一套用于單增李斯特菌檢測(cè)的多核苷酸、方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一套生物工程技術(shù)領(lǐng)域的質(zhì)粒分子，具體涉及一套用于單增李斯特菌 檢測(cè)的多核苷酸、方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes)歸屬于李斯特菌屬（Listeria)。單 核細(xì)胞增生李斯特菌是李斯特菌屬中唯一對(duì)人致病的病菌，是一種重要的人獸共患和食品 衛(wèi)生病原菌，該菌主要通過肉乳及其制品引起人的感染發(fā)病，能引起人和動(dòng)物腦膜炎敗血 癥及孕婦流產(chǎn)等，故已引起世界多國(guó)相關(guān)部門的重視。
[0003]目前單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)方法分為兩類，一類是傳統(tǒng)的培養(yǎng)及其改 進(jìn)方法，依賴于生化與形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，可操作性差；一類是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction，PCR)相關(guān)方法，包括普通PCR方法以及實(shí)時(shí)焚光PCR方法， 主要是針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌區(qū)別于李斯特菌屬其它細(xì)菌的多個(gè)靶基因，選擇特異 序列，建立PCR以及實(shí)時(shí)熒光PCR方法。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌PCR相關(guān)檢測(cè)方法近年 來發(fā)展迅速，由于其快速、靈敏、特異的特性，已經(jīng)成為食源性病原微生物的可靠檢測(cè)方法。
[0004] 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一套含有檢測(cè)目的基因的特異性片段的重組質(zhì)粒分子，在 PCR定性檢測(cè)中可以作為陽(yáng)性對(duì)照，在PCR定量分析中可以作為定量分析的標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建定 量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。目前質(zhì)粒DNA分子作為基因檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得到了越來越多的深入研 究和應(yīng)用，但是針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 還是空白。在實(shí)際單核細(xì)胞增生李斯特氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR時(shí)，各單位使用的多是自行設(shè)計(jì) 構(gòu)建的質(zhì)粒DNA分子作為標(biāo)準(zhǔn)品，其中的目的基因特異性片段各不相同，同時(shí)缺乏統(tǒng)一的 定值方法，質(zhì)粒DNA分子定值準(zhǔn)確度差，造成各實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果差異極大，缺乏可比 性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一套適用于單增李斯特菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的質(zhì)粒 標(biāo)準(zhǔn)分子及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一套適用于致病型單增李斯特菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢 測(cè)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一方面，提供了一套分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含單增李斯特 菌的內(nèi)化素基因 InlA基因序列和/或單增李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)蛋白基因 prfA基因序 列。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述單增李斯特菌內(nèi)化素基因 InlA的基因序列選自下組： [0009] (a)序列如SEQ ID NO. : 3所示的多核苷酸序列；
[0010] (b)核苷酸序列與SEQ ID NO. :3所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0011] (C)序列與SEQ ID NO. :3所示多核苷酸完全匹配或完全互補(bǔ)并且長(zhǎng)度為SEQ ID NO. : 3所示序列長(zhǎng)度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0012] (d)與（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述單增李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)蛋白基因 prfA基因序列選 自下組：
[0014] (a)序列如SEQ ID NO. :1所示的多核苷酸序列；
[0015] (b)核苷酸序列與SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0016] (c)序列與SEQ ID NO. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互補(bǔ)并且長(zhǎng)度為SEQ ID NO. :1所示序列長(zhǎng)度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0017] (d)與（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸含有單增李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)蛋白基因 prfA 基因序列和單增李斯特菌的內(nèi)化素基因 InlA序列，以及任選地連接兩種基因序列的接頭 序列。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO. :3所示。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0021] 本發(fā)明的第二方面，提供了一套分離的DNA構(gòu)建物，所述DNA構(gòu)建物中包含本發(fā)明 第一方面所述的多核苷酸，以及任選的標(biāo)簽序列、酶切序列、啟動(dòng)子序列和/或載體序列。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述DNA構(gòu)建物中包含單增李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)蛋白基因 PrfA基因序列和單增李斯特菌的內(nèi)化素 InlA的基因序列。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述DNA構(gòu)建物為線性DNA構(gòu)建物或環(huán)狀DNA構(gòu)建物。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述DNA構(gòu)建物為質(zhì)?；虮磉_(dá)載體。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)?；虮磉_(dá)載體作為單增李斯特菌檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)分子（質(zhì) 粒標(biāo)準(zhǔn)分子）。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)?；虮磉_(dá)載體的骨架質(zhì)粒選自下組：pUC19, pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScript II SK 和 pGEM。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)粒的序列如SEQ ID NO :2或4所示。
[0028] 本發(fā)明的第三方面，提供了一套試劑盒，所述試劑盒中包括本發(fā)明第一方面所述 的多核苷酸或者本發(fā)明第二方面所述的DNA構(gòu)建物。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括引物對(duì)，所述引物對(duì)特異性擴(kuò)增單增李斯 特菌內(nèi)化素基因 InlA的基因序列。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，特異性擴(kuò)增單增李斯特菌內(nèi)化素基因 InlA的基因序列的所述 的引物對(duì)選自下組：
[0031] SEQ ID NO. :5 和 SEQ ID NO. :6 所示的引物對(duì)；
[0032] SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 所示的引物對(duì)；
[0033] SEQ ID NO. :9 和 SEQ ID NO. : 10 所示的引物對(duì)；和
[0034] SEQ ID NO. : 11 和 SEQ ID NO. : 12 所示的引物對(duì)。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括引物對(duì)，所述所述引物對(duì)特異性擴(kuò)增單增 李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)蛋白基因 PrfA基因序列。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，特異性擴(kuò)增單增李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)蛋白基因 PrfA基因 序列的引物對(duì)選自下組：
[0037] SEQ ID NO. : 14 和 SEQ ID NO. : 15 所示的引物對(duì)；
[0038] SEQ ID NO. : 16 和 SEQ ID NO. : 17 所示的引物對(duì)；和
[0039] SEQ ID NO. : 18 和 SEQ ID NO. : 19 所示的引物對(duì)。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ ID NO. : 13 所示。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ ID Na : 20 所示。
[0042] 本發(fā)明的第四方面，提供了如本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第二方面 所述的DNA構(gòu)建物、或本發(fā)明第三方面所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于單增李斯特 囷的檢測(cè)。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)為非診斷或治療目的。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)為熒光定量PCR檢測(cè)。
[0045] 本發(fā)明的第五方面，提供了一套單增李斯特菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，所采 用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是如本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸或本發(fā)明第二方面所述的DNA構(gòu)建物。
[0046] 本發(fā)明的第六方面，提供了一套多核苷酸產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括：
[0047] (i)單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)品，所述的標(biāo)準(zhǔn)品選自：本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸 或者本發(fā)明第二方面所述的DNA構(gòu)建物；
[0048] (ii)特異性擴(kuò)增單增李斯特菌序列的引物對(duì)，所述引物對(duì)為：
[0049] SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :6所示的序列構(gòu)成的引物對(duì)；和/或
[0050] SEQ ID Nd : 14和SEQ ID Nd : 15所示的序列構(gòu)成的引物對(duì)。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)品為多核苷酸的組合（combination)，較佳地所述組分 ⑴和（ii)是各自獨(dú)立的。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)品為試劑盒形式。
[0053] 本發(fā)明的第七方面，提供了一套單增李斯特菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，包括 以下步驟：
[0054] ①人工合成單增李斯特菌的內(nèi)化素 InlA基因序列和/或單增李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激 活調(diào)節(jié)蛋白基因 prfA基因序列，所述單增李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)蛋白基因 prfA基因序 列和所述內(nèi)化素 InlA表達(dá)基因序列分別如SEQ ID NO.