本發(fā)明涉及生化分離工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種膨脹床法分離純化藻藍(lán)蛋白的方法。

背景技術(shù)：

藻藍(lán)蛋白是一種天然的蛋白資源，應(yīng)用前景可觀。但由于傳統(tǒng)藻藍(lán)蛋白分離純化過程步驟繁瑣、耗時(shí)多、處理量低的原因，使得分離純化的成本高，限制了藻藍(lán)蛋白的廣泛應(yīng)用。21世紀(jì)以來藻藍(lán)蛋白的作用備受關(guān)注，尤其是關(guān)于藻藍(lán)蛋白的提取和純化方面的研究很多，但是在已知的技術(shù)中藻藍(lán)蛋白的純度得率不高。日本DIC是世界上以及有些文獻(xiàn)中發(fā)表的方法，則完全局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，包括鹽析、凝膠過濾，吸附色譜，離子交換色譜，以及其它更昂貴的方法，這些方法大多不適于制備食品色素級的產(chǎn)品。這些方法首先成本高，第二得到的純度不高。隨著藻藍(lán)蛋白熒光試劑的深入研究和進(jìn)一步的推廣使用，要實(shí)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白在熒光探針等生物化學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用，必需做到提取成本相對降低和純度達(dá)到很高的要求。

藻藍(lán)蛋白雖然用途很多，但其受到分離純化過程的成本高限制，未能得到廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)分離純化過程是細(xì)胞破壁后的藻藍(lán)蛋白溶液經(jīng)硫酸銨鹽沉淀、離心和透析后得到藻藍(lán)蛋白粗提取物，然后選用兩種或兩種以上的傳統(tǒng)色譜方法進(jìn)一步純化。其最大的缺點(diǎn)在于分離純化過程步驟多，導(dǎo)致產(chǎn)率降低、成本增加。

膨脹床吸附是近年出現(xiàn)的一種新型生物分離技術(shù)，具有集成化優(yōu)勢，可以直接從含有顆粒的料液中捕獲目標(biāo)產(chǎn)物，集料液澄清、目標(biāo)產(chǎn)物濃縮和分離純化為一體，從而達(dá)到簡化操作步驟，提高產(chǎn)品收率，降低生產(chǎn)成本的目的。膨脹床吸附技術(shù)現(xiàn)已成功用于各種未澄清粗提液中直接捕獲蛋白質(zhì)等生物制品的領(lǐng)域，如E.coli勻漿、酵母發(fā)酵液、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液、牛奶和動(dòng)物組織提取物等，也有應(yīng)用在天然產(chǎn)物小分子物質(zhì)分離領(lǐng)域中。膨脹床兼有固定床和流化床的優(yōu)點(diǎn)和集成化的特點(diǎn)，降低了分離純化的成本，該技術(shù)在藻藍(lán)蛋白分離純化過程中的應(yīng)用為實(shí)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白生產(chǎn)的規(guī)?；峁┝丝赡堋?/p>

目前，缺乏一種產(chǎn)率高，成本低的膨脹床法分離純化藻藍(lán)蛋白的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)率高，成本低的膨脹床法分離純化藻藍(lán)蛋白的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：本發(fā)明的一種膨脹床法分離純化藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)制備藻藍(lán)蛋白粗提液：稱取螺旋藻干粉，用反復(fù)凍融法進(jìn)行細(xì)胞破壁，提取藻藍(lán)蛋白；

(2)吸附劑Streamline DEAE靜態(tài)吸附藻藍(lán)蛋白；

(3)膨脹床吸附分離藻藍(lán)蛋白。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，以螺旋藻干粉與磷酸鈉鹽緩沖液的固液比為1:150g/mL，在-20℃和37℃反復(fù)凍融5次，每次凍融時(shí)間為4h；將凍融5次后的破壁液于5000rpm下離心30min，收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)藏備用。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，稱取0.15g吸附劑Streamline DEAE于50mL的具塞三角瓶中，并加入藻藍(lán)蛋白粗提液，在200rpm/min，25℃下進(jìn)行恒溫振蕩吸附；吸附1.5小時(shí)后取上清液取樣一次。

更進(jìn)一步地，在步驟(3)中，將吸附劑Streamline DEAE裝入膨脹柱中，打開出水口，使吸附劑Streamline DEAE均勻沉降，達(dá)到沉降床層高度為H0＝10.0cm時(shí)，停止加入吸附劑并關(guān)閉出水口，最后使柱中吸附劑表面上留有1cm高度的溶液；

用蠕動(dòng)泵將平衡緩沖液從膨脹床底部入口泵入柱中，吸附劑Streamline DEAE在柱中不斷向上移動(dòng)，當(dāng)上升至膨脹床層高度為H為20.0cm不再上升時(shí)，將頂部調(diào)節(jié)器固定在床層上1-2cm處，繼續(xù)平衡20-30min，使床層穩(wěn)定；

待膨脹床穩(wěn)定后，將進(jìn)口流體從平衡緩沖液切換成藻藍(lán)蛋白粗提液，開始進(jìn)樣，整個(gè)吸附過程中，控制進(jìn)樣流速，保持膨脹床層的膨脹率穩(wěn)定；用自動(dòng)部分收集器每2min收集一次流出液；停止進(jìn)樣后，進(jìn)口流體從藻藍(lán)蛋白粗提液切換成平衡緩沖液，進(jìn)行向上沖洗，去除膨脹床中的雜質(zhì)和弱結(jié)合蛋白，制得藻藍(lán)蛋白。

進(jìn)一步地，在步驟(3)中，所述膨脹柱為400mm×16mm。

進(jìn)一步地，在步驟(3)中，所述緩沖液為25mM中性磷酸鈉鹽緩沖液。

有益效果：本發(fā)明以螺旋藻為對象，采用膨脹床吸附技術(shù)來分離純化藻藍(lán)蛋白，提高產(chǎn)品的收率和純度，產(chǎn)率高，縮短操作時(shí)間，降低成本，再生性能好，可重復(fù)使用，適合規(guī)?；a(chǎn)。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)膨脹床吸附技術(shù)是一種集料液澄清、目標(biāo)產(chǎn)物濃縮和分離純化為一體的新型生物分離技術(shù)，可以作為經(jīng)濟(jì)、高效、適合規(guī)模化生產(chǎn)的純化方法，在獲得高產(chǎn)品純度和收率的同時(shí)也能夠保持產(chǎn)品的生物活性。采用該技術(shù)代替?zhèn)?統(tǒng)純化方法可以直接從細(xì)胞破壁后的藻藍(lán)蛋白溶液中捕獲藻藍(lán)蛋白，大大簡化操作步驟。

(2)膨脹床法分離純化藻藍(lán)蛋白，具有集成化優(yōu)點(diǎn)，減少了傳統(tǒng)純化方法中的離心、蛋白沉淀、透析等步驟，可快速有效的富集分離藻藍(lán)蛋白，藻藍(lán)蛋白的光譜純度(A_620nm/A_280nm)可由粗提液的0.23最高提高至2.02，藻藍(lán)蛋白濃度從粗提液的0.17mg/mL提高為2.15mg/mL，膨脹床分離富集藻藍(lán)蛋白的回收率為59.45％。

(3)吸附劑顆粒在膨脹床中的膨脹率E(H/H0)隨著流體流速的增加而增加。粒徑和密度小的吸附劑在膨脹床中的膨脹率高?；诳左w積因素，建立了形成不同膨脹率的大孔樹脂膨脹床的流體流速預(yù)測模型。膨脹床法代替?zhèn)鹘y(tǒng)分離純化方法，省去離心、蛋白沉淀、透析等步驟，減少了步驟，提高產(chǎn)率，降低成本。

附圖說明

圖1是藻藍(lán)蛋白粗提液顏色隨pH變化圖；

圖2是在不同鹽濃度粗提液中藻藍(lán)蛋白的吸附量隨時(shí)間變化圖；

圖3是離子強(qiáng)度對吸附效率的影響圖；

圖4是pH對藻藍(lán)蛋白吸附的影響圖；

圖5是pH對吸附前后上清液藻藍(lán)蛋白純度的影響圖；

圖6是固液比對藻藍(lán)蛋白吸附的影響圖；

圖7是固液比對吸附后上清液純度的影響圖；

圖8是溫度對藻藍(lán)蛋白吸附的影響圖；

圖9是藻藍(lán)蛋白膨脹床吸附的穿透曲線圖；

圖10是藻藍(lán)蛋白吸附量隨進(jìn)樣體積變化圖；

圖11是沖洗階段A620nm變化圖；

圖12是藻藍(lán)蛋白洗脫曲線圖；

圖13是洗脫組分的藻藍(lán)蛋白純度圖；

圖14是洗脫速度對藻藍(lán)蛋白洗脫的影響圖。

具體實(shí)施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合圖及具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

螺旋藻干粉，賜百年生物科技有限公司提供；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、疊氮化鈉、氯化鈉、硫酸銨、濃鹽酸、檸檬酸、甘氨酸、醋酸、異丙醇、乙醇，試劑均為分析純(AR)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膨脹床吸附劑Streamline DEAE，購自GE healthcare公司。

玻璃層析柱(規(guī)格：400mm×16mm，液體分布器為200目絲網(wǎng))，上海錦華層析設(shè)備廠；BT100-2J DG-2(10滾輪)型蠕動(dòng)泵，河南保定蘭格恒流泵有限公司；FA2004電子天平，CH1010超級恒溫水浴，上海衡平儀器儀表廠；TDL-60B低速臺(tái)式離心機(jī)，常州諾基儀器有限公司；BSZ型自動(dòng)部分收集器，上海瀘西分析儀器廠有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；S-25型pH計(jì)，上海精科雷磁公司；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；THZ-82型恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

本發(fā)明的一種膨脹床法分離純化藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)制備藻藍(lán)蛋白粗提液：稱取螺旋藻干粉，用反復(fù)凍融法進(jìn)行細(xì)胞破壁，提取藻藍(lán)蛋白；

(2)吸附劑Streamline DEAE靜態(tài)吸附藻藍(lán)蛋白；

(3)膨脹床吸附分離藻藍(lán)蛋白。

在步驟(1)中，以螺旋藻干粉與磷酸鈉鹽緩沖液的固液比為1:150g/mL，在-20℃和37℃反復(fù)凍融5次，每次凍融時(shí)間為4h；將凍融5次后的破壁液于5000rpm下離心30min，收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)藏備用。

在步驟(2)中，稱取0.15g吸附劑Streamline DEAE于50mL的具塞三角瓶中，并加入藻藍(lán)蛋白粗提液，在200rpm/min，25℃下進(jìn)行恒溫振蕩吸附；吸附1.5小時(shí)后取上清液取樣一次。

在步驟(3)中，將吸附劑Streamline DEAE裝入膨脹柱中，打開出水口，使吸附劑Streamline DEAE均勻沉降，達(dá)到沉降床層高度為H0＝10.0cm時(shí)，停止加入吸附劑并關(guān)閉出水口，最后使柱中吸附劑表面上留有1cm高度的溶液；

用蠕動(dòng)泵將平衡緩沖液從膨脹床底部入口泵入柱中，吸附劑Streamline DEAE在柱中不斷向上移動(dòng)，當(dāng)上升至膨脹床層高度為H為20.0cm不再上升時(shí)，將頂部調(diào)節(jié)器固定在床層上1-2cm處，繼續(xù)平衡20-30min，使床層穩(wěn)定；

待膨脹床穩(wěn)定后，將進(jìn)口流體從平衡緩沖液切換成藻藍(lán)蛋白粗提液，開始進(jìn)樣，整個(gè)吸附過程中，控制進(jìn)樣流速，保持膨脹床層的膨脹率穩(wěn)定；用自動(dòng)部分收集器每2min收集一次流出液；停止進(jìn)樣后，進(jìn)口流體從藻藍(lán)蛋白粗提液切換成平衡緩沖液，進(jìn)行向上沖洗，去除膨脹床中的雜質(zhì)和弱結(jié)合蛋白，制得藻藍(lán)蛋白。

所述膨脹柱為400mm×16mm。

所述緩沖液為25mM中性磷酸鈉鹽緩沖液。

實(shí)施例1

緩沖液配制

取39.0mL 0.2mol/L NaH2PO4和61.0mL 0.2mol/L Na2HPO4，充分混合即為0.2mol/L的pH＝7.0磷酸鈉鹽緩沖液。根據(jù)需要，稀釋一定的倍數(shù)，配制成不同濃度的pH＝7.0磷酸鈉鹽緩沖液。

取7.71mL 0.2mol/L Na₂HPO₄和12.29mL 0.1mol/L檸檬酸，充分混合后即為0.1mol/L pH＝4.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。取11.15mL 0.2mol/L Na2HPO4和12.29mL 0.1mol/L檸檬酸，充分混合后即為0.1mol/L pH＝5.4磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，根據(jù)需要配成不同濃度的緩沖液。

取50mL 0.2mol/L甘氨酸和4.0mL 0.2mol/L氫氧化鈉加水稀釋至200mL，即為0.05mol/L pH＝8.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。取50mL 0.2mol/L甘氨酸和32.0mL 0.2mol/L氫氧化鈉加水稀釋至200mL，即為0.05mol/L pH＝10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，根據(jù)需要配成不同濃度的緩沖液。

藻藍(lán)蛋白粗提液制備

稱取螺旋藻干粉，用反復(fù)凍融法進(jìn)行細(xì)胞破壁，提取藻藍(lán)蛋白。提取條件為：以固液比(m(g):V(mL))＝1:150加入25mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.0)，在-20℃和37℃反復(fù)凍融5次，每次凍融時(shí)間為4h。將凍融5次后的破壁液于5000rpm下離心30min，收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)藏備用。粗提取藻藍(lán)蛋白的得率YPC按式(1)計(jì)算。

$Y_{PC}=\frac{m_{PC}}{m_0}=\frac{C_{PC}\×V}{m_0}---\left(1\right)$

(1)式中

YPC—粗提取的藻藍(lán)蛋白得率(mg/g)；

mPC—粗提液中藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量(mg)；

m0—螺旋藻干粉的質(zhì)量(g)；

CPC—粗提液中藻藍(lán)蛋白的含量(mg/mL)；

V—粗提液的體積(mL)。

藻藍(lán)蛋白含量及純度測定

將待測的樣品稀釋至一定倍數(shù)后，用紫外可見分光光度計(jì)分別測定280nm、565nm、620nm和650nm處的吸光度，參考Bennett&Bogorad的公式計(jì)算藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白含量。

$C_{PC}=\frac{A_{620nm}-0.474A_{650nm}}{5.34}---\left(2\right)$

$C_{APC}=\frac{A_{650nm}-0.208A_{620nm}}{5.09}---\left(3\right)$

$C_{PE}=\frac{A_{565nm}-2.41C_{PC}-0.849C_{APC}}{9.62}---\left(4\right)$

(2)、(3)、(4)式中

C_PC、C_APC、C_PE—藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白的含量(mg/mL)；

A280nm、A565nm、A620nm、A650nm—樣品在280nm、565nm、620nm和650nm處的吸光度值。

藻藍(lán)蛋白的純度(purity)由A620nm/A280nm表示。

Streamline DEAE靜態(tài)吸附藻藍(lán)蛋白

稱取一定量的Streamline DEAE(以干重計(jì))于50mL的具塞三角瓶中，并加入一定體積的藻藍(lán)蛋白粗提液，在200rpm/min，25℃下進(jìn)行恒溫振蕩吸附。吸附一段時(shí)間后取上清液，取樣頻率為每1.5小時(shí)取樣一次。取得的上清液稀釋一定倍數(shù)后分別測定280nm、565nm、620nm和650nm處的吸光度，按公式計(jì) 算藻藍(lán)蛋白的含量，并由式(5)、(6)計(jì)算Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白的靜態(tài)吸附容量和吸附效率。

$Q=\frac{(C_{PC,0}-C_{PC,t})V}{m}---\left(5\right)$

$E=\frac{C_{PC,0}-C_{PC,t}}{C_0}\×100\%---\left(6\right)$

(5)、(6)式中

Q—靜態(tài)吸附容量(mg/g吸附劑干重)；

C_PC,0—加入的粗提液中初始的藻藍(lán)蛋白含量(mg/mL)；

C_PC,t—吸附后上清液中的藻藍(lán)蛋白含量(mg/mL)；

V—藻藍(lán)蛋白粗提液體積(mL)；

m—吸附劑Streamline DEAE干重(g)。

E—吸附率(％)。

膨脹床吸附分離藻藍(lán)蛋白

將Streamline DEAE裝入膨脹柱(400mm×16mm)中，緩慢地打開出水口，控制流速，使Streamline DEAE均勻沉降，達(dá)到沉降床層高度為H₀＝10.0cm時(shí)，停止加入吸附劑并關(guān)閉出水口，最后使柱中吸附劑表面上留有1cm左右高度的溶液。用蠕動(dòng)泵將平衡緩沖液(25mM中性磷酸鈉鹽緩沖液)從膨脹床底部入口泵入柱中，Streamline DEAE在柱中不斷向上移動(dòng)，當(dāng)上升至膨脹床層高度為H為20.0cm不再上升時(shí)，將頂部調(diào)節(jié)器固定在床層上1-2cm處，繼續(xù)平衡20-30min，使床層穩(wěn)定。形成穩(wěn)定膨脹床后，分別對距離柱底為10、12、14、16、18和20cm的區(qū)域進(jìn)行局部取樣，取樣范圍分別為10-12cm、12-14cm、14-16cm、16-18cm和18-20cm。將取得的吸附劑放入10mL量筒中，靜置30-40min后，讀取吸附劑的沉降體積V_s。按公式(7)計(jì)算各區(qū)域內(nèi)的床層間隙率(局部床 層間隙率)，每個(gè)取樣點(diǎn)重復(fù)測定3次，結(jié)果的相對誤差小于5％。獲得局部床層間隙率隨軸向高度變化的規(guī)律。

${\mathrm{\ϵ}}_{lo\mathrm{cal}}=\frac{V^{\′}-V_S}{V^{\′}}---\left(7\right)$

(7)式中_local—局部床層間隙率；

V_S—吸附劑沉降體積(mL)；

V′—局部床層體積，mL。

待膨脹床穩(wěn)定后，將進(jìn)口流體從平衡緩沖液切換成藻藍(lán)蛋白粗提液，開始進(jìn)樣。整個(gè)吸附過程中，控制進(jìn)樣流速，保持膨脹床層的膨脹率穩(wěn)定。用自動(dòng)部分收集器每2min收集一次流出液，測定流出液在620nm和650nm處的吸光度值，計(jì)算藻藍(lán)蛋白的含量。以進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)，流出液與進(jìn)樣粗提液中藻藍(lán)蛋白含量的比值為縱坐標(biāo)，繪制穿透曲線，根據(jù)穿透曲線，由公式(8)計(jì)算出Streamline DEAE膨脹床動(dòng)態(tài)吸附容量。

$Q_d=\frac{C_0\×V_b}{m}---\left(8\right)$

(8)式中

Q_d—?jiǎng)討B(tài)吸附容量(mg/g吸附劑)；

C₀—進(jìn)樣粗提液中藻藍(lán)蛋白含量(mg/mL)；

V_b—穿透曲線10％處所對應(yīng)的進(jìn)樣體積(mL)；

m—吸附劑Streamline DEAE干重(g)。

停止進(jìn)樣后，進(jìn)口流體從藻藍(lán)蛋白粗提液切換成平衡緩沖液，進(jìn)行向上沖洗，去除膨脹床中的雜質(zhì)和弱結(jié)合蛋白。當(dāng)流出液在620nm處測定的吸光度值為0時(shí)，沖洗停止。膨脹床靜置，吸附劑Streamline DEAE沉降。

實(shí)施例2

離子強(qiáng)度對藻藍(lán)蛋白粗提取效率的影響

采用去離子水和不同離子強(qiáng)度的磷酸鈉鹽緩沖液(pH＝7.0)進(jìn)行反復(fù)凍融法提取藻藍(lán)蛋白。結(jié)果如表1所示，表1為不同離子強(qiáng)度對藻藍(lán)蛋白提取效率的影響，25mM磷酸鈉鹽緩沖溶液提取的效果最好，優(yōu)于0mM(去離子水)提取效果，這與緩沖溶液有利于維持藻藍(lán)蛋白構(gòu)象及功能的穩(wěn)定有關(guān)。不同離子強(qiáng)度的磷酸鈉鹽緩沖溶液粗提液中，除了100mM粗提液中的藻藍(lán)蛋白含量和純度偏低以外，其他幾種離子強(qiáng)度緩沖溶液提取的粗提液中各蛋白質(zhì)含量和純度依次下降。說明離子強(qiáng)度過高，溶液極性增強(qiáng)，使得蛋白質(zhì)疏水鏈間的作用力減弱，易自聚發(fā)生鹽析現(xiàn)象，對提取不利。因此，反復(fù)凍融提取藻藍(lán)蛋白時(shí)，選用25mM磷酸鈉鹽緩沖溶液為提取溶劑。

表1

pH對藻藍(lán)蛋白粗提取效率的影響

用pH值分別為4.0、5.4、7.0、8.6和10.0的25mM緩沖溶液反復(fù)凍融提取藻藍(lán)蛋白，考察提取提取溶劑的pH值對藻藍(lán)蛋白粗提取效率的影響。結(jié)果表明，提取溶劑的pH值對粗提液影響很大，不同pH提取溶劑得到的藻藍(lán)蛋白粗提液中藻藍(lán)蛋白含量和純度差別很大，甚至粗提液的顏色發(fā)生明顯變化。如圖1所示，為藻藍(lán)蛋白粗提液顏色隨pH變化圖；從左往右分別是pH為4.0，5.4，7.0， 8.6，10.0的25mM緩沖溶液提取的粗提液。說明水溶液中pH環(huán)境的變化影響到藻藍(lán)蛋白中的生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，從而使得藻藍(lán)蛋白粗提液的顏色產(chǎn)生巨大變化。當(dāng)pH＝4.0，粗提液的藍(lán)色極淺，隨著pH增加至中性，藍(lán)色逐漸加深；當(dāng)pH＝8.6和10.0時(shí)，粗提液的顏色已經(jīng)不再呈藍(lán)色，藻藍(lán)蛋白的色素基團(tuán)被破壞。

不同pH條件下，粗提液中藻藍(lán)蛋白含量和純度如表2所示。表2為溶劑pH對藻藍(lán)蛋白粗提液影響。當(dāng)提取溶劑pH＝4.0和pH＝10.0時(shí)，得到的粗提液中藻藍(lán)蛋白含量和純度極低，分別僅為pH＝5.4和pH＝7.0時(shí)藻藍(lán)蛋白含量的12.42％和11.97％，純度的20.69％和15.38％。由于藻藍(lán)蛋白在酸性或堿性條件下，穩(wěn)定性明顯降低，用酸性或堿性的溶劑進(jìn)行反復(fù)凍融提取藻藍(lán)蛋白，會(huì)導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白含量低，純度低的情況。在pH＝7.0下，粗提液中藻藍(lán)蛋白的純度較pH＝5.4的純度低，分析原因，此時(shí)的溶液呈中性，胞內(nèi)物質(zhì)在中性條件下具有良好的穩(wěn)定性，當(dāng)細(xì)胞破壁提取時(shí)，粗提液中除了藻藍(lán)蛋白外，其他的胞內(nèi)物質(zhì)也會(huì)增多，造成了pH＝7.0下藻藍(lán)蛋白的純度偏低。綜合藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性和純度考慮，采用中性緩沖液對藻藍(lán)蛋白進(jìn)行粗提取。

表2

實(shí)施例3

離子強(qiáng)度對藻藍(lán)蛋白吸附的影響

Streamline DEAE屬于陰離子交換樹脂，離子強(qiáng)度會(huì)影響其吸附效果。圖2為Streamline DEAE自不同離子強(qiáng)度粗提液中吸附藻藍(lán)蛋白的吸附量隨時(shí)間變化圖。從該圖結(jié)果可以看出，Streamline DEAE吸附藻藍(lán)蛋白的吸附速度快，吸附1.5h后，Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白的吸附幾乎達(dá)到平衡。從結(jié)果還可以看出Streamline DEAE自25mM的粗提緩沖溶液中對藻藍(lán)蛋白的吸附容量最高，是濃度為100mM的緩沖液中吸附量的1.85倍。當(dāng)溶液中鹽濃度超過25mM后吸附容量隨著離子強(qiáng)度的增加而減小。由于Streamline DEAE是離子交換樹脂，體系中的離子強(qiáng)度的變換會(huì)影響其表面與吸附質(zhì)的靜電作用，電解質(zhì)離子還會(huì)與吸附質(zhì)離子產(chǎn)生離子交換競爭進(jìn)而影響吸附效果。結(jié)果還可以看到，Streamline DEAE在濃度為25mM的粗提緩沖溶液中的吸附效果優(yōu)于0mM的粗提緩沖溶液條件下，說明溶液中具有一定的低離子強(qiáng)度可以有助于吸附質(zhì)的吸附，對吸附有利。圖3為Streamline DEAE在不同離子強(qiáng)度下，對藻藍(lán)蛋白靜態(tài)吸附3h的吸附。

pH對藻藍(lán)蛋白吸附的影響

圖4所示為pH值對Streamline DEAE吸附藻藍(lán)蛋白的影響。從圖中可以看出，pH為6-7時(shí)，藻藍(lán)蛋白的吸附容量高，pH7.0以后，隨著pH值的增加，吸附容量逐漸減少。當(dāng)pH調(diào)至4.0時(shí)，粗提液中開始出現(xiàn)部分蛋白沉淀，溶液變渾濁，這樣造成吸附初始藻藍(lán)蛋白含量減少，純度降低。分析原因，pH4.0為藻藍(lán)蛋白等電點(diǎn)附近，分子間雙電層結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)分子容易發(fā)生相互聚集沉淀。另一方面，Streamline DEAE為弱堿性陰離子交換樹脂，在酸性條件下，吸附劑的吸附性能大大降低，在中性條件下，藻藍(lán)蛋白帶有負(fù)電荷，與吸附劑上的配基作用增強(qiáng)，易于吸附，但隨著堿性增加，在pH>9.0時(shí)，因堿性條件下的藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性差部分發(fā)生變性，使得粗提液中藻藍(lán)蛋白含量及純度低。而 且pH增加，吸附劑上的配基離子化程度減弱，也導(dǎo)致吸附容量降低。

吸附前后粗提液中A_620nm/A_280nm變化見圖5。結(jié)果表明在pH＝7.0條件下，Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白吸附具有較好的選擇性，吸附前后上清液純度由0.28變?yōu)?.13。因此，選擇pH7.0條件下，Streamline DEAE吸附藻藍(lán)蛋白。

固液比對藻藍(lán)蛋白吸附的影響

圖6所示為改變吸附劑干重與加入藻藍(lán)蛋白粗提液體積比對藻藍(lán)蛋白靜態(tài)吸附的影響。從圖中結(jié)果表明，隨著Streamline DEAE干重與藻藍(lán)蛋白粗提液體積的比值減小，Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白的吸附容量增加，固液比1:400的吸附容量是1:150的1.95倍，分別為42.64mg/g吸附劑和21.90mg/g吸附劑。但固液比為1:300之后，Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白的吸附容量的增加量明顯減少。說明此固液比下，Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白的吸附幾乎達(dá)到飽和，繼續(xù)減小固液比值，增加藻藍(lán)蛋白體積，吸附容量的增加量不多。

從固液比對吸附后上清液純度影響圖7可以看出，純度(A_620nm/A_280nm)的值隨固液比值減小而增加，說明增加加入的藻藍(lán)蛋白粗提液體積，Streamline DEAE除了對藻藍(lán)蛋白的吸附容量增加，對雜質(zhì)蛋白的吸附也有所增加。因此，考慮Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白的吸附容量和吸附選擇性，將固液比1:300作為吸附的最佳固液比。

溫度對藻藍(lán)蛋白吸附的影響

在藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性允許的溫度范圍內(nèi)，考察溫度對藻藍(lán)蛋白吸附的影響，結(jié)果如圖8所示。在20℃條件下，Streamline DEAE吸附藻藍(lán)蛋白的吸附容量最高，隨著溫度的升高，藻藍(lán)蛋白的吸附容量減少。說明較低溫度下有利于藻藍(lán)蛋白的吸附，Streamline DEAE吸附藻藍(lán)蛋白過程可能是放熱過程。在不同的溫度吸附下，吸附后上清液純度(A_620nm/A_280nm)隨著溫度的升高而增加，因?yàn)闇囟壬?高，分子運(yùn)動(dòng)加快，藻藍(lán)蛋白吸附和解吸速度加快，溫度高時(shí)不利于藻藍(lán)蛋白的吸附，高溫有利于解吸，最終使得吸附后的上清液純度增加。

實(shí)施例4

Streamline DEAE膨脹床吸附藻藍(lán)蛋白

形成穩(wěn)定的膨脹床后，切換泵入藻藍(lán)蛋白粗提液(濃度0.1734mg/mL,純度A620nm/A280nm0.23)，流出液收集頻率為14.2mL/2min。隨著藻藍(lán)蛋白粗提液不斷地進(jìn)入膨脹床，Streamline DEAE顏色逐漸由白色變?yōu)樗{(lán)色，流出液的顏色為淺藍(lán)綠色。吸附過程中，由于吸附劑對藻藍(lán)蛋白的吸附，使其密度有所增加，造成相同流速下，膨脹率降低；另一方面，藻藍(lán)蛋白粗提液的料液性質(zhì)與平衡緩沖液不同，會(huì)造成膨脹率的變化。所以，隨著進(jìn)樣體積的增加，膨脹床高度略有所下降，根據(jù)Streamline DEAE的U-E關(guān)系，適當(dāng)控制進(jìn)樣流速，保持恒定的膨脹率，以維持吸附操作條件穩(wěn)定。

根據(jù)進(jìn)樣體積和流出液與粗提液藻藍(lán)蛋白含量的比值，得到藻藍(lán)蛋白膨脹床吸附的穿透曲線，如圖9所示。由曲線可知C/C₀＝0.1時(shí)，進(jìn)樣體積為227.2mL，Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白的膨脹床動(dòng)態(tài)吸附容量為9.24mg/g吸附劑(干重)。動(dòng)態(tài)吸附容量值低于靜態(tài)吸附最佳固液比下的藻藍(lán)蛋白吸附容量值，是因?yàn)閯?dòng)態(tài)吸附過程中，吸附質(zhì)與吸附劑接觸時(shí)間短，固液相達(dá)到平衡的時(shí)間不充分。

圖10所示為Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白吸附量隨進(jìn)樣體積的變化。當(dāng)進(jìn)樣體積為1050.8mL后，藻藍(lán)蛋白自粗提液中被吸附的量明顯降低，C/C0也增加，而C0在進(jìn)樣時(shí)保持不變，說明藻藍(lán)蛋白濃度開始急速增加。故在進(jìn)樣體積為1050.8mL后，停止進(jìn)樣，此時(shí)C/C0＝0.33，最大進(jìn)樣量為1050.8mL。該最大進(jìn)樣體積與靜態(tài)吸附最佳固液比確定的進(jìn)樣體積(1278.8mL)相比，是其的82.2％，誤差主要還是來源于動(dòng)態(tài)吸附過程與靜態(tài)吸附過程的差異。整個(gè)膨脹床吸附過 程的吸附效率為80.15％。

圖11所示為停止進(jìn)樣后，通過沖洗去除膨脹床中雜質(zhì)和弱結(jié)合蛋白的結(jié)果。在沖洗階段過程中，膨脹床中的Streamline DEAE吸附劑的膨脹率仍保持為2.0左右，用平衡緩沖液向上沖洗膨脹床，至流出液無色，洗出的流出液A_620nm回到基線，所用沖洗體積大約為397.6mL(約20SBV)。

實(shí)施例5

洗脫液離子強(qiáng)度對洗脫效果的影響

結(jié)果可知，在高濃度的磷酸鈉鹽緩沖液(PBS)中，Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白的吸附效率低，不利于藻藍(lán)蛋白在Streamline DEAE上的吸附。根據(jù)此研究結(jié)果，以500mM磷酸鈉鹽緩沖溶液(pH＝7.0)進(jìn)行洗脫，并以此作為研究離子強(qiáng)度對洗脫效果影響的實(shí)驗(yàn)基本點(diǎn)，考察不同離子強(qiáng)度下的洗脫效果，結(jié)果如圖3-14所示。圖3-14為不同離子強(qiáng)度下，各洗脫組分中的藻藍(lán)蛋白純度。

由圖12所示，各洗脫曲線中均出現(xiàn)對稱的尖峰，說明高離子強(qiáng)度的緩沖液對藻藍(lán)蛋白的洗脫效果好，能夠?qū)⒃逅{(lán)蛋白從Streamline DEAE上很好地洗脫下來。當(dāng)洗脫體積約為100mL(5SBV)后，A_620nm值幾乎不變，藻藍(lán)蛋白的洗脫達(dá)到平衡，確定洗脫實(shí)驗(yàn)的洗脫液用量為5個(gè)固定床體積。另外，隨著離子強(qiáng)度進(jìn)一步增加，洗脫的尖峰峰寬越窄，峰頂處A_620nm值越高。分別收集500mM PBS、500mM PBS+0.25M NaCl和500mM PBS+0.5M NaCl洗脫液洗脫下來的6-14min的藍(lán)色組分，藻藍(lán)蛋白含量分別為2.15、2.53和2.54mg/mL，洗脫回收率R分別為74.18％、81.34％和80.76％。說明離子強(qiáng)度越高，對藻藍(lán)蛋白的洗脫能力越強(qiáng)。

與此同時(shí)，離子強(qiáng)度越高，洗脫組分中藻藍(lán)蛋白所能達(dá)到的最高純度(A_620nm/A_280nm)越低，依次為2.02、1.76和1.56，如圖13所示。合并藍(lán)色洗脫組分，得到的藻藍(lán)蛋白純度分別為0.94、0.70和0.58。分析原因，離子強(qiáng)度的 增加，不僅削弱了吸附劑與藻藍(lán)蛋白之間的相互結(jié)合作用力，而且減弱了雜質(zhì)蛋白的吸附作用力，離子強(qiáng)度越高，雜質(zhì)蛋白洗脫越多，導(dǎo)致洗脫組分的純度越低。在500mM磷酸鈉鹽緩沖液+0.25M NaCl和500mM磷酸鈉鹽緩沖液+0.5M NaCl洗脫液洗脫下，洗脫組分中藻藍(lán)蛋白的純度都有出現(xiàn)突然增加的情況，含有0.5M NaCl的洗脫液更為明顯，這是因?yàn)殡s蛋白先于藻藍(lán)蛋白洗脫下來，離子強(qiáng)度增加，洗脫能力強(qiáng)，洗脫下來的雜蛋白比不加NaCl的溶液洗脫的多，隨著洗脫體積增加，藻藍(lán)蛋白后洗脫下來，所以藻藍(lán)蛋白的純度又會(huì)有所提高。

綜合考慮藻藍(lán)蛋白的洗脫回收率和藻藍(lán)蛋白的純度，選擇500mM磷酸鈉鹽緩沖溶液(pH＝7.0)為適合的洗脫液，其對藻藍(lán)蛋白的洗脫效果好，合并藍(lán)色組分，最后得到的藻藍(lán)蛋白濃度為2.15mg/mL，純度為0.94，整個(gè)洗脫過程的洗脫回收率為74.18％。

洗脫速度對洗脫效果的影響

用500mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH＝7.0)以不同速度對膨脹床吸附的藻藍(lán)蛋白進(jìn)行洗脫，不同洗脫速度下藻藍(lán)蛋白的洗脫曲線如圖14所示。從圖14可以看出洗脫速度對洗脫曲線的影響并不明顯，在較高洗脫流速150cm/h下，洗脫峰略有拖尾現(xiàn)象，在較低流速80cm/h下，洗脫峰較為集中。但不同流速下，合并收集16-56mL的藍(lán)色組分中藻藍(lán)蛋白的純度差異大，如表3所示。表3為不同洗脫速度下，收集組分中藻藍(lán)蛋白的含量及純度；

表3

組分中藻藍(lán)蛋白的純度分別為0.65、0.94和1.00，低流速下的純度小于較高流速下的純度，因?yàn)樵谙疵撍俣鹊偷那闆r下，當(dāng)洗脫體積一定時(shí)，洗脫時(shí)間相對延長，雜質(zhì)蛋白的洗脫量增加，造成收集的洗脫組分純度降低。因此，在對藻藍(lán)蛋白進(jìn)行洗脫操作時(shí)，應(yīng)該選擇適中的洗脫流速，既能保證藻藍(lán)蛋白可以有效地洗脫下來，也能獲得藻藍(lán)蛋白純度較高的洗脫組分。

本發(fā)明中，采用反復(fù)凍融法粗提取藻藍(lán)蛋白的最佳條件為：提取溶劑為pH＝7.0，25mM的磷酸鈉鹽緩沖溶液，提取得率為26.01-32.27mg/g藻干粉，得到的藻藍(lán)蛋白粗提液中藻藍(lán)蛋白的含量為0.1734-0.2151mg/mL，純度為0.23-0.28。

Streamline DEAE對藻藍(lán)蛋白的吸附受溶液中鹽濃度、pH、固液比和溫度等因素的影響。通過比較靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇出藻藍(lán)蛋白的最佳吸附條件，條件為：在pH為7.0，25mM磷酸鈉鹽緩沖溶液中，以固液比1:300加入藻藍(lán)蛋白粗提液，20℃下恒溫吸附3h，吸附容量為45.21mg/g吸附劑(干重)。

在膨脹柱規(guī)格為16mm×400mm的Streamline DEAE膨脹床中，進(jìn)行膨脹床吸附藻藍(lán)蛋白操作。固定床層高度為10.0cm，進(jìn)樣流速為201.5cm/h，膨脹率E＝2.0，最大進(jìn)樣體積為1050.8mL(約52SBV)，即C/C₀＝0.33，膨脹床吸附過程的吸附效率為80.15％。吸附后用397.6mL(約20SBV)平衡緩沖液沖洗膨脹柱，以除去雜質(zhì)微粒及弱結(jié)合蛋白。

Streamline DEAE吸附藻藍(lán)蛋白的最佳洗脫操作條件為：固定床模式向下洗脫，洗脫流速為120cm/h，洗脫液為500mM磷酸鈉鹽緩沖溶液(pH＝7.0)，洗脫液用量100mL，洗脫峰的藻藍(lán)蛋白純度為2.02，收集合并藍(lán)色洗脫組分，得到的藻藍(lán)蛋白溶液含量為2.15mg/mL，純度為1.00，藻藍(lán)蛋白回收率為74.18％。通過膨脹床吸附，藻藍(lán)蛋白含量從粗提液的0.17mg/mL提高為2.15mg/mL，濃縮 10倍以上，藻藍(lán)蛋白純度提高4倍，從0.23到1.00，藻藍(lán)蛋白回收率為59.45％。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。