使用含有光響應(yīng)性核酸類的探針的光偶聯(lián)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用含有光響應(yīng)性核酸類的探針進行光偶聯(lián)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，為了對每一個患者建立作為定制治療方案的個性化醫(yī)療，人們提出了闡 明該患者的特定基因多態(tài)性與藥物感受性或藥物響應(yīng)性的關(guān)聯(lián)性的研究。
[0003] 特別是由于基因組科學(xué)的進步，藥代動力學(xué)的闡明和參與藥物反應(yīng)性的酶、蛋白 質(zhì)等的基因多態(tài)性的闡明迅速進行。在人類基因組分析中，單核苷酸多態(tài)性（SNP)作為頻 率最高的基因多態(tài)性標志物一直受到關(guān)注。已知該SNP在明確各種疾病與藥物響應(yīng)的關(guān)聯(lián) 性方面有用。還已知使用多個SNP的單倍型分析在分析疾病感受性方面有用。
[0004] 特別是在醫(yī)療現(xiàn)場，可考慮使用SNP檢測結(jié)果用于疾病罹患率診斷、有效的給予 藥物的選擇、對副作用的預(yù)測等，不僅增加治療效果，還有望貢獻于患者Q0L的提高。
[0005] 對于判別這樣的SNP位點的堿基、即所謂的分型，已報道有很多方法。作為對DNA 的單核苷酸多態(tài)性分型的技術(shù)，TaqMan PCR法或Invader法等作為具有甚至可識別單堿基 置換這樣的高序列選擇性的技術(shù)廣泛已知。
[0006] 但是，在如惡性腫瘤這樣的后天性突變的檢測中，占檢樣材料大部分的來自正常 細胞的野生型核酸分子成為背景噪聲，因此，以上所述的分析方法常常無法高靈敏度地檢 測單堿基置換等的突變。
[0007] 因此，作為取代上述方法的特別有效的分析方法，有人公開了光響應(yīng)性核酸類的 應(yīng)用。雜交的光響應(yīng)性核酸類和靶核酸通過進行特定波長的光照射，可以形成光偶聯(lián)。該光 偶聯(lián)是通過人工堿基部分的光反應(yīng)，在光響應(yīng)性核酸類分子和靶核酸分子之間形成分子間 的共價鍵而產(chǎn)生。這樣進行了光偶聯(lián)的分子與分子并不是只以單純的熱穩(wěn)定性進行締合， 因此即使置于互補雙鏈可以解離的條件下也不會發(fā)生解離，依然結(jié)合（專利文獻1)。
[0008] 還基于光響應(yīng)性核酸類的性質(zhì)即光偶聯(lián)反應(yīng)以1秒左右極迅速地進行、以及未完 全雜交則不發(fā)生光偶聯(lián)的認識，公開了使用光響應(yīng)性核酸類的檢測突變型基因的分析方法 (專利文獻2)。
[0009] 專利文獻1和2中，對于使用光響應(yīng)性核酸類的SNP的確定進行了公開，但只是根 據(jù)含有光響應(yīng)性核酸類的探針在與具有互補序列的靶位點雜交時進行光偶聯(lián)的認識，公開 了光響應(yīng)性核酸類的使用對于突變型基因的選擇性擴增有用的例子。
[0010] 因此，根據(jù)這樣的以往的技術(shù)常識，光偶聯(lián)時需要含有光響應(yīng)性核酸類的探針和 具有其互補序列的靶位點雜交，并且光偶聯(lián)是通過光響應(yīng)性核酸類與靶位點或靶位點附近 的靶核酸結(jié)合而形成，因此可以認為光響應(yīng)性核酸類只與具有互補序列的靶位點或靶位點 附近的靶核酸序列結(jié)合。
[0011] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻1 :日本特開2009-254279號公報 專利文獻2 :W02012/033190號公報。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 發(fā)明所要解決的課題 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在含有光響應(yīng)性核酸類的探針（即光偶聯(lián)探針）與靶核酸進行光偶聯(lián) 的反應(yīng)中，與靶核酸的量無關(guān)，只以一定的比例進行光偶聯(lián)，即，光偶聯(lián)發(fā)生停滯。根據(jù)這個 事實進行深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)生光偶聯(lián)停滯的主要原因是由于：由于為了與靶核酸光 偶聯(lián)而進行的光照射，含有光響應(yīng)性核酸類的探針該探針本身在自身序列內(nèi)發(fā)生光偶聯(lián)。 艮P，可推測探針內(nèi)的光響應(yīng)性核酸類和可與該光響應(yīng)性核酸類光偶聯(lián)的堿基締合，發(fā)生光 偶聯(lián)，因此，不能與靶位點雜交和/或不與靶核酸光偶聯(lián)的探針與光照射的時間（能量）相 關(guān)性地累積，結(jié)果，與靶核酸的光偶聯(lián)發(fā)生停滯。
[0013] 并且根據(jù)以往的技術(shù)常識考慮，在選擇性地抑制野生型基因的擴增、而選擇性地 擴增突變型基因時，如專利文獻2所示的使用光響應(yīng)性核酸類的光偶聯(lián)方法的最大優(yōu)勢在 于：通過光進行光偶聯(lián)的靶核酸在PCR反應(yīng)工序中的熱變性工序中不會發(fā)生開裂，即，可以 將通過光進行光偶聯(lián)的靶核酸帶入到非平衡系統(tǒng)中。
[0014] 但是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：在照射可能發(fā)生光偶聯(lián)的波長（365nm)的光時，也不只進行 與靶核酸的光偶聯(lián)，與該靶核酸發(fā)生了光偶聯(lián)的探針由于原本不發(fā)生的光開裂反應(yīng)而一部 分脫離。即，可以認為光偶聯(lián)的反應(yīng)和使光偶聯(lián)開裂的反應(yīng)并行發(fā)生的光平衡狀態(tài)是與靶 核酸的光偶聯(lián)發(fā)生停滯的主要原因。
[0015] 本發(fā)明的目的在于提供：克服使用含有光響應(yīng)性核酸類的探針的與靶核酸的光偶 聯(lián)發(fā)生停滯的問題，使光偶聯(lián)效率提高的方法、試劑盒。
[0016] 解決課題的方案 本發(fā)明人深入研究了解決所述課題的方案，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：為了避免光偶聯(lián)效率的停滯，在 反應(yīng)溶液中，通過抑制含有光響應(yīng)性核酸類的探針在自身序列內(nèi)的光偶聯(lián)來確保該探針的 有效濃度，還通過局部提高靶位點附近的含有光響應(yīng)性核酸類的探針的實質(zhì)性濃度來促進 雜交，使光偶聯(lián)效率提高。
[0017] gp，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。
[0018] [1]光偶聯(lián)方法，該方法是使存在于核酸樣品中的靶位點、和具有與該靶位點互 補的序列且含有光響應(yīng)性核酸類的探針1在反應(yīng)溶液中雜交，通過光照射進行光偶聯(lián)，其 特征在于：抑制該探針1內(nèi)的起因于該光響應(yīng)性核酸類的自身締合，
[2] [1]的光偶聯(lián)方法，其特征在于：通過使與所述探針1具有高互補性的探針2共存， 來抑制該探針1內(nèi)起因于該光響應(yīng)性核酸類的自身締合。
[0019] [3] [1]或[2]的光偶聯(lián)方法，其中，所述高互補性是所述探針1與所述探針2存 在互相互補的關(guān)系，在規(guī)定的光偶聯(lián)條件下，該探針1中的該光響應(yīng)性核酸類在自身內(nèi)發(fā) 生光偶聯(lián)的堿基與探針2雜交。
[0020] [4] [1]_[3]中任一項所述的光偶聯(lián)方法，其中，所述光偶聯(lián)的方法是存在于所述 核酸樣品中的靶位點所具有的靶核酸、與所述探針1的光響應(yīng)性核酸類之間進行光偶聯(lián)。
[0021] [5] [1]-[4]中任一項所述的光偶聯(lián)方法，其中，所述探針2含有光響應(yīng)性核酸 類。
[0022] [6] [1]_[5]中任一項所述的光偶聯(lián)方法，其中，所述探針1和所述探針2含有光 響應(yīng)性核酸類，在該探針1和該探針2的非互補性區(qū)使用具有與該探針1和/或該探針2 互補的序列的探針3,以使存在于該探針1和/或該探針2內(nèi)的光響應(yīng)性核酸類無法在自身 內(nèi)發(fā)生光偶聯(lián)。
[0023] [7] [1]的光偶聯(lián)方法，該方法是將存在于核酸樣品中的靶位點、與該靶位點具有 互補的序列且含有光響應(yīng)性核酸類的探針1、和與該靶位點具有互補的序列且含有靶核酸 的探針4在反應(yīng)溶液中相鄰接地配置，使它們雜交，通過光照射，存在于該探針4中的靶核 酸和該探針1中的該光響應(yīng)性核酸類之間發(fā)生光偶聯(lián)，其特征在于：通過使與該探針1具有 高互補性的探針2共存，抑制該探針1在自身內(nèi)的光偶聯(lián)。
[0024] [8] [1]_[7]中任一項所述的光偶聯(lián)方法，其特征在于：在所述探針1內(nèi)，將與光 響應(yīng)性核酸類發(fā)生自身締合的核酸置換為不與該光響應(yīng)性核酸類發(fā)生光偶聯(lián)的核酸，使用 該探針1來抑制該探針1在自身內(nèi)的光偶聯(lián)。
[0025] [9] [8]所述的光偶聯(lián)方法，其中，不與所述光響應(yīng)性核酸類發(fā)生光偶聯(lián)的核酸是 嘌呤堿基。
[0026] [10] [8]所述的光偶聯(lián)方法，其中，不與所述光響應(yīng)性核酸類發(fā)生光偶聯(lián)的核酸 是將嘧啶環(huán)人工變換而成的合成堿基。
[0027] [11] [1]_[10]中任一項所述的光偶聯(lián)方法，其中，反應(yīng)溶液中存在陰離子性物 質(zhì)。
[0028] [12] [1]_[11]中任一項所述的光偶聯(lián)方法，其特征在于：至少一種光偶聯(lián)探針在 反應(yīng)溶液中以〇? 1 U mol/L以上的濃度存在。
[0029] [13]基因分析方法，該基因分析方法采用[1]_[12]中任一項所述的光偶聯(lián)方 法。
[0030] [14] [13]所述的基因分析方法，其中，所述基因分析方法是基因檢測方法或核酸 擴增方法。
[0031][15]突變型核酸檢測方法，其特征至于：[14]所述的核酸擴增方法是通過選擇 性地擴增含有突變型核酸的靶位點的擴增用核苷酸序列，來檢測該突變型核酸的有無。
[0032] [16]光偶聯(lián)試劑盒，其特征在于：該