾臟中，用純化抗體可以檢測 到RIG-1表達，呈黃褐色，而在其對應(yīng)的陰性對照當中沒有顯示黃褐色，說明純化抗體可以 適用于免疫組化。
[0065]
[0066]
[0067]
[0069
【主權(quán)項】
1. 一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -種分離的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID N0:2所示。3. -種分離的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID N0:3所示。4. 分離的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列編碼權(quán)利要求1-3任一項所述 的多肽。5. -種制備鴨RIG-1多克隆抗體的方法，其特征在于，所述方法包括使用權(quán)利要求1-3 任一項所述分離的多肽免疫哺乳動物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 人工合成多肽，所述多肽的序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3所示； (2) 純化多肽； (3) 使用所得多肽免疫哺乳動物，并從哺乳動物中純化抗體，得到所述多克隆抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述方法制備得到的多克隆抗體。
【文檔編號】C07K16/28GK106008696SQ201610519562
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月4日
【發(fā)明人】劉賀賀, 羅俊, 張濤, 王繼文, 李亮, 韓春春, 甘心夢
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)