一種基于高分辨率熔解曲線判定大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥水平的分子檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種基于高分辨率烙解曲線判定大腸桿菌對(duì)嗟諾酬類藥物耐藥水平 的分子檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗟諾酬類藥物自首次投入使用后，因廣譜高效、抗菌機(jī)制獨(dú)特而被廣泛應(yīng)用于醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域。不合理的使用及復(fù)雜的耐藥機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)該類藥物的耐藥性問題日益嚴(yán)重，嚴(yán) 重制約其使用效果。因此對(duì)該類藥物耐藥問題的研究顯得刻不容緩。然而目前判斷細(xì)菌對(duì) 嗟諾酬類藥物耐藥水平的方法仍W傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)為主，從樣本采集到報(bào)告結(jié)果常需數(shù)天 時(shí)間，阻礙了人們及時(shí)合理地選擇敏感藥物。
[0003] 目前研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)嗟諾酬類藥物耐藥的機(jī)制主要有S類；DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II (回旋酶）與拓?fù)洚悩?gòu)酶IV基因突變導(dǎo)致藥物失去作用位點(diǎn)、質(zhì)粒介導(dǎo)的細(xì)菌對(duì)嗟諾酬類藥 物的抗性、細(xì)菌的主動(dòng)外排機(jī)制。后兩種機(jī)制主要與細(xì)菌的低濃度耐藥有關(guān)，基因的突變和 高濃度耐藥有關(guān)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV，在核酸合成中起調(diào)控DNA拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài) 的作用。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II為Gyrase A和Gyrase B兩個(gè)亞單位構(gòu)成的異四聚體，可共同作 用將DNA正超螺旋的一條單鏈切開、移位、封閉，引入負(fù)超螺旋，在DNA復(fù)制中起重要作用。 拓?fù)洚悩?gòu)酶IV主要功能是通過松弛DNA超螺旋、解除DNA結(jié)節(jié)和解環(huán)連體而發(fā)揮去除DNA 纏繞的作用，并對(duì)子代染色體的分離具有重要作用。嗟諾酬類藥物通過結(jié)合旋轉(zhuǎn)酶或拓?fù)?異構(gòu)酶IV，影響酶的功能、阻斷細(xì)菌DNA的復(fù)制而引起菌體死亡。拓?fù)洚悩?gòu)酶II編碼基因或 拓?fù)洚悩?gòu)酶IV編碼基因的點(diǎn)突變可能會(huì)影響藥物和酶的結(jié)合而降低細(xì)菌對(duì)其敏感性。應(yīng)用 常規(guī)PCR對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，需要在擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)。因 此亟需一種快速準(zhǔn)確的方法鑒別大腸桿菌，且能快速判斷其對(duì)嗟諾酬類藥物的耐藥水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 嗟諾酬類藥物被廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)物疾病的治療，但是細(xì)菌對(duì)該類藥物耐藥性 與日俱增，極大制約了此類藥物的使用效果及應(yīng)用范圍。拓?fù)洚悩?gòu)酶II編碼基因或拓?fù)洚?構(gòu)酶IV編碼基因的點(diǎn)突變可能會(huì)影響藥物和酶的結(jié)合而降低細(xì)菌對(duì)其敏感性。研究發(fā)現(xiàn)大 腸桿菌臨床分離株的6了356 ^基因突變居多且與細(xì)菌的高濃度耐藥性有關(guān)。然而目前判 斷該些突變位點(diǎn)的最主要方式仍是通過PCR擴(kuò)增后進(jìn)行核酸測(cè)序的手段。
[0005] 本發(fā)明提供了一種快速鑒定大腸桿菌及其耐藥性水平的檢測(cè)手段，可快速判斷某 些對(duì)大腸桿菌耐嗟諾酬類藥物影響顯著的突變點(diǎn)。鑒于嗟諾酬類藥物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng) 用，本發(fā)明專利將會(huì)帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益，使用本發(fā)明的手段可快速、方便、有效地為合理 用藥提供重要參考，并為耐藥性研究提供技術(shù)支持。
[0006] 本發(fā)明提供了一種可快速、敏感、準(zhǔn)確判斷大腸桿菌對(duì)嗟諾酬類藥物耐藥水平的 檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明的試劑盒可特異性擴(kuò)增大腸桿菌的核酸，而不擴(kuò)增其它細(xì)菌、病毒、寄 生蟲、植物、動(dòng)物等的核酸，并且可應(yīng)用于多種組織器官與物種來源的臨床樣本，無需細(xì)菌 分離純化。
[0007] 本發(fā)明選擇場(chǎng)rase遍j因作為目標(biāo)基因，場(chǎng)rase遍j因的突變?cè)诖竽c桿菌臨床 分離株中居多，并與細(xì)菌的高濃度耐藥性有關(guān)，其N端的高頻突變區(qū)被認(rèn)為是嗟諾酬類藥 物耐藥決定區(qū)（Q畑R，quinolone resistance-determining region)。本發(fā)明通過設(shè)ir|對(duì) 引物和探針，特異擴(kuò)增所有大腸桿菌的核酸，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包含QRDR區(qū)，探針結(jié)合區(qū)即在該 區(qū)高頻突變點(diǎn)所在區(qū)域。探針結(jié)合區(qū)內(nèi)堿基的錯(cuò)配會(huì)導(dǎo)致解鏈溫度（rj變化，每種突變對(duì) 應(yīng)特定的r。。因此，通過r。，即可區(qū)分不同的點(diǎn)突變類型，快速確定大腸桿菌對(duì)嗟諾酬類藥 物的耐藥水平。
[0008]本發(fā)明從GenBanKWWW.ncbi.nlm.nih.gov)獲取場(chǎng)rase基因（NCBIReference Sequence:NZ_ASHD01000043. 1)的序列。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案是； 一種用于判定大腸桿菌對(duì)嗟諾酬類藥物耐藥水平的引物，包括上游引物和下游引物， 其核巧酸序列為： 上游引物；5，-ctttacgccatgaacgtactaggc-3， 下游引物；5, -tttccgtaccgtcatagttatcaac-3，。
[0010] 一種用于判定大腸桿菌對(duì)嗟諾酬類藥物耐藥水平的探針，包括探針-1和探針-2， 其核巧酸序列為： 探針-1:5'-ggggatggtatttaccgattacgtcaccaacgaca-6-FAM-3' 探針-2:5，-LCRED64〇-acgatcgtgtcataaaccgccgagtcacca-磯酸-3。
[0011] 一種判定大腸桿菌對(duì)嗟諾酬類藥物耐藥水平的分子檢測(cè)試劑盒，包括上述的引 物，還包括上述的探針。
[0012] 所述的試劑盒還包括用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
[001引 PCR用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑；由IDT合成場(chǎng)rase^基因的核酸序列，此序列涵蓋PCR的 擴(kuò)增區(qū)域。依據(jù)合成物的分子量和絕對(duì)重量化及PicoGreen的DNA定量技術(shù)，計(jì)算合成物 所含的6了ase^基因的拷貝數(shù)。隨后，對(duì)合成物進(jìn)行稀釋，制備每lOyl合成物的稀釋試 劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝目的基因，作為PCR的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑； 待檢樣品的DNA模板；本發(fā)明所用的檢測(cè)模板包括大腸桿菌的核酸、沙口菌核酸、寄生 蟲核酸(球蟲和弓形蟲的核酸)、病毒核酸(禽流感病毒全核酸)、動(dòng)物的核酸(犬全血核酸)。 PCR擴(kuò)增體系為；20y1的擴(kuò)增體系，包10y1的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑、IxPCR緩沖液、1uM上游引物-1、1uM下游引物、0. 2yM的6-FAM探針、0. 2yM的LCRed640 探針、2個(gè)單位的商業(yè)化Taq酶、200yMdNTP。 PCR擴(kuò)增條件為；共 40 個(gè)循環(huán)，95°C10s，56°C15s, 72°C15So[0014] PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行高分辨率烙解曲線分析；將溫度從45DC逐漸上升到 85°C，W每秒0. 11。C遞增，持續(xù)監(jiān)測(cè)巧光強(qiáng)度的變化，分析F4/F1，即640皿:530皿的 巧光強(qiáng)度的比值，F(xiàn)4/F1的第一衍生值-d(F4/F1)/化被讀為該DNA的烙解溫度。
[00巧]根據(jù)巧盧度判斷點(diǎn)突變類型原理圖解如圖1所示；圖1的上圖中（A圖），橫坐標(biāo) 表示溫度，縱坐標(biāo)表示巧光強(qiáng)度，曲線表示巧光強(qiáng)度同溫度變化的關(guān)系；圖1的下圖（B圖） 中，橫坐標(biāo)表示溫度，縱坐標(biāo)表示單位時(shí)間內(nèi)巧光強(qiáng)度的變化同時(shí)間的比值，曲線表示該比 值同溫度間的關(guān)系。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率的烙解曲線分析，溫度從40°C逐 漸升高至85°C。探針逐漸同PCR產(chǎn)物分離，巧光強(qiáng)度下降。當(dāng)巧光強(qiáng)度下降速度最快時(shí)，該 點(diǎn)的溫度即為巧盧度。模板存在點(diǎn)突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致探針與模板的堿基無法完全匹配，而使相 互結(jié)合的能力下降，rji之發(fā)生變化。
[0016] 本發(fā)明從五個(gè)方面保證6了ase^FRET-qPCR的特異性； 1) 本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針經(jīng)過GenBank的BLAST捜索，確認(rèn)本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物能 特異地?cái)U(kuò)增大腸桿菌6了356如勺基因，而不擴(kuò)增其它細(xì)菌、病毒、寄生蟲、植物、動(dòng)物的核酸 (在臨床樣本中，細(xì)菌的核酸常同該些核酸混合在一起)。同時(shí)，通過BLAST確認(rèn)，一對(duì)上下 游引物和二個(gè)探針能特異地?cái)U(kuò)增和檢測(cè)所有大腸桿菌6了ase^基因的核酸； 2) 本發(fā)明檢測(cè)了來自不同物種(雞、鴨、豬、牛)、不同組織及器官(肝、肺、腸、奶、精液） 臨床樣本的核酸； 3) 觀察W上擴(kuò)增對(duì)象在PCR過程中巧光強(qiáng)度（640nm)的變化，W及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊 脂糖凝膠電泳的條帶的大小。巧光在640nm波長(zhǎng)出現(xiàn)或增強(qiáng)，顯示陽性；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在 瓊脂糖凝膠電泳顯示預(yù)期的316bp大小的條帶； 4) 對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果和GenBank的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。
[0017] PCR靈敏度的確定； 由IDT合成6了^基因的代表序列。依據(jù)合成物的分子量和絕對(duì)重量W及PicoGreen的DNA定量技術(shù)，計(jì)算合成物所含基因拷貝的絕對(duì)數(shù)目。隨后對(duì)合成物進(jìn)行稀 釋，制備每10y1合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的基因。用 本發(fā)明系統(tǒng)擴(kuò)增含不同基因濃度的DNA模板，確定本發(fā)明檢測(cè)此基因的靈敏度。結(jié)果顯示， 本發(fā)明的反應(yīng)系統(tǒng)可擴(kuò)增10拷貝/體系濃度的模板，如圖2所示。
[001引本發(fā)明建立了一套基于大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶II編碼基因（(水rase^基因）的FRET-qPCR檢測(cè)試劑盒，可直接應(yīng)用于臨床樣本，無需細(xì)菌分離、純化。該系統(tǒng)可高度敏感、 特異地?cái)U(kuò)增不同物種(雞、鴨、牛、豬、）、組織器官(肝、肺、腸、奶、精液）來源大腸桿菌的核 酸，而不擴(kuò)增其他細(xì)菌、病毒、寄生蟲、植物、動(dòng)物的核酸。本發(fā)明設(shè)計(jì)的擴(kuò)增片段包含一段 嗟諾酬類藥物耐藥決定區(qū)（QRDR)。拓?fù)洚悩?gòu)酶編碼基因上的點(diǎn)突變可能會(huì)改變酶的性狀而 影響藥物和酶的結(jié)合，從