本專利申請(qǐng)要求2014年7月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/026,135的優(yōu)先權(quán)，所述文獻(xiàn)全文以引用方式并入。
技術(shù)領(lǐng)域：
本
技術(shù)領(lǐng)域：
涉及基于核酸序列的存在的檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌血清型的方法，優(yōu)選基于PCR的檢測(cè)方法，以及涉及因此有用的寡核苷酸分子和試劑以及試劑盒。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)魏思?xì)胞增多性李斯特菌是與即食型食品(例如奶酪和熟肉制品)以及加工食品(例如熱狗)相關(guān)的食源性疾病爆發(fā)的致病原。單核細(xì)胞增多性李斯特菌也是通常不與單核細(xì)胞增多性李斯特菌污染相關(guān)的甜瓜及其它食品有關(guān)的食源性疾病爆發(fā)的原因。李斯特菌病對(duì)于老年人和兒童可以極為致命，其死亡率高達(dá)40％。孕婦也易受所產(chǎn)生感染的影響，從而導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)或胎兒疾病。單核細(xì)胞增多性李斯特菌及其它李斯特氏菌屬菌種是在有利于其持久生存的各種場(chǎng)所中常見的環(huán)境細(xì)菌。各種食品生產(chǎn)設(shè)施可提供能允許李斯特氏菌屬菌種(包括單核細(xì)胞增多性李斯特菌)復(fù)制以及配料原料或食品制成品的可能污染的有利環(huán)境。李斯特氏菌屬的許多菌種能夠在冷藏溫度下存活并且繼續(xù)生長(zhǎng)且數(shù)量增加。在相同的環(huán)境中可存在多個(gè)李斯特氏菌屬的菌種。用于檢測(cè)食品或食品制備環(huán)境中李斯特氏菌屬菌種的典型微生物學(xué)方法在篩選測(cè)定開始后可需要至多五天。在等待篩選測(cè)定結(jié)果時(shí)，產(chǎn)品的生產(chǎn)者或銷售商必須以相當(dāng)可觀的費(fèi)用儲(chǔ)存食品。在對(duì)李斯特氏菌屬的存在的后續(xù)測(cè)試呈陽性的環(huán)境中制備的食物可能需要在裝運(yùn)之前就測(cè)定單核細(xì)胞增多性李斯特菌的存在或所報(bào)廢庫存的虧損。因此，需要一種短時(shí)間出結(jié)果，準(zhǔn)確度高，以及非常容易使用的檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌的檢定。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：一個(gè)方面是用于檢測(cè)樣品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的存在的方法，所述樣品包含核酸，所述方法包括：(a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含合適的引物對(duì)，該合適的引物對(duì)用于擴(kuò)增單核細(xì)胞增多性李斯特菌的編碼肌醇單酮異構(gòu)酶的基因(例如，loll)的至少一部分，(b)使用步驟(a)的反應(yīng)混合物進(jìn)行所述樣品的所述核酸的PCR擴(kuò)增；以及(c)檢測(cè)步驟(b)的擴(kuò)增，從而擴(kuò)增的陽性檢出表明了樣品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的存在。另一個(gè)方面是一種引物，該引物包括基于BLASTN比對(duì)方法與如SEQIDNO：2、3、4、5、6、7、8、9和10所示的多核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。另一個(gè)方面是一種引物，該引物包括基于BLASTN比對(duì)方法與如SEQIDNO：2、3、4、5、6、7、8、9和10所示的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。另一個(gè)方面是Scorpion探針，該Scorpion探針包括基于BLASTN比對(duì)方法與如SEQIDNO：11、12、13、14、15和16所示的多核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。另一個(gè)方面是Scorpion探針，該Scorpion探針包括基于BLASTN比對(duì)方法與如SEQIDNO：11、12、13、14、15和16所示的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。另一個(gè)方面是單核細(xì)胞增多性李斯特菌檢測(cè)序列，該檢測(cè)序列包括基于BLASTN比對(duì)方法與如SEQIDNO：11、12、13、14、15和16所示的多核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。另一個(gè)方面是單核細(xì)胞增多性李斯特菌屬檢測(cè)序列，該檢測(cè)序列包括基于BLASTN比對(duì)方法與如SEQIDNO：11、12、13、14、15和16所示的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。另一個(gè)方面是用于進(jìn)行PCR的復(fù)制組合物，其包含：(a)選自下列的一組引物對(duì)：SEQIDNO2、7和11；SEQIDNO2和7；SEQIDNO2和11；SEQIDNO3、5和11；SEQIDNO3和5；SEQIDNO3和11；SEQIDNO4、5和11；SEQIDNO4和5；SEQIDNO4和11；SEQIDNO5、6和11；SEQIDNO5和6；SEQIDNO6和11；SEQIDNO5、8和11；SEQIDNO5和8；SEQIDNO8和11；SEQIDNO5、8和12；SEQIDNO5和12；SEQIDNO5、6和13；SEQIDNO5和13；SEQIDNO9、10和14；SEQIDNO9和10；SEQIDNO10和14；SEQIDNO5、8和15；SEQIDNO5和15；SEQIDNO5、8和16；以及SEQIDNO5和16(以下第052段的表1中所列的任意引物-探針-引物、引物-探針、或引物-引物配對(duì))，和(b)至少一種DNA聚合酶。至少一種DNA聚合酶可為熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。另一個(gè)方面是用于檢測(cè)樣品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌(包括所有血清型)的試劑盒，該試劑盒包含前述復(fù)制組合物，其中試劑盒包含選自SEQIDNO：2和7；SEQIDNO：3和5；SEQIDNO：4和5；SEQIDNO：5和6；SEQIDNO：5和8；和SEQIDNO：9和10中的一種或多種引物對(duì)以及Scorpion探針SEQIDNO：11、12、13、14、15或16(如表1所示)。參見下文的詳述，其它優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將變得顯而易見。序列說明序列符合37C.F.R.§§1.821-1.825(“對(duì)含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請(qǐng)的要求-序列規(guī)則”)，并且與世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(規(guī)則5.2和49.5(a-bis)，以及行政指導(dǎo)的208節(jié)和附錄C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的規(guī)定。SEQIDNO：1是單核細(xì)胞增多性李斯特菌的靶基因序列(推定的loll肌醇單酮異構(gòu)酶基因)。以下為SEQIDNO：1的序列表ATGACAAATGCAAATGGCAATCTAAAAAAATGCCCCATCACGATTAGCTCTTACACACTAGGAACGGAGGTATCTTTTCCTAAACGAGTGAAAGTCGCTGCGGAAAATGGTTTTGACGGAATTGGCTTGCGTGCAGAAAATTATGTAGATGCACTAGCTGCCGGATTAACCGATGAAGACATGTTGCGGATTTTAGACGAGCATAACATGAAAGTAACAGAAGTGGAGTACATAACCCAGTGGGGAACTGCCGAAGATCGTACAGCAGAACAACAAAAGAAAGAGCAAACAACTTTCCACATGGCGCGATTATTTGGCGTCAAACATATTAATTGTGGTTTGCTTGAAAAAATCCCTGAGGAACAAATCATTGTCGCGCTTGGTGAATTATGTGACCGCGCAGAAGAATTAATTATTGGTTTAGAATTTATGCCATATAGCGGTGTAGCAGACTTACAAGCAGCTTGGCGAGTAGCAGAAGCATGCGGACGAGATAACGCGCAACTTATTTGTGACACATGGCACTGGGCTAGAGCAAATCAAACAGCTGAATCTATCAAAAATGTTCCCGCTGATCGGATTGTTTCTATCCAACTATGCGATGTCCACGAAACACCTTACAAAGAACTTCGTGAAGAATCACTTCATGATCGTTTAGCTCCTGGAGAAGGATACGGAGATACGGTCGGTTTTGCAAAAATTTTAAAAGAGCATGGTGTAAATCCACGTGTGATGGGAGTTGAAGTTATTTCAGACTCTATGGTAGCAACTGGTTTAGAGTATGCCGCTCTTAAAGTATACAATGCCACGAAAAAAGTATTAGACGAAGCATGGCCAGAGATTTCTCCACGCTAASEQIDNO：2、3、4、5、6、7、8、9和10是用于檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌血清型的引物序列。SEQIDNO：11、12、13、14、15和16是用于檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌血清型的Scorpion探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針用熒光染料進(jìn)行5′端標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO：11、12、13、14、15和16的3’末端由以上所列引物中的一者(例如SEQIDNO：5)、合適的接頭部分(例如由6個(gè)聚乙二醇單元組成的間隔區(qū))和淬滅劑染料構(gòu)成。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明申請(qǐng)人特別地將所有引用的參考文獻(xiàn)的完整內(nèi)容引入本公開中。此外，當(dāng)量、濃度或其它值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選范圍或優(yōu)選上限數(shù)值和優(yōu)選下限數(shù)值的列表形式給出時(shí)，其應(yīng)被理解為具體地公開由任何范圍上限或優(yōu)選數(shù)值和任何范圍下限或優(yōu)選數(shù)值中的任何一對(duì)所構(gòu)成的所有范圍，而不管這些范圍是否被單獨(dú)地公開。凡在本文中給出某一數(shù)值范圍之處，該范圍均旨在包含其端點(diǎn)以及在該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)，除非另行指出。不旨在將本發(fā)明的范圍限制為限定范圍時(shí)所列舉的具體數(shù)值。定義在本公開中，使用了大量術(shù)語和縮寫。給出了如下定義。如本文所用，術(shù)語“約”或“大約”表示在給定值或范圍的20％內(nèi)，優(yōu)選地在10％內(nèi)，還更優(yōu)選地在5％內(nèi)。術(shù)語“包括”意在包括由術(shù)語“基本由......組成”和“由......組成”所涵蓋的實(shí)施方案。類似地，術(shù)語“基本由......組成”包含旨在包括術(shù)語“由......組成”所涵蓋的實(shí)施方案。術(shù)語“單核細(xì)胞增多性李斯特菌IoII基因”或“IoII”是指編碼肌醇單酮異構(gòu)酶蛋白的家族成員的單核細(xì)胞增多性李斯特菌血清型的基因組的區(qū)域。出于參考，肌醇單酮異構(gòu)酶的基因序列(IoII)用作本文的實(shí)施例，但可類似地考慮肌醇單酮異構(gòu)酶蛋白家族中的其它基因。登記為GenBank：HG421741.1(范圍為2326424至2327278)的核苷酸序列是各個(gè)菌種的單核細(xì)胞增多性李斯特菌肌醇單酮異構(gòu)酶蛋白的高度保守的基因序列的示例?！熬酆厦告湻磻?yīng)”縮寫為“PCR”。術(shù)語“分離的”指如下物質(zhì)，例如核酸分子和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含或者去除了在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質(zhì)或與該物質(zhì)反應(yīng)的組分。分離的多核苷酸可從它們天然存在的宿主細(xì)胞中純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲取分離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。術(shù)語“核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”在本文中可互換使用。這些術(shù)語涵蓋核苷酸序列等。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它們可以是單鏈或雙鏈，任選地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸堿基。多核苷酸還可由在一個(gè)核苷酸序列的3’端經(jīng)由接頭例如3碳或6碳(分別為丙二醇或己二醇)部分，或者3個(gè)或6個(gè)聚乙二醇亞基(分別為三甘醇或六甘醇)的連接臂連接至另一個(gè)核苷酸序列的5’端的核苷酸序列組成。本領(lǐng)域中已知的任何合適的接頭或間隔區(qū)將用于本專利申請(qǐng)。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因組DNA、合成DNA或它們的混合物的一條或多條鏈構(gòu)成。術(shù)語“擴(kuò)增產(chǎn)物”指在引物引導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)期間產(chǎn)生的核酸片段。引物引導(dǎo)的擴(kuò)增的典型方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，或鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)(SDA)。如果選擇PCR方法，則復(fù)制組合物可包含用于核酸復(fù)制的組分，例如：核苷三磷酸、兩種(或更多種)具有合適序列的引物、熱穩(wěn)定性聚合酶、緩沖劑、溶質(zhì)和蛋白質(zhì)。這些試劑及其用于擴(kuò)增核酸的詳細(xì)描述的過程提供于美國(guó)專利4,683,202和4,683,195中，這些專利均以引用方式并入本文。如果選擇LCR方法，則核酸復(fù)制組合物可包含例如：熱穩(wěn)定性連接酶(例如，水生棲熱菌(Thermusaquaticus)連接酶)，兩組鄰近的寡核苷酸(其中每組的一個(gè)成員與每個(gè)所述靶鏈互補(bǔ))，Tris-HCl緩沖液，KCl，EDTA，NAD，二硫蘇糖醇，以及鮭精DNA。參見，例如，Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：1074-78(1985)。術(shù)語“引物”指(合成的或天然存在的)寡核苷酸，當(dāng)被置于其中通過聚合酶催化互補(bǔ)鏈合成的條件下時(shí)，它能夠作為沿互補(bǔ)鏈進(jìn)行核酸合成或復(fù)制的起始點(diǎn)。引物還能包含可檢測(cè)的標(biāo)記，例如5’末端標(biāo)記。術(shù)語“探針”是指(合成的或天然存在的)寡核苷酸，其與所關(guān)注的多核苷酸互補(bǔ)(但不一定完全互補(bǔ))并且通過與所關(guān)注的多核苷酸的至少一條鏈雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。探針或引物-探針復(fù)合物還可包含可檢測(cè)的標(biāo)記。探針與引物復(fù)合或者以其它方式與引物連接，例如其中探針經(jīng)由其3’末端通過接頭連接至引物的5’末端，所述接頭可為核苷酸或非核苷酸接頭并且其可為不可擴(kuò)增的接頭(阻斷劑)，例如3碳或6碳(分別為丙二醇或己二醇)部分，或者3個(gè)或6個(gè)聚乙二醇亞基(分別為三甘醇或六甘醇)的連接臂。在這種情況下，這將稱為“引物-探針復(fù)合物”。此類引物-探針復(fù)合物的一個(gè)示例可見于美國(guó)專利6,326,145(全文以引用方式并入本文)，其在很多情況下被稱為“Scorpion探針”或“Scorpion引物”。如本文所用，術(shù)語“標(biāo)記”和“可檢測(cè)的標(biāo)記”是指能夠檢測(cè)包括但不限于放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶、酶底物、酶的輔助因子、酶抑制子、發(fā)色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶膠、半導(dǎo)體納米晶體、配體(例如，生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或半抗原)等的分子?？蓹z測(cè)的標(biāo)記還可包括報(bào)告基因和淬滅劑與探針的組合。術(shù)語“報(bào)告基因”是指物質(zhì)或其一部分，其能夠表現(xiàn)出可檢測(cè)的信號(hào)，其信號(hào)能被淬滅劑抑制。所述報(bào)告基因的可檢測(cè)的信號(hào)為例如在可檢測(cè)范圍內(nèi)的熒光。術(shù)語“淬滅劑”是指物質(zhì)或其一部分，其能夠抑制(suppressing)、降低、抑制(inhibiting)等由所述報(bào)告基因產(chǎn)生的可檢測(cè)的信號(hào)。如本文所用，術(shù)語“淬滅”和“熒光能量傳遞”是指如下過程，即，當(dāng)報(bào)告基因和淬滅劑密切接近時(shí)，并且所述報(bào)告基因被能量源激發(fā)，所述激發(fā)態(tài)的能量的主要部分非輻射性地轉(zhuǎn)移至所述淬滅劑，其中它非輻射性地耗散或者以不同于所述報(bào)告基因的發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射。優(yōu)選地，所述報(bào)告基因可選自用適宜的連接基團(tuán)修飾的熒光有機(jī)染料，以連接至所述寡核苷酸，諸如連接至末端3′碳或末端5′碳。所述淬滅劑也可選自有機(jī)染料，取決于本發(fā)明的實(shí)施方案，所述有機(jī)染料可以為熒光的，也可以不是熒光的。一般來講，如果所述淬滅劑是熒光的或只是通過非輻射衰減從所述報(bào)告基因釋放被轉(zhuǎn)移的能量，所述淬滅劑的吸收帶會(huì)至少基本上覆蓋所述報(bào)告基因的熒光射線帶以優(yōu)化淬滅。非熒光淬滅劑或暗淬滅劑通常通過從被激發(fā)的報(bào)告基因吸收能量起作用，但不放射性地釋放所述能量。對(duì)于特定探針的適宜的報(bào)告基因-淬滅劑對(duì)的選擇可根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行。在例如Berlman的HandbookofFluorescenceSpectraofAromaticMolecules，第二版，AcademicPress，NewYork，1971中列出并描述了可選擇的來自示例性報(bào)告基因-淬滅劑對(duì)的熒光和暗淬滅劑以及它們相關(guān)的光學(xué)性能，其內(nèi)容以引用的方式并入本文。在例如Haugland的HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals，MolecularProbesofEugene，Oreg.，1992中可找到經(jīng)由常見的反應(yīng)性基團(tuán)(能添加至本發(fā)明的寡核苷酸)用于共價(jià)連接的經(jīng)修飾報(bào)告基因和淬滅劑的示例，其內(nèi)容以引用方式并入本文。優(yōu)選的報(bào)告基因-淬滅劑對(duì)可選自呫噸類染料，包括熒光素和羅丹明染料。這些化合物的多個(gè)適宜形式可商購獲得，所述化合物的苯基上具有取代基，其可被用作結(jié)合位點(diǎn)或作為連接至寡核苷酸的結(jié)合官能團(tuán)。另一個(gè)用作報(bào)告基因的優(yōu)選的熒光化合物基團(tuán)是萘胺，其在α-或β-位點(diǎn)具有氨基。包含在此類萘胺化合物中的有1-二甲基氨萘基-5磺酸、1-苯胺基-8-萘磺酸和2-對(duì)甲苯胺基-6-萘磺酸。其它染料包括3-苯基-7-香豆素異氰酸酯；吖啶，例如9-異硫氰酸酯吖啶；N-(對(duì)-(2-苯并噁唑基)苯基)馬來酰亞胺；苯并二唑；二苯乙烯；芘等。最優(yōu)選地，所述報(bào)告基因和淬滅劑選自熒光素和羅丹明染料。連接至寡核苷酸的這些染料和適當(dāng)?shù)倪B接方法為本領(lǐng)域所熟知。淬滅劑的適宜的示例可選自6-羧基-四甲基-羅丹明、4-(4-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABYL)、四甲基羅丹明(TAMRA)、BHQ-0TM、BHQ-1TM、BHQ-2TM、以及BHQ-3TM，其中每個(gè)購自LGCBiosearchTechnologies，Inc.ofNovato，Calif.，QSY-7TM、QSY-9TM、QSY-21TM和QSY-35TM，其中每個(gè)購自MolecularProbes，Inc.等。報(bào)告基因的適宜的示例可選自染料諸如SYBR綠、5-羧基熒光素(5-FAMTM購自AppliedBiosystemsofFosterCity，Calif.)、6-羧基熒光素(6-FAM)，四氯-6-羧基熒光素(TET)、2，7-二甲氧基-4，5-二氯-6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素(HEX)、6-羧基-2′，4，7，7′-四氯熒光素(6-TETTM購自AppliedBiosystems)、羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素(6-JOETM購自AppliedBiosystems)、VICTM染料產(chǎn)品(購自MolecularProbes，Inc.)、NEDTM染料產(chǎn)品(購自AppliedBiosystems)、Cal染料產(chǎn)品(例如Cal金540、橙560、紅590、紅610、紅635，購自LGCBiosearchTechnologies)、Quasar染料產(chǎn)品(例如Quasar570、670、705，購自LGCBiosearchTechnologies)等。包含報(bào)告基因和淬滅劑的探針的一個(gè)示例是處于單分子或雙分子構(gòu)象的Scorpion探針。在單分子Scorpion中，所述引物-探針復(fù)合物的探針部分側(cè)翼為自身互補(bǔ)區(qū)，當(dāng)所述探針從其靶DNA解綁時(shí)所述自身互補(bǔ)區(qū)使得所述探針形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。另外，在單分子Scorpion中，報(bào)告基因通常連接在或靠近所述自身互補(bǔ)區(qū)中的一個(gè)，諸如在所述Scorpion探針的5′末端處，而淬滅劑連接在或靠近另一個(gè)所述自身互補(bǔ)區(qū)，諸如在互補(bǔ)序列的3′端并鄰近非擴(kuò)增接頭，使得當(dāng)所述探針處于其莖-環(huán)構(gòu)象時(shí)所述淬滅劑足夠靠近所述報(bào)告基因以導(dǎo)致淬滅。在雙分子Scorpion中，通常不采用自身互補(bǔ)側(cè)翼區(qū)，而是采用分離的“阻斷寡核苷酸”結(jié)合所述Scorpion探針。當(dāng)所述探針從其靶DNA解綁時(shí)，這個(gè)阻斷寡核苷酸能雜交至所述Scorpion探針的探針區(qū)。另外，在雙分子Scorpion中，所述報(bào)告基因通常連接到所述Scorpion探針的探針區(qū)，諸如所述Scorpion探針的5’末端，而所述淬滅劑連接至所述阻斷寡核苷酸，諸如所述阻斷寡核苷酸的3′末端，使得當(dāng)所述探針從其靶DNA解綁并且相反雜交至所述阻斷寡核苷酸時(shí)，所述淬滅劑足夠接近所述報(bào)告基因以導(dǎo)致淬滅。包含報(bào)告基因和淬滅劑的探針的另一個(gè)示例是在5′-核酸外切酶測(cè)定(諸如實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù))中使用的探針。在此上下文中，所述寡核苷酸探針鄰近其5′端將具有足夠數(shù)量的磷酸二酯鍵使得所用的5′至3′核酸酶活性能高效地降解所述綁定探針以分離所述報(bào)告基因和淬滅劑。包含報(bào)告基因和淬滅劑的探針的另一個(gè)示例是MolecularBeacon型探針，其包含探針區(qū)，側(cè)翼具有自身互補(bǔ)區(qū)，所述自身互補(bǔ)區(qū)使得所述探針從所述探針的靶序列解綁時(shí)形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。此類探針通常具有連接至或靠近一側(cè)末端的報(bào)告基因和連接或靠近另一側(cè)末端的淬滅劑，使得當(dāng)所述探針處于其解綁狀態(tài)并且從而形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，所述淬滅劑足夠接近所述報(bào)告基因以導(dǎo)致淬滅。術(shù)語“復(fù)制抑制部分”是指任何連接至寡核苷酸的3′末端羥基的原子、分子或化學(xué)基團(tuán)，其將阻止核酸鏈復(fù)制的鏈延伸的引發(fā)。示例包括但不限于：3′-脫氧核苷酸(例如，蟲草素)，雙脫氧核苷酸，磷酸酯，配體(例如，生物素和二硝基苯酚)，報(bào)告基因分子(例如，熒光素和羅丹明)，碳鏈(例如，丙醇)，錯(cuò)配的核苷酸或多核苷酸，或肽核酸單位。術(shù)語“非參與”是指對(duì)于核酸分子的擴(kuò)增反應(yīng)缺乏探針或引物的參與。具體地非參與探針或引物是將不作為底物或被DNA或RNA聚合酶延伸的探針或引物。“非參與探針”本質(zhì)上不能通過聚合酶延伸鏈。它可以有或沒有復(fù)制抑制部分。當(dāng)所述核酸分子的單鏈形式能夠在合適的溫度和溶液離子濃度條件下對(duì)其它核酸分子退火時(shí)，核酸分子對(duì)另一個(gè)核酸分子如cDNA、基因組DNA、或RNA來說是“可雜交的”。雜交和洗滌條件為人們所熟知，示例參見例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)，尤其是在該文獻(xiàn)第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)中進(jìn)行例示。溫度和離子強(qiáng)度的條件確定了雜交的“嚴(yán)格性”。對(duì)于同源核酸初步篩選，低嚴(yán)格性雜交條件對(duì)應(yīng)于Tm為55℃，可使用例如5×δSSC，0.1％SDS，0.25％牛奶，并且無甲酰胺；或者30％甲酰胺，5×δSSC，0.5％SDS。中度嚴(yán)格性雜交條件對(duì)應(yīng)于更高的Tm，例如，40％甲酰胺，和5×δ或6×δSSC。雜交需要兩種核酸含有互補(bǔ)序列，但取決于雜交的嚴(yán)格性，堿基之間可能會(huì)發(fā)生錯(cuò)配。用于使核酸雜交的合適的嚴(yán)格度取決于核酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)的程度，它們是本領(lǐng)域熟知的變量。兩個(gè)核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的雜交體的Tm值就越大。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(對(duì)應(yīng)較高的Tm)按以下順序降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就長(zhǎng)度大于100個(gè)核苷酸的雜交體而言，已經(jīng)獲得了計(jì)算Tm的公式(參見Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。對(duì)于較短核酸(即寡核苷酸)的雜交，錯(cuò)配的位置變得更為重要，并且寡核苷酸的長(zhǎng)度確定其特異性(參見Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可雜交核酸的長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核苷酸。更優(yōu)選地，可雜交核酸的最小長(zhǎng)度為至少約11個(gè)核苷酸，至少約12個(gè)核苷酸，至少約13個(gè)核苷酸，至少約14個(gè)核苷酸，至少約15個(gè)核苷酸，至少約16個(gè)核苷酸，至少約17個(gè)核苷酸，至少約18個(gè)核苷酸，至少約19個(gè)核苷酸，至少約20個(gè)核苷酸，至少約21個(gè)核苷酸，至少約22個(gè)核苷酸，至少約23個(gè)核苷酸，至少約24個(gè)核苷酸，至少約25個(gè)核苷酸，至少約26個(gè)核苷酸，至少約27個(gè)核苷酸，至少約28個(gè)核苷酸，至少約29個(gè)核苷酸，或者最優(yōu)選地，至少30個(gè)核苷酸。此外，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可根據(jù)需要根據(jù)諸如探針長(zhǎng)度的因素來調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液鹽濃度。本文所用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，并且描述于例如Sambrook等人(同上)；和Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，由GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版(1987)?；蚪M檢測(cè)區(qū)域申請(qǐng)人通過利用基于推定的IolI基因的鑒定而發(fā)展的單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌種檢測(cè)法的方法，已經(jīng)解決了上述問題。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定結(jié)合了用于檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌血清型(以及在一些實(shí)施方案中的內(nèi)部陽性對(duì)照(例如sSV40))的未標(biāo)記引物和Scorpion探針。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定還包含用于熒光信號(hào)歸一化并抵消阱間(well-to-well)信號(hào)變化的參比熒光。在104cfu/mL或更低的含單核細(xì)胞增多性李斯特菌血清型的液體培養(yǎng)物下，本發(fā)明公開的檢測(cè)測(cè)定法具有分析靈敏性。對(duì)53個(gè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌的菌株的包容性測(cè)試示出，全部均在得比相當(dāng)?shù)募?xì)胞密度下檢出(表4)。對(duì)61個(gè)密切相關(guān)的非單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌種的菌株的專有性研究(表5)顯示出，沒有一個(gè)受試樣品與單核細(xì)胞增多性李斯特菌檢測(cè)測(cè)定法發(fā)生交叉反應(yīng)。使用食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑(foodenrichment)樣品的測(cè)試顯示出優(yōu)異的敏感性和特異性，以及對(duì)PCR抑制劑的穩(wěn)健性。本公開因此涉及通過檢測(cè)推定的loll基因序列來檢測(cè)和鑒定單核細(xì)胞增多性李斯特菌。本發(fā)明檢測(cè)方法可用于檢測(cè)任意類型的樣品，例如用于食品測(cè)試、環(huán)境測(cè)試、或者人或動(dòng)物的診斷性測(cè)試的合適樣品中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌種。在用于檢測(cè)這些區(qū)域的合適方法的示例包括于本文的情況下，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于所述方法。相反，任何合適的方法可用于檢測(cè)這些DNA區(qū)域并隨后檢測(cè)樣品中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌。寡核苷酸Scorpion構(gòu)造Scorpion引物是熒光引物/探針寡核苷酸雜交體，其設(shè)計(jì)使它們僅在擴(kuò)增期間結(jié)合到PCR產(chǎn)物中時(shí)發(fā)光。這些引物包含兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)：1)靶特異性PCR引物和2)靶特異性DNA探針序列靶特異性引物靶特異性PCR引物通過阻斷部分例如3碳或6碳(分別為丙二醇或己二醇)部分，或者3個(gè)或6個(gè)聚乙二醇亞基的連接臂共價(jià)連接至DNA探針序列的3’端。該部分防止聚合酶延伸進(jìn)入探針元件中。在典型的PCR反應(yīng)中，引物序列在核苷酸的存在下通過DNA聚合酶的作用退火于互補(bǔ)靶DNA序列，從引物的3’端開始模板DNA合成反應(yīng)。DNA探針序列Scorpion探針的DNA探針序列與從結(jié)合到Scorpion探針中的靶特異性引物的3’端進(jìn)行聚合酶延伸所合成的靶基因序列互補(bǔ)。熒光淬滅機(jī)制熒光淬滅可通過雙分子或單分子機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。在雙分子Scorpion形式中，淬滅劑寡核苷酸也與DNA探針序列互補(bǔ)。熒光團(tuán)分子共價(jià)連接至DNA探針序列的5′端，而淬滅劑部分例如BHQ(黑洞淬滅劑，BlackHoleQuencher)染料則共價(jià)連接至淬滅劑寡核苷酸的3’端。在單分子機(jī)制中，探針序列被兩個(gè)互補(bǔ)序列夾在中間。熒光團(tuán)分子共價(jià)連接至DNA探針序列的5′端，并且淬滅劑位于互補(bǔ)序列的3’端并且鄰近于3碳或6碳(分別為丙二醇或己二醇)部分或者3個(gè)或6個(gè)聚乙二醇亞基的連接臂。當(dāng)探針未與聚合酶延伸所合成的靶基因序列雜交時(shí)，這些互補(bǔ)序列將彼此雜交。這使熒光團(tuán)和淬滅劑緊靠并導(dǎo)致熒光團(tuán)淬滅。本發(fā)明的寡核苷酸如SEQIDNO：2-16所示。本發(fā)明的寡核苷酸可用作PCR擴(kuò)增的引物。優(yōu)選的引物對(duì)及其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)和探針示出于表1中。表15′引物探針3′引物SEQIDNO：2SEQIDNO：11SEQIDNO：7SEQIDNO：2SEQIDNO：7SEQIDNO：2SEQIDNO：11SEQIDNO：3SEQIDNO：11SEQIDNO：5SEQIDNO：3SEQIDNO：5SEQIDNO：3SEQIDNO：11SEQIDNO：4SEQIDNO：11SEQIDNO：5SEQIDNO：4SEQIDNO：5SEQIDNO：4SEQIDNO：11SEQIDNO：6SEQIDNO：11SEQIDNO：5SEQIDNO：6SEQIDNO：5SEQIDNO：6SEQIDNO：11SEQIDNO：8SEQIDNO：11SEQIDNO：5SEQIDNO：8SEQIDNO：5SEQIDNO：8SEQIDNO：11SEQIDNO：8SEQIDNO：12SEQIDNO：5SEQIDNO：12SEQIDNO：5SEQIDNO：6SEQIDNO：13SEQIDNO：5SEQIDNO：13SEQIDNO：5SEQIDNO：10SEQIDNO：14SEQIDNO：9SEQIDNO：10SEQIDNO：9SEQIDNO：10SEQIDNO：14SEQIDNO：8SEQIDNO：15SEQIDNO：5SEQIDNO：15SEQIDNO：5SEQIDNO：8SEQIDNO：16SEQIDNO：5SEQIDNO：16SEQIDNO：5表2在上表2中，以下Scorpion探針序列在序列表中作為全序列示出而無修飾。SEQIDNO：11(單分子Lmono-357UM09)在序列表中作為全序列示出而無修飾，該scorpion探針在SEQIDNO：11中的核苷酸編號(hào)1之前具有5’熒光團(tuán)即CalFluor紅610，并且在SEQIDNO：11的核苷酸編號(hào)46之后具有內(nèi)部BHQ2淬滅劑和SP-18間隔區(qū)，之后為剩余的27個(gè)核苷酸。類似地，SEQIDNO：12(單分子Lmono-RC737UM10)在序列表中作為全序列示出而無修飾，該scorpion探針在SEQIDNO：12的核苷酸編號(hào)1之前具有5’熒光團(tuán)即CalFluor紅610，并且在SEQIDNO：12的核苷酸編號(hào)50之后具有內(nèi)部BHQ2淬滅劑和SP-18間隔區(qū)，之后為剩余的27個(gè)核苷酸。類似地，SEQIDNO：13(單分子Lmono-471UM11)在序列表中作為全序列示出而無修飾，該scorpion探針在SEQIDNO：13的核苷酸編號(hào)1之前具有5’熒光團(tuán)即CalFluor紅610，并且在SEQIDNO：13的核苷酸編號(hào)46之后具有內(nèi)部BHQ2淬滅劑和SP-18間隔區(qū)，之后為剩余的27個(gè)核苷酸。類似地，SEQIDNO：14(單分子Lmono-821UM12)在序列表中作為全序列示出而無修飾，該scorpion探針在SEQIDNO：14的核苷酸編號(hào)1之前具有5’熒光團(tuán)即CalFluor紅610，并且在SEQIDNO：14的核苷酸編號(hào)42之后具有內(nèi)部BHQ2淬滅劑和SP-18間隔區(qū)，之后為剩余的27個(gè)核苷酸。類似地，SEQIDNO：15(單分子Lmono-RC737UM13)在序列表中作為全序列示出而無修飾，該scorpion探針在SEQIDNO：15的核苷酸編號(hào)1之前具有5’熒光團(tuán)即CalFluor紅610，并且在SEQIDNO：15的核苷酸編號(hào)48之后具有內(nèi)部BHQ2淬滅劑和SP-18間隔區(qū)，之后為剩余的27個(gè)核苷酸。類似地，SEQIDNO：16(單分子Lmono-RC737UM14)在序列表中作為全序列示出而無修飾，該scorpion探針在SEQIDNO：16的核苷酸編號(hào)1之前具有5’熒光團(tuán)即CalFluor紅610，并且在SEQIDNO：16的核苷酸編號(hào)48之后具有內(nèi)部BHQ2淬滅劑和SP-18間隔區(qū)，之后為剩余的27個(gè)核苷酸。這些寡核苷酸引物對(duì)于其它核酸擴(kuò)增方法也是可用的，例如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(EP0320308；Carrino等人，J.Microbiol.Methods23：3-20(1995))；基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)(Carrino等人，1995，同上)；以及自動(dòng)維持序列復(fù)制(3SR)和“Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增”(Pfeffer等人，Vet.Res.Commun.19：375-407(1995))。本發(fā)明的寡核苷酸引物還可包含可檢測(cè)的標(biāo)記，例如5’末端標(biāo)記。此外，本發(fā)明的寡核苷酸也可用作雜交探針。很多情況下采用使用DNA探針的雜交來檢測(cè)食物、臨床的和環(huán)境樣品中的病原體，并且一般來講所述方法學(xué)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。普遍認(rèn)為探針雜交的敏感性和特異性的程度低于通過之前描述的擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)的敏感性和特異性。本發(fā)明的核酸探針還可具有可檢測(cè)的標(biāo)記，例如報(bào)告基因-淬滅劑組合用于Scorpion探針測(cè)定或者用于5′-核酸外切酶檢測(cè)測(cè)定法，例如測(cè)定法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針的3′末端核苷酸可能不能通過核酸聚合酶延伸。DNA聚合酶可為熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。此類阻斷可例如通過使復(fù)制抑制部分如報(bào)告基因或淬滅劑經(jīng)由連接部分連接至核酸探針的末端3′碳，或者通過使3′-末端核苷酸為雙脫氧核苷酸來實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用至少一種DNA聚合酶。另選地，可通過將一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾核苷酸間鍵結(jié)合到寡核苷酸的3′端上，使得核酸探針的3′端不受聚合酶的3′到5′延伸活性影響。最低限度地，3′末端核苷酸間鍵必須被修飾，然而，其它核苷酸間鍵可能被修飾。防止從核酸探針的3′端延伸并且/或者在PCR過程中阻斷DNA聚合酶的3′到5′核酸外切酶活性的核苷間的修飾可包括硫代磷酸鍵、甲基膦酸酯鍵、硼烷磷酸酯鍵、以及其它類似的聚合酶抗性核苷酸間鍵。用于阻斷探針3′延伸的另選方法是用絲裂霉素C或其它類似的抗腫瘤抗生素在探針3′端形成加合物，例如在Basu等人，Biochemistry32：4708-18(1993)中有所描述。因此，使核酸探針的3′端受到保護(hù)而免于裂解的精確機(jī)制并非必須的，只要淬滅劑不從核酸探針裂解下來即可。核酸探針序列還可任選地與本發(fā)明的引物序列對(duì)一起用于基于擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)，例如3′-核酸外切酶測(cè)定法。優(yōu)選的引物/探針和引物/引物組合選自：SEQIDNO2、7和11；SEQIDNO2和7；SEQIDNO2和11；SEQIDNO3、5和11；SEQIDNO3和5；SEQIDNO3和11；SEQIDNO4、5和11；SEQIDNO4和5；SEQIDNO4和11；SEQIDNO5、6和11；SEQIDNO5和6；SEQIDNO6和11；SEQIDNO5、8和11；SEQIDNO5和8；SEQIDNO8和11；SEQIDNO5、8和12；SEQIDNO5和12；SEQIDNO5、6和13；SEQIDNO5和13；SEQIDNO9、10和14；SEQIDNO9和10；SEQIDNO10和14；SEQIDNO5、8和15；SEQIDNO5和15；SEQIDNO5、8和16；以及SEQIDNO5和16(以上第052段的表1中所列的任何引物-探針-引物、引物-探針、或引物-引物配對(duì))。本發(fā)明的SEQIDNO：11、12、13、14、15和16包含引物區(qū)和探針區(qū)兩者，因此可在合適的測(cè)定例如Scorpion探針測(cè)定中用作引物-探針復(fù)合物。本發(fā)明的該種引物-探針復(fù)合物包含不可擴(kuò)增的接頭，其將所述探針區(qū)的3’末端連接到所述引物區(qū)的5’末端。這個(gè)不可擴(kuò)增的接頭阻止互補(bǔ)鏈延伸進(jìn)入所述引物-探針復(fù)合物的探針區(qū)中。此類不可擴(kuò)增的接頭的示例包括六乙烯乙二醇(HEG)和優(yōu)選的3個(gè)或6個(gè)聚乙二醇亞基的連接臂。本發(fā)明的引物-探針復(fù)合物也可包含自身互補(bǔ)區(qū)，當(dāng)所述探針從其靶DNA解綁時(shí)其使得所述引物-探針復(fù)合物形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，這可用于例如使所述報(bào)告基因和淬滅劑彼此足夠接近，以導(dǎo)致所述報(bào)告基因信號(hào)被淬滅。優(yōu)選地，SEQNO：11、12、13、14、15和16的5′端標(biāo)記有CALFluor紅610報(bào)告基因和處于或鄰近非擴(kuò)增接頭處的BHQ-2標(biāo)記。其它報(bào)告基因部分和對(duì)應(yīng)的淬滅劑能夠被取代。測(cè)定方法單核細(xì)胞增多性李斯特菌存在的檢測(cè)能以任何適宜的方式實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的方法是引物導(dǎo)向的擴(kuò)增方法和核酸雜交方法。這些方法可用于檢測(cè)樣品中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌分離物，所述樣品是復(fù)合的基質(zhì)或是經(jīng)純化的培養(yǎng)物，例如，來源于疑似被污染的動(dòng)物、環(huán)境或食物來源。本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案包括(1)在非選擇性或選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)復(fù)合物樣品混合物以復(fù)蘇靶細(xì)菌，(2)釋放靶細(xì)菌總DNA，以及(3)加入本發(fā)明的引物對(duì)并任選地加入包含可檢測(cè)標(biāo)記的核酸探針，使所述總DNA按擴(kuò)增方案實(shí)施。引物導(dǎo)向的擴(kuò)增測(cè)定方法本領(lǐng)域已知有多種引物導(dǎo)向的核酸擴(kuò)增方法可用于本發(fā)明中，包括熱循環(huán)方法(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，和LCR)，以及等溫方法和鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)(SDA)。優(yōu)選的方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。樣品制備：根據(jù)本發(fā)明的所述寡核苷酸和方法可直接用于任何適宜的臨床或環(huán)境樣品，無需任何樣品制備。為了獲得更高的靈敏度，并且在時(shí)間不是限制性因素的情況下，預(yù)處理所述樣品并且進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增富集是優(yōu)選的。檢測(cè)食品源性細(xì)菌病原體的最低行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為，可靠地檢測(cè)25克的食品基質(zhì)中一個(gè)病原體細(xì)胞的存在的方法，如AndrewS等人，1984，“FoodSampleandPreparationofSampleHomogenate”，BacteriologicalAnalyticalManual，第8版的第1章，RevisionA，U.S.FoodandDrugAdministration中所述。為了滿足這個(gè)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，已開發(fā)出富集方法和培養(yǎng)基以增強(qiáng)所述靶病原體細(xì)胞的生長(zhǎng)，以通過生物化學(xué)，免疫學(xué)或核酸雜交方法方便其檢測(cè)。典型的富集步驟使用了培養(yǎng)基，其將增強(qiáng)所述靶細(xì)菌的生長(zhǎng)和健康并且也會(huì)抑制存在的任何背景或非靶微生物的生長(zhǎng)。已開發(fā)出用于多種細(xì)菌病原體的選擇性培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解選擇適于待富集的特定生物體例如單核細(xì)胞增多性李斯特菌的培養(yǎng)基。非選擇性和選擇性培養(yǎng)基的綜述性討論和配方描述于在線FDA細(xì)菌分析手冊(cè)(BacteriologicalAnalyticalManual)(http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratorvMethods/ucm071363.htm)和硬拷貝，(1998)，由AssociationofAnalyticalChemists公布和發(fā)行(Suite400，2200WilsonBlvd，Arlington，VA22201-3301)。在選擇性生長(zhǎng)后，取出所述復(fù)合混合物的樣品用于進(jìn)一步分析。這個(gè)取樣步驟可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的多種方式完成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，取出5μl所述富集培養(yǎng)物，然后添加至200μl的包含蛋白酶和/或變?nèi)芫氐牧呀馊芤褐?。加熱所述裂解溶液?5℃，30分鐘，隨后在95℃蛋白酶失活10分鐘，并冷卻至4℃，如SystemUser’sGuide，DuPontNutritionandHealth，Wilmington，DE中所述。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定方法：用于檢測(cè)樣品中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌存在的優(yōu)選方法包括：(a)使用選自下列的引物對(duì)和引物探針對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以產(chǎn)生PCR擴(kuò)增結(jié)果：SEQIDNO2、7和11；SEQIDNO2和7；SEQIDNO2和11；SEQIDNO3、5和11；SEQIDNO3和5；SEQIDNO3和11；SEQIDNO4、5和11；SEQIDNO4和5；SEQIDNO4和11；SEQIDNO5、6和11；SEQIDNO5和6；SEQIDNO6和11；SEQIDNO5、8和11；SEQIDNO5和8；SEQIDNO8和11；SEQIDNO5、8和12；SEQIDNO5和12；SEQIDNO5、6和13；SEQIDNO5和13；SEQIDNO9、10和14；SEQIDNO9和10；SEQIDNO10和14；SEQIDNO5、8和15；SEQIDNO5和15；SEQIDNO5、8和16；以及SEQIDNO5和16(以上第052段的表1中所列的任何引物-探針-引物、引物-探針、或引物-引物配對(duì))；以及(b)檢測(cè)擴(kuò)增，從而擴(kuò)增的陽性檢出表明了樣品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的存在。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增之前，可進(jìn)行制備所述樣品的步驟。所述制備步驟可包括下列步驟中的至少一個(gè)：(1)細(xì)菌富集，(2)從所述樣品分離細(xì)菌細(xì)胞，(3)細(xì)胞裂解，以及(4)總DNA提取。擴(kuò)增條件：技術(shù)人員會(huì)理解，使用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，任何一般來講可接受的PCR條件可用于成功檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌，并且根據(jù)待測(cè)樣品和其它實(shí)驗(yàn)室條件，對(duì)PCR條件進(jìn)行常規(guī)優(yōu)化可能是必要的，以達(dá)到最佳的靈敏度和特異性。最佳地，他們實(shí)現(xiàn)了來自所有預(yù)期的特異性靶菌種的PCR擴(kuò)增結(jié)果而未得到其它非靶菌種的PCR結(jié)果。檢測(cè)/檢驗(yàn)/分析：引物引導(dǎo)的擴(kuò)增產(chǎn)物可用各種方法進(jìn)行分析。勻質(zhì)檢測(cè)是指用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的優(yōu)選的方法，其中不需要分離(諸如通過凝膠電泳)來自模板或引物的擴(kuò)增產(chǎn)物。通常通過在擴(kuò)增過程中或緊接擴(kuò)增測(cè)量所述反應(yīng)混合物的熒光水平來完成勻質(zhì)檢測(cè)。此外，在本發(fā)明中能使用異質(zhì)檢測(cè)方法，其涉及在檢測(cè)過程中或之前分離擴(kuò)增產(chǎn)物?？墒褂脛蛸|(zhì)檢測(cè)以實(shí)施“實(shí)時(shí)”引物導(dǎo)向的核酸擴(kuò)增和檢測(cè)，使用本發(fā)明的引物對(duì)(例如，“實(shí)時(shí)”PCR和“實(shí)時(shí)”RT-PCR)。在美國(guó)專利6,171,785、5,994,056、6,326,145、5,804,375、5,538,848、5,487,972和5,210,015中示出了優(yōu)選的“實(shí)時(shí)”方法，其中每個(gè)全文以引用方式并入本文。尤其優(yōu)選的“實(shí)時(shí)”檢測(cè)方法是在美國(guó)專利6,326,145中示出的所述Scorpion探針測(cè)定法，其全文以引用方式并入本文。在所述Scorpion探針測(cè)定法中，使用Scorpion探針(單分子或雙分子)作為引物-探針復(fù)合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述Scorpion探針具有一個(gè)適當(dāng)?shù)膱?bào)告基因-淬滅劑對(duì)，使得在所述引物伸長(zhǎng)之前淬滅所述報(bào)告基因的可檢測(cè)的信號(hào)。伸長(zhǎng)后，所述淬滅效應(yīng)被消除，并且存在的信號(hào)數(shù)量被定量。隨著擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量增加，將會(huì)觀察到可檢測(cè)的信號(hào)的等同增加，從而使得將存在的擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量確定為測(cè)得的可檢測(cè)信號(hào)數(shù)量的函數(shù)。當(dāng)在Scorpion探針測(cè)定法中使用多于一種Scorpion探針時(shí)，每種探針可具有連接的不同的可檢測(cè)的標(biāo)記(例如，報(bào)告基因-淬滅劑對(duì))，從而允許獨(dú)立于其它探針地檢測(cè)每種探針。另一個(gè)優(yōu)選的“實(shí)時(shí)”檢測(cè)方法是所述5’-核酸外切酶檢測(cè)方法，如美國(guó)專利5,804,375，5,538,848，5,487,972和5,210,015中示出的，其中的每個(gè)全文以引用方式并入本文。在所述5’-核酸外切酶檢測(cè)中，在PCR過程中使用經(jīng)修飾的探針，所述探針結(jié)合在擴(kuò)增引物對(duì)的兩個(gè)成員中間或之間。所述經(jīng)修飾的探針具有報(bào)告基因和淬滅劑，并且被設(shè)計(jì)為在PCR過程中生成可檢測(cè)的信號(hào)以表明其已經(jīng)與所述靶核酸序列雜交。只要所述報(bào)告基因和所述淬滅劑兩者都在所述探針之上，所述淬滅劑則使所述報(bào)告基因停止發(fā)射可檢測(cè)的信號(hào)。然而，在擴(kuò)增過程中隨著聚合酶延伸所述引物，所述聚合酶固有的5′至3′核酸酶活性降解了所述探針，將所述報(bào)告基因和所述淬滅劑分離，并且使得可檢測(cè)的信號(hào)能夠被發(fā)射。一般來講，在擴(kuò)增循環(huán)過程中生成的可檢測(cè)的信號(hào)的數(shù)量與每個(gè)循環(huán)中生成的產(chǎn)物數(shù)量成比例。已經(jīng)熟知淬滅的效率是所述報(bào)告基因和所述淬滅劑的接近度的強(qiáng)函數(shù)，即，隨著兩個(gè)分子逐漸靠近，所述淬滅效率增加。由于淬滅強(qiáng)烈依賴于所述報(bào)告基因和所述淬滅劑的物理接近，所述報(bào)告基因和所述淬滅劑優(yōu)選地連接至所述探針，彼此在幾個(gè)核苷酸內(nèi)，通常彼此在30個(gè)核苷酸內(nèi)，更優(yōu)選地在從約6至16個(gè)核苷酸的分離內(nèi)。通常，通過將報(bào)告基因-淬滅劑對(duì)的一個(gè)成員連接至所述探針的5′端，并且將另一個(gè)成員連接至約6至16個(gè)核苷酸之外來實(shí)現(xiàn)這種分離。同樣，當(dāng)在5’-核酸外切酶檢測(cè)測(cè)定法中使用多于一種探針時(shí)，每種探針可具有連接的不同的可檢測(cè)的標(biāo)記(例如，報(bào)告基因-淬滅劑對(duì))，從而允許獨(dú)立于其它探針地檢測(cè)每種探針。另一種優(yōu)選的勻質(zhì)檢測(cè)方法涉及使用DNA解鏈曲線分析，具體地采用系統(tǒng)硬件和試劑片劑(得自DuPontNutritionandHealth)。系統(tǒng)的細(xì)節(jié)在美國(guó)專利6,312,930和PCT公開WO97/11197和WO00/66777中給出，其中每個(gè)全文以引用方式并入本文。通過在每次擴(kuò)增循環(huán)過程中在所選時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)靶擴(kuò)增產(chǎn)物(“靶擴(kuò)增子”)的熒光，解鏈曲線分析檢測(cè)和量化雙鏈核酸分子(“dsDNA”或“靶標(biāo)”)。如技術(shù)人員所熟知的，當(dāng)溫度高于dsDNA解鏈溫度時(shí)，dsDNA的兩條鏈分開或解鏈。dsDNA分子的解鏈為如下過程：在給定的溶液條件下，解鏈開始于一個(gè)溫度(在下文中命名為Tms)，并且完成于另一個(gè)溫度(在下文中命名為Tme)。類似的術(shù)語Tm表示解鏈完成50％時(shí)的溫度。典型的PCR循環(huán)涉及：靶dsDNA解鏈的變性階段；引物退火階段，其中溫度對(duì)于引物結(jié)合到現(xiàn)在的單鏈靶標(biāo)是最佳的；和鏈延長(zhǎng)階段(在溫度Te下)，其中溫度對(duì)于DNA聚合酶起作用是最佳的。根據(jù)本發(fā)明，Tms應(yīng)當(dāng)高于Te，并且Tme應(yīng)當(dāng)?shù)陀?通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于)使DNA聚合酶加熱滅活的溫度。解鏈特征受給定dsDNA分子固有性質(zhì)的影響，例如脫氧核苷酸組成和dsDNA的長(zhǎng)度。嵌入染料將結(jié)合至雙鏈DNA。染料/dsDNA復(fù)合物將在暴露于適當(dāng)?shù)墓饧ぐl(fā)波長(zhǎng)時(shí)發(fā)熒光，這取決于染料，并且熒光強(qiáng)度可與dsDNA的濃度成比例。利用DNA嵌入染料檢測(cè)和定量dsDNA的方法在本領(lǐng)域中是已知的。許多染料是已知的并且用于這些目的的本領(lǐng)域。本發(fā)明方法也利用了此類關(guān)系。此類嵌入染料的示例包括但不限于SYBR溴化乙錠、碘化丙錠、{喹啉，1-1′-[1，3-丙二基雙[(二甲基亞氨基)-3，1-丙二基]]雙[4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亞基)甲基]]-，四碘化物}，和{喹啉，4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噁唑亞基)甲基]-1-[3-(三甲基銨)-丙基]-，二碘化物}。本發(fā)明最優(yōu)選的是非不對(duì)稱氰化物染料，例如SYBR由MolecularProbes，Inc.制造(Eugene，OR)。解鏈曲線分析通過在溫度增大時(shí)監(jiān)測(cè)熒光的變化來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)溫度達(dá)到對(duì)靶擴(kuò)增子特異性的TMS時(shí)，dsDNA開始變性。當(dāng)dsDNA變性時(shí)，嵌入染料從DNA解離并且熒光減小。熒光對(duì)數(shù)變化除以溫度變化的負(fù)數(shù)相對(duì)于溫度繪圖的數(shù)學(xué)分析產(chǎn)生了稱為解鏈曲線的圖形化峰。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可利用這些技術(shù)的組合進(jìn)行操作，例如通過使Scorpion探針定向于一個(gè)靶區(qū)域并使探針定向于第二靶區(qū)域。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于上述技術(shù)。相反，本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到還可使用本領(lǐng)域已知的用于檢測(cè)擴(kuò)增的其它技術(shù)。例如，諸如基于PCR的定量序列檢測(cè)(QSD)的技術(shù)可使用核酸探針進(jìn)行，當(dāng)該核酸探針在溶液中以單鏈狀態(tài)存在時(shí)被構(gòu)造成使得報(bào)告基因和淬滅劑靠近到足以顯著淬滅報(bào)告基因的發(fā)射。然而，在完整的報(bào)告基因-淬滅劑核酸探針與擴(kuò)增的靶核酸序列雜交時(shí)，報(bào)告基因和淬滅劑變得彼此足夠遠(yuǎn)離。因此，淬滅基本上消除，從而導(dǎo)致檢測(cè)到的熒光發(fā)射增大。除了勻質(zhì)檢測(cè)方法，本領(lǐng)域已知的多種其它異質(zhì)檢測(cè)方法可用于本發(fā)明中，包括標(biāo)準(zhǔn)非變性凝膠電泳(例如，丙烯酰胺或瓊脂糖)，變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳。標(biāo)準(zhǔn)非變性凝膠電泳是一種簡(jiǎn)單和快速的PCR檢測(cè)方法，但可能不適于所有應(yīng)用。變性梯度凝膠電泳(DGGE)是檢測(cè)小DNA片段(200-700bp)的變性行為的差異的分離方法。分離原理基于片段長(zhǎng)度和核苷酸序列兩者。在長(zhǎng)度相同的片段中，可檢測(cè)到小至一個(gè)堿基對(duì)的差異。這與DNA片段僅僅按尺寸分離的非變性凝膠電泳相反。非變性凝膠電泳的此種局限性是由于DNA分子之間的電荷密度差異接近中性并且在其分離中幾乎不起作用的結(jié)果。隨著DNA片段尺寸的增大，其通過凝膠的速度減小。DGGE主要基于其變性特征和序列用來分離相同尺寸的DNA片段。使用DGGE，當(dāng)施加熱或化學(xué)變性劑時(shí)，DNA分子的兩條鏈分開或解鏈。DNA雙鏈體的變性受兩個(gè)因素影響：1)互補(bǔ)堿基對(duì)之間形成的氫鍵(因?yàn)镚C富集區(qū)在比AT富集區(qū)更高的變性條件下解鏈)；和2)同一鏈的相鄰堿基之間的引力，或“堆積”。因此，DNA分子可具有若干解鏈結(jié)構(gòu)域，其各個(gè)特征變性條件中的每一者由其核苷酸序列確定。DGGE利用的事實(shí)在于，除特異性變性結(jié)構(gòu)域內(nèi)的僅一個(gè)核苷酸外，具有相同長(zhǎng)度和DNA序列的其它方面相同的DNA分子將在不同溫度或Tm下變性。因此，當(dāng)雙鏈(ds)DNA片段通過遞增的化學(xué)變性劑梯度電泳時(shí)，其開始變性并發(fā)生構(gòu)象和遷移率變化兩者。dsDNA片段將比變性的單鏈(ss)DNA片段更快地移動(dòng)，因?yàn)榉肿訂捂湶糠值闹ф溄Y(jié)構(gòu)在凝膠基質(zhì)內(nèi)纏結(jié)在一起。隨著變性環(huán)境增大，在DNA鏈的特定低變性結(jié)構(gòu)域發(fā)生解離的變性劑濃度下，dsDNA片段將完全解離并且分子通過凝膠的遷移率降低。在實(shí)施過程中，電泳在恒定溫度(約60℃)下進(jìn)行并且化學(xué)變性劑以導(dǎo)致100％DNA分子變性的濃度使用(即，40％甲酰胺和7M脲)。該種可變的變性梯度用梯度儀創(chuàng)建，由此使得各個(gè)DGGE凝膠的組成逐漸由0％變性劑變?yōu)橹炼?00％變性劑。當(dāng)然，還可注入包含范圍減小的變性劑(例如，35％至60％)的梯度以增大DNA的分離。DGGE中所用的原理也可應(yīng)用于使用溫度梯度而非化學(xué)變性劑梯度的第二方法。該方法稱為溫度梯度凝膠電泳(TGGE)。該方法利用溫度梯度誘導(dǎo)dsDNA的構(gòu)象變?yōu)閟sDNA，以分離尺寸相等而序列不同的片段。如在DGGE中，具有不同核苷酸序列的DNA片段將在凝膠的不同位置被固定。引物設(shè)計(jì)的變型可用來有利地增大用于表征和鑒定PCR產(chǎn)物的DGGE的實(shí)用性。這些使用引物設(shè)計(jì)變型的方法和原理描述于PCRTechnologyPrinciplesandApplications，HenryA.Erlich編輯，M.StocktonPress，NY，第71至88頁(1988)。儀器：當(dāng)使用勻質(zhì)檢測(cè)時(shí)，優(yōu)選地使用激光熒光計(jì)測(cè)量熒光水平，例如系統(tǒng)Q7裝置(DuPontNutritionandHealth，Wilmington，DE)。然而，本發(fā)明包括了用于測(cè)量樣品中熒光水平的類似檢測(cè)系統(tǒng)。試劑和試劑盒：可使用任何形式的任何適宜的核酸復(fù)制組合物(“復(fù)制組合物”)。用于PCR擴(kuò)增的典型的復(fù)制組合物可包含，例如，dATP、dCTP、dGTP、和dTTP、靶特異性引物和至少一種合適的聚合酶。如果所述復(fù)制組合物是液體形式的，可使用在本領(lǐng)域中已知的適宜的緩沖劑(Sambrook，J.等人，同上)。作為另外一種選擇，如果所述復(fù)制組合物被包含在片劑形式中，則典型的片劑化試劑可包括諸如穩(wěn)定劑和結(jié)合劑。在美國(guó)專利4,762,857和4,678,812中示出了優(yōu)選的片劑化技術(shù)，其中每個(gè)全文以引用方式并入本文。本發(fā)明優(yōu)選的復(fù)制組合物包含：(a)選自以下的一組引物對(duì)或引物-探針對(duì)：SEQIDNO2、7和11；SEQIDNO2和7；SEQIDNO2和11；SEQIDNO3、5和11；SEQIDNO3和5；SEQIDNO3和11；SEQIDNO4、5和11；SEQIDNO4和5；SEQIDNO4和11；SEQIDNO5、6和11；SEQIDNO5和6；SEQIDNO6和11；SEQIDNO5、8和11；SEQIDNO5和8；SEQIDNO8和11；SEQIDNO5、8和12；SEQIDNO5和12；SEQIDNO5、6和13；SEQIDNO5和13；SEQIDNO9、10和14；SEQIDNO9和10；SEQIDNO10和14；SEQIDNO5、8和15；SEQIDNO5和15；SEQIDNO5、8和16；以及SEQIDNO5和16(以下第052段的表1中所列的任何引物-探針-引物、引物-探針、或引物-引物配對(duì))，和(b)熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。本發(fā)明更優(yōu)選的復(fù)制組合物包含：(a)選自表1的引物對(duì)和任意對(duì)應(yīng)的探針，其中所用的各個(gè)核酸探針或引物-探針復(fù)合物包含可檢測(cè)的標(biāo)記；和(b)熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。優(yōu)選地，可檢測(cè)的標(biāo)記包含能夠發(fā)射可檢測(cè)的信號(hào)的報(bào)告基因以及當(dāng)報(bào)告基因和淬滅劑彼此足夠緊靠時(shí)能夠顯著淬滅報(bào)告基因并防止可檢測(cè)的標(biāo)記發(fā)射的淬滅劑。本發(fā)明的優(yōu)選的試劑盒包含上述復(fù)制組合物的任一種。本發(fā)明的優(yōu)選的片劑包含上述復(fù)制組合物的任一種。更優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含前述優(yōu)選的片劑。在一些情況下，在反應(yīng)中可包括內(nèi)部陽性對(duì)照。內(nèi)部陽性對(duì)照可包括對(duì)照模板核酸(例如，DNA或RNA)、對(duì)照引物、以及對(duì)照核酸探針。之前已經(jīng)描述被包含在PCR反應(yīng)內(nèi)的內(nèi)部陽性對(duì)照的優(yōu)點(diǎn)(美國(guó)專利6,312,930和PCT申請(qǐng)wO97/11197，其中的每個(gè)全文以引用方式并入本文)，并且包括：(i)對(duì)照可用單一引物擴(kuò)增；(ii)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物的量與樣品中所含的任何靶DNA或RNA無關(guān)；(iii)對(duì)照DNA可用其它擴(kuò)增試劑壓片以在手動(dòng)和自動(dòng)測(cè)試過程兩者中均易于使用且有高度重復(fù)性；(iv)對(duì)照可用于勻質(zhì)檢測(cè)，即無需從反應(yīng)物中分離產(chǎn)物DNA；并且(v)內(nèi)部對(duì)照具有與反應(yīng)中其它可能的擴(kuò)增產(chǎn)物不同的解鏈曲線圖和/或與定向于靶標(biāo)的核酸探針上的可檢測(cè)標(biāo)記不同的對(duì)照核酸上的可檢測(cè)標(biāo)記。對(duì)照DNA將具有適當(dāng)?shù)拇笮『蛪A基組合物以允許在引物引導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增?？蓮膯魏思?xì)胞增多性李斯特菌的基因組或從另一來源獲得所述對(duì)照模板DNA序列，但必須在相同條件下可重復(fù)地?cái)U(kuò)增以允許所述靶標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物響擴(kuò)增。優(yōu)選的對(duì)照序列包括例如存在于SV40的那些。當(dāng)使用時(shí)，SV40優(yōu)選的濃度范圍為101至107個(gè)拷貝/PCR反應(yīng)。SEQIDNO：17AATAGCAGACACTCTATGCCTGTGTGGAGTAAGAAAAAACAGTATGTTATGATTATAACTGTTATGCCTACTTATAAAGGTTACAGAATATTTTTCCATAATTTTCTTGTATAGCAGTGCAGCTTTTTCCTTTGTGGTGTAAATA所述對(duì)照反應(yīng)可用于驗(yàn)證所述擴(kuò)增反應(yīng)。所述對(duì)照DNA的擴(kuò)增發(fā)生在與被測(cè)試的所述樣品相同的反應(yīng)管中，因此當(dāng)樣品為靶標(biāo)陰性、即沒有生成靶標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，表明是成功的擴(kuò)增反應(yīng)。為了獲得所述擴(kuò)增反應(yīng)的顯著驗(yàn)證，在每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中必須包括適宜數(shù)量的所述對(duì)照DNA模板的復(fù)制。在一些情況下，包括附加的陰性對(duì)照復(fù)制組合物可能是有用的。所述陰性對(duì)照復(fù)制組合物將包含與所述復(fù)制組合物相同的試劑，但沒有聚合酶。當(dāng)所述方法使用熒光檢測(cè)方法時(shí)，此類對(duì)照的主要作用是監(jiān)測(cè)勻質(zhì)形式的偽背景熒光?？筛鶕?jù)是否設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶標(biāo)DNA或?qū)φ誅NA來修飾復(fù)制組合物。將擴(kuò)增所述靶標(biāo)DNA的復(fù)制組合物(測(cè)試復(fù)制組合物)可包含(i)聚合酶(一般來講是熱穩(wěn)定性的)，(ii)能雜交至所述靶標(biāo)DNA的引物對(duì)，和(iii)用于擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的必需的緩沖劑。將擴(kuò)增對(duì)照DNA的復(fù)制組合物(陽性對(duì)照，或陽性復(fù)制組合物)可包含(i)聚合酶(一般來講是熱穩(wěn)定性的)，(ii)對(duì)照DNA；(iii)至少一種能雜交至對(duì)照DNA的引物；和(iv)用于擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的必需的緩沖劑。此外，用于靶DNA或?qū)φ誅NA擴(kuò)增的所述復(fù)制組合物可包含核酸探針，優(yōu)選地其具有可檢測(cè)的標(biāo)記。核酸雜交方法除引物引導(dǎo)的擴(kuò)增測(cè)定法之外，還可在本發(fā)明中使用核酸雜交測(cè)定法以檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌。核酸雜交試驗(yàn)的基本組分包括探針、疑似含有單核細(xì)胞增多性李斯特菌的樣品及特定的雜交方法。通常探針長(zhǎng)度可從少至五個(gè)堿基變化到單核細(xì)胞增多性李斯特菌診斷序列的全長(zhǎng)并且將依賴于待進(jìn)行的特定測(cè)試。需要探針分子的僅一部分與待檢測(cè)的核酸序列互補(bǔ)。另外，探針和靶序列之間不需要完全互補(bǔ)。雜交確實(shí)可以在并不完全互補(bǔ)的分子之間發(fā)生，結(jié)果是雜交區(qū)內(nèi)的一定比率的堿基沒有與正確的互補(bǔ)堿基配對(duì)。特別可用于核酸雜交方法的探針為SEQIDNO：2-16中的任一者或由其衍生的序列。樣品可能或者可能不包含單核細(xì)胞增多性李斯特菌。樣品可采用多種形式，然而其通常從疑似被污染的動(dòng)物、環(huán)境或食物源提取。DNA可被直接檢測(cè)到，但是最優(yōu)選地，在可能發(fā)生探針和靶分子的任何雜交之前，樣品核酸必須可用于接觸探針。因此，生物體的DNA優(yōu)選地不含細(xì)胞并且在可能發(fā)生雜交之前被置于適當(dāng)?shù)臈l件下。溶液中雜交的方法需要純化DNA，從而能夠獲得樣品DNA與探針的雜交。這就意味著，使用溶液中的方法檢測(cè)樣品中的靶序列需要樣品的核酸必須先被純化以除去蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、及其它細(xì)胞組分，然后使其在雜交條件下與探針接觸。用于純化樣品核酸的方法在本領(lǐng)域中是常見和熟知的(Sambrook等人，同上)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交測(cè)定可直接在細(xì)胞裂解液上進(jìn)行而無需提取核酸。這除去了來自于樣品處理過程的若干步驟并且加快了測(cè)定。為了在粗制細(xì)胞裂解液上進(jìn)行此類測(cè)定，通常將離液劑添加到如上所述制備的細(xì)胞裂解液中。離液劑通過抑制核酸酶活性來穩(wěn)定核酸。此外離液劑允許短的寡核苷酸探針在室溫下靈敏且嚴(yán)格的雜交至DNA(VanNess&Chen，NucleicAcidsRes.19：5143-51(1991))。合適的離液劑包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸鈉、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀和三氟乙酸銫等。通常，離液劑的最終濃度將為約3M。如果需要，技術(shù)人員可將甲酰胺加到雜交混合物中，通常為30-50％(v/v)。另選地，技術(shù)人員可在探針雜交之前純化樣品核酸。多種方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的(例如，苯酚-氯仿提取，IsoQuick提取(MicroProbeCorp.，Bothell，WA)，以及其它)。雜交前純化特別用于標(biāo)準(zhǔn)濾膜雜交測(cè)定。此外，通過結(jié)合體外RNA擴(kuò)增方法例如自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(參見例如Fahy等人，InPCRMethodsandApplications，ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1991)，第25-33頁)或者逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(Kawasaki，InPCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications，M.A.Innis等人編輯，(1990)，第21-27頁)，純化有利于使測(cè)量增大測(cè)定靈敏性。在DNA釋放后，其可通過任何各種方法檢測(cè)到。然而，最有用的實(shí)施方案具有至少一些特征：速度、方便性、靈敏性和特異性。雜交方法是本領(lǐng)域所熟知的。通常探針和樣品必須在允許核酸雜交的條件下混合。這涉及在適當(dāng)濃度和溫度條件下在存在無機(jī)或有機(jī)鹽時(shí)使探針和樣品接觸。探針和樣品核酸必須接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，使探針和樣品核酸之間的任何可能的雜交均可發(fā)生?；旌衔镏械奶结樆虬袠?biāo)的濃度將決定雜交發(fā)生所需的時(shí)間。探針或靶標(biāo)的濃度越高，所需的雜交孵育時(shí)間就越短?？梢圆捎枚喾N雜交溶液。通常，這些雜交溶液包含約20％至60％體積，優(yōu)選30％體積的極性有機(jī)溶劑。常見的雜交溶液使用約30-50％v/v的甲酰胺，約0.15至1M的氯化鈉，約0.05至0.1M的緩沖液如檸檬酸鈉、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范圍介于約6-9之間)，約0.05至0.2％的洗滌劑如十二烷基硫酸鈉，或0.5-20mMEDTA，F(xiàn)ICOLL(PharmaciaInc.)(約300-500千道爾頓)，聚乙烯吡咯烷酮(約250-500千道爾頓)，以及血清白蛋白。一般的雜交溶液還將包含約0.1至5mg/mL未經(jīng)標(biāo)記的載體核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鮭精DNA或酵母RNA)，以及任選約0.5％至2％重量/體積的甘氨酸。還可以包含其它添加劑，例如包括多種極性水溶性或可膨脹試劑(如聚乙二醇)、陰離子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和陰離子糖類聚合物(如硫酸葡聚糖)在內(nèi)的體積排阻劑。核酸雜交可適用于多種測(cè)定形式。最合適的方法形式之一是夾心測(cè)定形式。夾心測(cè)定尤其適用于在非變性條件下雜交。夾心型測(cè)定的主要成分是固體支持體。固體支持體具有吸附或共價(jià)連接至其上的固定核酸探針，該探針未經(jīng)標(biāo)記并且與DNA序列的一部分互補(bǔ)。夾心測(cè)定可包括于測(cè)定試劑盒中。該試劑盒將包含用于收集疑似被污染的樣品的第一組分以及用于分配和裂解樣品的緩沖劑。第二組分將包括以干燥形式或液體形式存在的介質(zhì)，所述介質(zhì)用于雜交靶多核苷酸和探針多核苷酸以及通過洗滌移除非期望的和非雙鏈形式的核酸。第三組分包括固體支持體(量桿)，其上固定(或其綴合)與本文所公開的一種或多種序列互補(bǔ)的未標(biāo)記的核酸探針。第四組分將包含與相同DNA鏈的第二及不同區(qū)域互補(bǔ)的經(jīng)標(biāo)記的探針，第三組分的固定化的未標(biāo)記核酸探針與該DNA鏈雜交。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所公開的多核苷酸序列或其衍生物可以以勻質(zhì)或異質(zhì)測(cè)定形式用作3′阻斷的檢測(cè)探針。例如，由這些序列產(chǎn)生的探針可以是3′阻斷的或非參與性的并且將不通過(或參與)核酸擴(kuò)增反應(yīng)而延長(zhǎng)。另外，探針結(jié)合了可充當(dāng)反應(yīng)性配體的標(biāo)記，該標(biāo)記用作用于固定探針/分析物雜交體的連接點(diǎn)或者用作報(bào)告基因以產(chǎn)生可檢測(cè)的標(biāo)記。因此，在過量的3′阻斷的檢測(cè)探針存在下，通過標(biāo)準(zhǔn)引物引導(dǎo)的擴(kuò)增方案擴(kuò)增從疑似被單核細(xì)胞增多性李斯特菌污染的樣品分離的基因組或cDNA，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。因?yàn)樘结樖?′阻斷的，所以其不參與或妨礙靶標(biāo)的擴(kuò)增。在最終的擴(kuò)增循環(huán)之后，檢測(cè)探針對(duì)擴(kuò)增DNA的相關(guān)部分退火，然后通過反應(yīng)性配體使經(jīng)退火的復(fù)合物捕獲于支持體上。在一些情況下，希望結(jié)合配體標(biāo)記的dNTP，復(fù)制組合物中的標(biāo)記探針有利于PCR反應(yīng)產(chǎn)物固定于支持體上，然后通過經(jīng)標(biāo)記的探針試劑檢測(cè)經(jīng)固定的產(chǎn)物。例如，可將生物素、地高辛、或毛地黃(digoxin)標(biāo)記的dNTP添加至PCR反應(yīng)組合物。接著，可將結(jié)合于PCR產(chǎn)物中的生物素、地高辛、或毛地黃分別固定到鏈霉抗生物素蛋白、抗毛地黃或抗地高辛抗體支持體上。經(jīng)固定的PCR產(chǎn)物然后可由存在的探針標(biāo)記檢測(cè)。實(shí)施例：本發(fā)明將在以下的實(shí)施例中進(jìn)一步闡述。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例盡管說明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。用于實(shí)施例的一般性方法和材料適于細(xì)菌培養(yǎng)物維持及生長(zhǎng)的材料和方法在領(lǐng)域所熟知的。適用于如下實(shí)施例的技術(shù)可見于如下文獻(xiàn)：ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood，NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips編輯)，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC.(1994)或ThomasD.Brock的Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989)，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA.或BacteriologicalAnalyticalManual.第6版，AssociationofOfficialAnalyticalChemists，Arlington，VA(1984)。引物和探針(SEQIDNO：2-16)通過LGCBiosearchTechnologies，Inc.，2199S.McDowellBlvd.，Petaluma，CA94954USA制備。所有PCR反應(yīng)均用標(biāo)準(zhǔn)Q7系統(tǒng)(DuPontNutritionandHealth，Wilmington，DE)進(jìn)行。縮寫的含義如下：“h”是指小時(shí)，“min”是指分鐘，“sec”是指秒，“d”是指天，“ml”是指毫升，“ul”是指微升，“cfu”是指菌落形成單位數(shù)，“M”是指摩爾，“μM”是指微摩爾，“nM”是指納摩爾，“L.mono”是指單核細(xì)胞增多性李斯特菌，“Ct”是指循環(huán)閾值，“IPC”是指內(nèi)部陽性對(duì)照，“IoII”是指肌醇單酮異構(gòu)酶蛋白基因。實(shí)施例1單核細(xì)胞增多性李斯特菌引物和Scorpion的開發(fā)評(píng)估一組九種引物和六種單分子scorpions，參見表1。當(dāng)以80nM至640nM范圍內(nèi)的引物濃度測(cè)試時(shí)，通過凝膠分析的PCR產(chǎn)物顯示出單核細(xì)胞增多性李斯特菌特異性靶標(biāo)的擴(kuò)增。當(dāng)擴(kuò)增作為靶標(biāo)的低水平單核細(xì)胞增多性李斯特菌基因組DNA時(shí)，將PCR反應(yīng)條件最優(yōu)化以使Ct最小化，同時(shí)維持更低的整體總引物濃度以使引物二聚體形成最小化。用較低的引物(SEQIDNO：2-10)濃度滴定探針(SEQIDNO：11-16)的濃度來評(píng)估擴(kuò)增，從而確定對(duì)信號(hào)振幅和基線熒光強(qiáng)度的影響并且闡明這是否將在較低的DNA靶水平下對(duì)Ct值具有任何影響。Scorpion探針(SEQIDNO：11-16)濃度從5nM滴定到40nM?；诘味ńY(jié)果，根據(jù)基線熒光、熒光信號(hào)振幅和Ct值，15nM的SEQIDNO：11-16示出最佳的PCR和Scorpion性能。實(shí)施例2包容性測(cè)定使不同血清型以及最初從各種來源分離的(得自DuPontNutrition&Health內(nèi)部培養(yǎng)物收集，命名為“DD”)單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌株共53個(gè)菌株在35℃下于腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)中生長(zhǎng)過夜。使細(xì)胞稀釋至約105CFU/ml并用標(biāo)準(zhǔn)BAX裂解方案進(jìn)行裂解，并且通過實(shí)時(shí)單核細(xì)胞增多性李斯特菌檢測(cè)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)試。全部示出為陽性信號(hào)(表3)。將代表一組單核細(xì)胞增多性李斯特菌血清型(表2中所列的#2、3、4、5、10、14、22、29、33、35和39以及DD651和DD1423)的13種分離物的子組連續(xù)稀釋至約102cfu/mL并且由實(shí)時(shí)PCR測(cè)定進(jìn)行測(cè)試。在103cfu/mL和更高下，所有菌株測(cè)試呈陽性。表3實(shí)施例3專有性測(cè)定將六十一種非單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌株的分離物(包括其它李斯特氏菌屬菌種)在30℃或37℃下于BHI中生長(zhǎng)過夜。各個(gè)菌株在BHI液體培養(yǎng)基中稀釋至1∶10，并且采用標(biāo)準(zhǔn)BAX裂解方案制備細(xì)胞裂解液，通過實(shí)時(shí)單核細(xì)胞增多性李斯特菌PCR測(cè)定進(jìn)行測(cè)試。所有菌株測(cè)試均呈陰性。(表4)。表4實(shí)施例4另外用不同食品基質(zhì)的摻加李斯特氏菌屬的富集物評(píng)估測(cè)定的敏感性和特異性。簡(jiǎn)而言之，在225mL具有抗生素補(bǔ)充劑的24LEB(李斯特氏菌屬富集液體培養(yǎng)基，ListeriaEnrichmentBroth)中富集25g不含李斯特氏菌屬的食品基質(zhì)部分。連續(xù)稀釋所列單核細(xì)胞增多性李斯特菌分離物的新生長(zhǎng)的BHI培養(yǎng)物并加入相應(yīng)的食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑中以實(shí)現(xiàn)1×108、1×107、1×106、1×105、1×104和1×103cfu/ml的濃度。使用標(biāo)準(zhǔn)裂解方案制備加入富集物的裂解物，并且以凍干的片劑形式進(jìn)行測(cè)定。就各個(gè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌富集裂解物而言，該測(cè)定示出約104cfu/mL的靈敏性。未發(fā)現(xiàn)背景微生物區(qū)系的交叉反應(yīng)，因?yàn)樗锌瞻资称窢I(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑裂解物由測(cè)定測(cè)試為陰性。當(dāng)前第1頁1 2 3