一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，用尺寸排阻色譜填料、反向色譜填料或離子交換色譜填料作為固定相填料，將固定相填料與蛋白質(zhì)混合物混合后，先加入一個強(qiáng)度的洗脫緩沖液，充分混合并離心處理，收集洗脫緩沖液，再將固定相填料依次用不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液洗脫，分別離心處理并收集洗脫緩沖液，基于蛋白質(zhì)混合物中不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)被分別收集到不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液中，實現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物的預(yù)分離。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的預(yù)分離方法不僅處理容量無限制，非常有利于多維分離；而且儀器設(shè)備易得，分析成本低，操作也非常簡便快速，適用于蛋白質(zhì)的高分辨高效預(yù)分離。
【專利說明】
一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的預(yù)分離方法，主要涉及與生物質(zhì)譜相關(guān)的系統(tǒng)生物學(xué)、 蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近兩三年來，系統(tǒng)生物學(xué)成為了生物學(xué)的前沿研究方向，旨在系統(tǒng)研究人體疾病 發(fā)生發(fā)展統(tǒng)計規(guī)律，從而實現(xiàn)個性化藥物，也就是疾病的早預(yù)防、早診斷，和早治療；同時也 利用疾病標(biāo)志物進(jìn)行藥物研發(fā)及治療效果評估。疾病標(biāo)志物一般是蛋白質(zhì);這些標(biāo)志蛋白 需從復(fù)雜的人體蛋白質(zhì)混合物中定性定量鑒定出來;這個工作目前主要是由高效液相色 譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析來完成。由于蛋白質(zhì)混合物往往包含數(shù)十萬到數(shù)百萬個蛋白，復(fù)雜性極 高，質(zhì)譜檢測上游往往需要多維(包括反相色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜等)預(yù)分離與 分離。反相色譜因其洗脫流動相與質(zhì)譜兼容，且同時具有高分辨的特點，一般被用在最后一 維與質(zhì)譜連用，實現(xiàn)在線分離分析;反相上游的預(yù)分離一般也是在色譜柱中進(jìn)行的，且需要 價格較昂貴的高壓色譜栗來提供洗脫用的高壓流動相。本發(fā)明發(fā)展了一種基于非色譜柱的 預(yù)分離方法，能取得同樣的預(yù)分餾效果;但避免了整套高效液相色譜儀器，大大節(jié)約了成 本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種簡便經(jīng)濟(jì)、高 效、高分辨的蛋白質(zhì)預(yù)分離方法。
[0004] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0005] -種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，用尺寸排阻色譜填料、反向色譜填料或離子交換色譜填 料作為固定相填料，將固定相填料與蛋白質(zhì)混合物混合后，先加入一個強(qiáng)度的洗脫緩沖液， 充分混合并離心處理，收集洗脫緩沖液，再將固定相填料依次用不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液洗 脫，分別離心處理并收集洗脫緩沖液，基于蛋白質(zhì)混合物中不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)被分別收集 到不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液中，實現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物的預(yù)分離。
[0006] 基于蛋白質(zhì)混合物中不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)，是指按蛋白質(zhì)大小、疏水性、所帶電荷數(shù) 量等進(jìn)行區(qū)分的蛋白質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式為，以反向色譜填料作為固定相填料，將固定相填料 與蛋白質(zhì)混合物混合后，先加入一個強(qiáng)度的洗脫緩沖液，充分混合并離心處理，收集洗脫緩 沖液，再將固定相填料依次用不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液洗脫，分別離心處理并單獨收集洗脫 緩沖液，基于蛋白質(zhì)混合物中疏水性不同的蛋白質(zhì)被分別收集到不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液 中，實現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物按疏水性不同的預(yù)分離。
[0008] 對于上述優(yōu)選實施方式，具體包括以下步驟：
[0009] (1)將反相色譜填料與蛋白質(zhì)混合物混合后，加入一級洗脫緩沖液，充分混合后， 離心后，液相即為一級洗脫緩沖液，固相為反相色譜填料；
[0010] (2)將上步驟處理后的反相色譜填料，依次用二級~五級洗脫緩沖液洗脫，分別離 心處理并單獨收集不同級別的洗脫緩沖液，基于蛋白質(zhì)混合物中疏水性不同的蛋白質(zhì)被分 別收集到不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液中，實現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物按疏水性不同的預(yù)分離。
[0011] 進(jìn)一步的，所述的反相色譜填料優(yōu)選為反相C5填料，所述的反相C5填料經(jīng)色譜純 乙腈潤濕處理后使用。
[0012] 進(jìn)一步的，所述的蛋白質(zhì)混合物為大腸桿菌蛋白質(zhì)溶液。
[0013] 進(jìn)一步的，所述的一級洗脫緩沖液~五級洗脫緩沖液分別由不同體積比的A緩沖 液與B緩沖液配制而成。在針對不同蛋白質(zhì)混合物時，洗脫緩沖液的級數(shù)不僅僅限定為五 級，可以采用更多級或更少級，級數(shù)要求是能夠滿足蛋白質(zhì)按不同性質(zhì)能夠分離。
[0014] 進(jìn)一步的，所述的一級洗脫緩沖液~五級洗脫緩沖液中，B緩沖液的體積比分別為 30%、40%、60%、80 %以及100 %。在針對不同蛋白質(zhì)混合物時，不同級數(shù)洗脫緩沖液的組 成可以變化，可以采用不同的A緩沖液與B緩沖液的配比，不同級數(shù)洗脫緩沖液的組成要求 是能夠滿足蛋白質(zhì)按不同性質(zhì)能夠分離。
[0015]進(jìn)一步的，所述的緩沖液A的組成按體積比為:95 %水、4.8 %乙腈，0.2 %甲酸;所 述的緩沖液B的組成按體積比為:95%乙腈、4.8%水，0.2%甲酸。在針對不同蛋白質(zhì)混合物 時，A緩沖液與B緩沖液的組成也可以進(jìn)行變化，A緩沖液與B緩沖液的組成滿足在配制成不 同級數(shù)洗脫緩沖液后能夠滿足蛋白質(zhì)按不同性質(zhì)能夠分離的要求。
[0016] 本發(fā)明涉及的方法同樣適用于多肽混合物和其他混合物的預(yù)分離。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的預(yù)分離方法基于所述蛋白混合物與色譜填料的不同結(jié) 合力，用不同洗脫強(qiáng)度的緩沖液借助離心分步進(jìn)行分離。本發(fā)明的預(yù)分離方法對蛋白質(zhì)混 合物進(jìn)行預(yù)分離，分離效率高，操作簡便，所需設(shè)備便宜易得。適用于蛋白質(zhì)混合物的定性 定量分析。
【附圖說明】
[0018] 圖1為基于反相色譜填料和離心分離的大腸桿菌蛋白質(zhì)混合物預(yù)分離實驗流程 圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0020] 實施例1
[0021] 基于反相色譜填料和離心分離的大腸桿菌蛋白質(zhì)混合物預(yù)分離實驗流程如圖1所 示，具體步驟如下：
[0022] (1)反相C5填料的潤濕。過程如下：用分析天平稱取Phenomenex公司Jupiter C5填 料(粒徑5um，表面積300臭)50mg于1.5mL離心管中，用移液槍加入色譜純乙腈500uL，在渦旋 儀上混合10分鐘后離心1分鐘（15000rpm)，傾倒出上層清亮的乙腈。
[0023] (2)大腸桿菌蛋白質(zhì)溶液(0.30ug/uL)66.7uL與30%v/v緩沖液B(另包含70%v/v 緩沖液A) 133.3uL混勻后加入到上述離心管中，在渦旋儀上混合10分鐘后用離心1分鐘 (15000rpm)，用移液槍取出上層清夜，即為30%v/v緩沖液B的餾分;帶填料的離心管繼續(xù)下 一步驟。
[0024] 緩沖液A的組成為:95 %水、4.8 %乙腈，0.2 %甲酸；緩沖液B的組成為:95 %乙腈、 4.8%水，0.2%甲酸;均為體積比。
[0025] (3)于上述步驟(2)中的離心管中加入200uL40 % v/v緩沖液B (同時包含60 % v/v緩 沖液A)，在渦旋儀上混合10分鐘后用離心1分鐘（15000rpm)，用移液槍取出上層清夜，即為 40 % v/v緩沖液B的餾分。
[0026] (4)分別用60% v/v緩沖液B(同時包含40% v/v緩沖液A)、80% v/v緩沖液B(同時包 含20 % v/v緩沖液A)、100 % v/v緩沖液B重復(fù)步驟(3)中的預(yù)分離，分別得到60 % v/v緩沖液 B、80 % v/v緩沖液B和100 % v/v緩沖液B對應(yīng)的餾分。
[0027] 從上述步驟預(yù)分離得到的5個餾分中的蛋白含量用BCA法測定的結(jié)果如表1所示。5 個餾分的總回收率為47.9% ;與基于色譜柱的預(yù)分離的效率相當(dāng)。
[0028]表1大腸桿菌蛋白質(zhì)混合物200ug預(yù)分離結(jié)果
[0030]上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。 熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般 原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng) 域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，其特征在于，用尺寸排阻色譜填料、反向色譜填料或離子交 換色譜填料作為固定相填料，將固定相填料與蛋白質(zhì)混合物混合后，先加入一個強(qiáng)度的洗 脫緩沖液，充分混合并離心處理，收集洗脫緩沖液，再將固定相填料依次用不同強(qiáng)度的洗脫 緩沖液洗脫，分別離心處理并收集洗脫緩沖液，基于蛋白質(zhì)混合物中不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)被 分別收集到不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液中，實現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物的預(yù)分離。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，其特征在于，基于蛋白質(zhì)混合物中不 同性質(zhì)的蛋白質(zhì)，是指按蛋白質(zhì)大小、疏水性、所帶電荷數(shù)量進(jìn)行區(qū)分的蛋白質(zhì)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，其特征在于，以反向色譜填料作為固 定相填料，將固定相填料與蛋白質(zhì)混合物混合后，先加入一個強(qiáng)度的洗脫緩沖液，充分混合 并離心處理，收集洗脫緩沖液，再將固定相填料依次用不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液洗脫，分別離 心處理并單獨收集洗脫緩沖液，基于蛋白質(zhì)混合物中疏水性不同的蛋白質(zhì)被分別收集到不 同強(qiáng)度的洗脫緩沖液中，實現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物按疏水性不同的預(yù)分離。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，其特征在于，具體包括以下步驟： (1) 將反相色譜填料與蛋白質(zhì)混合物混合后，加入一級洗脫緩沖液，充分混合后，離心 后，液相即為一級洗脫緩沖液，固相為反相色譜填料； (2) 將上步驟處理后的反相色譜填料，依次用二級~五級洗脫緩沖液洗脫，分別離心處 理并單獨收集不同級別的洗脫緩沖液，基于蛋白質(zhì)混合物中疏水性不同的蛋白質(zhì)被分別收 集到不同強(qiáng)度的洗脫緩沖液中，實現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物按疏水性不同的預(yù)分離。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，其特征在于，所述的反相色譜填料優(yōu) 選為反相C5填料，所述的反相C5填料經(jīng)色譜純乙腈潤濕處理后使用。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)混合物為 大腸桿菌蛋白質(zhì)溶液。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，其特征在于，所述的一級洗脫緩沖液 ~五級洗脫緩沖液分別由不同體積比的A緩沖液與B緩沖液配制而成。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，其特征在于，所述的一級洗脫緩沖液 ~五級洗脫緩沖液中，B緩沖液的體積比分別為30%、40%、60%、80%以及100%。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種蛋白質(zhì)預(yù)分離方法，其特征在于，所述的緩沖液A的組成 按體積比為:95%水、4.8%乙腈，0.2%甲酸;所述的緩沖液B的組成按體積比為:95%乙腈、 4.8%水，0.2% 甲酸。
【文檔編號】G01N1/34GK105890960SQ201610296505
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】田志新, 劉琰
【申請人】同濟(jì)大學(xué)