專利名稱：3－羥基鏈烷酸共聚物的精制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及精制由微生物菌體產(chǎn)生的3-羥基鏈烷酸共聚物的方法。
背景技術(shù)：
聚-3-羥基鏈烷酸(以下稱作PHA)是大多數(shù)微生物細胞中作為能量儲備物質(zhì)生成、蓄積的熱塑性聚酯，具有生物分解性。現(xiàn)在，塑料廢棄物通過焚燒、掩埋進行處理，但是這些處理方法存在地球溫室化和掩埋地的土地松弛等問題。因此，隨著對塑料循環(huán)利用的社會意識的提高，正在進行循環(huán)利用系統(tǒng)化。然而，可循環(huán)利用的用途有限，實際上，作為塑料廢棄處理方法，僅僅焚燒、掩埋和循環(huán)利用還不能應付，所以目前原封不動地放置在自然界的塑料還很多。因此，像廢棄后進入自然界的物質(zhì)循環(huán)中、且分解產(chǎn)物又無害的PHA等生物分解性塑料受到關(guān)注，并熱切希望其實用化。特別是，微生物在菌體內(nèi)生成蓄積的PHA由于進入自然界的碳循環(huán)過程中，所以可以預想到對于生態(tài)系統(tǒng)幾乎沒有不良影響。另外，即使在醫(yī)療領(lǐng)域，也可以作為不需回收的醫(yī)用生物材料、藥物載體的利用的可能性。
微生物生成的PHA，通常形成顆粒體蓄積在該微生物菌體內(nèi)，所以為了將PHA作為塑料利用時，則必須進行從微生物菌體內(nèi)分離提取PHA的工序。而作為從微生物菌體分離精制PHA的已知方法，大致可分為采用可以溶解PHA的有機溶劑從菌體提取PHA的方法，和通過破碎或溶解除去PHA以外的菌體組成成分得到PHA的方法。
在利用由有機溶劑提取的PHA的分離精制方法中，例如有使用1，2-二氯乙烷或氯仿等含鹵烴作為可溶解PHA的溶劑進行提取的方法(參照特開昭55-118394號公報、特開昭57-65193號公報)。然而，這些含鹵烴是疏水性溶劑，所以在提取前必須預先進行菌體干燥等使溶劑能與菌體中的PHA接觸的工序。另外，這些方法中，當將PHA溶解達到值得實用的濃度(例如5％)或更高時，提取液變得極粘稠，未溶解的菌體殘渣與含PHA的溶劑層的分離非常困難。而且，為了以高回收率從溶劑層再沉淀出PHA，則必需溶劑層的4～5倍體積的甲醇或己烷等PHA的不溶性溶劑等，所以在再沉淀工序中必須要大容量的容器。而且由于溶劑的用量龐大，所以溶劑的回收成本和損失溶劑的成本增大。另外近年來，從環(huán)境保護的觀點考慮，有機鹵化合物的使用有受到限制的趨勢，故對該方法而言其現(xiàn)狀是工業(yè)化困難。
另外，也有人提出采用，例如二噁烷(參照特開昭63-198991號公報)或丙二醇(參照特開平02-69187號公報)或四氫呋喃(參照特開平07-79788號公報)等親水性溶劑作為可溶解PHA且又與水混合的溶劑的提取方法。這些方法無論從干燥菌體或濕菌體提取PHA的可能性方面看，還是從僅冷卻與菌體殘渣分離的溶劑層獲得PHA的沉淀物方面看都認為是優(yōu)選的。然而，采用這些方法都沒有解決PHA溶解了的溶劑層的粘稠性問題，另外還存在為了提高提取效率必需加熱、和由于在水存在下進行加熱而不可避免PHA的低分子化以及回收率差等缺點。
另一方面，作為通過溶解除去PHA以外的菌體構(gòu)成成分而獲得PHA的方法，有在J.Gen.Microbiology，19，198-209頁(1958)中記載的用次氯酸鈉處理菌體懸浮液使PHA以外的菌體構(gòu)成成分溶解而獲得PHA的方法。該方法，作為過程雖然簡單，但是由于必須使用大量的次氯酸鈉，所以成本提高。另外，從可能引起PHA的顯著低分子化或在得到的PHA內(nèi)殘存有不可忽視量的氯的方面看，被認為不適于實際應用。
在特公平04-61638號公報中記載有通過在100℃或100℃以上熱處理含PHA的微生物菌體懸浮液破壞菌體結(jié)構(gòu)，然后組合進行蛋白質(zhì)分解酶處理和磷脂分解酶處理或過氧化氫處理，使PHA以外的菌體構(gòu)成成分溶解，從而獲得PHA的方法。該方法存在的缺點是，由于熱處理導致蛋白質(zhì)變性·不溶，故在下面的蛋白質(zhì)分解酶處理工序中的負荷增大，而且處理工序大多復雜，且酶的價格比較高昂而增加成本等問題。
另外，作為破壞含PHA的微生物菌體的方法，曾有人提出，用表面活性劑處理之后，將從菌體釋放的核酸進行過氧化氫處理和分解，然后分離PHA的方法(參照特表平08-502415號公報)，但是含表面活性劑的廢液激烈發(fā)泡，并且具有高的BOD負荷值。從這樣的觀點看，表面活性劑的使用在工業(yè)規(guī)模上是不理想的。
另外，一種提案是采用高壓均化器破碎含PHA的微生物菌體來分離PHA的方法(參照特開平07-177894號公報、特開平07-31488號公報)。然而，這些方法的缺點在于至少對微生物菌體懸浮液進行3次、根據(jù)情況有時加熱進行10次高壓處理，也不能得到純度高的PHA，得到的PHA的純度仍然低至65～89％左右。
另外有一種提案是，向含PHA的微生物懸浮液中添加堿并加熱來破碎細胞而分離PHA的方法(特開平07-31487號)。但是，該方法存在的缺點是，所得聚合物的純度低至75.1～80.5％，而且為了提高收率而增加堿的添加量時，又引起聚合物的低分子化等。還有一些提案是添加堿后進行物理破碎的方法(Bioseparation，第2卷，第95-105項，1991年，特開平07-31489號)，但是這些方法存在的缺點是，僅僅用堿處理，菌體構(gòu)成成分只有少量被提取到菌體外，即使繼續(xù)高壓破碎處理之后菌體構(gòu)成成分還是殘存在PHA級分中，所以效果不好，因此如不對微生物菌體懸浮液進行至少5次高壓處理，則得不到純度高的PHA，而且所得PHA的純度仍低至77～85％左右。還有，在添加堿的方法中，通常，從微生物菌體流出的菌體成分，特別是核酸，使菌體懸浮液的粘度上升，故有使其后的處理變難等問題。
另外一種方案是，將含PHA的微生物懸浮液調(diào)節(jié)到pH低于2的酸性并在50℃或50℃以上分離PHA的方法(特開平11-266891號)。然而，該方法存在的缺點是，由于該方法是在pH低于2的強酸性條件下進行處理，所以在工業(yè)規(guī)模上是不優(yōu)選的，并且為了提高純度還需要在酸處理后調(diào)節(jié)成堿性，從而產(chǎn)生大量的鹽，另外，所得的PHA的分子量從247萬下降到100萬左右等。
特開平07-177894號公開了高壓破碎處理菌體之后采用氧系漂白劑進行處理，由此分離精制聚-3-羥基丁酸酯(下面記作PHB)的方法。該方法雖然公開了用各種氧系漂白劑處理PHB的漿液的方法，但關(guān)于漂白處理時的pH沒有記載。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于，鑒于上述現(xiàn)狀，提供一種精制方法，該方法以高效且較少的工序從由微生物菌體產(chǎn)生的3-羥基鏈烷酸共聚物中除去3-羥基鏈烷酸共聚物以外的菌體構(gòu)成成分，即可高收率且不引起嚴重的分子量下降地獲得高純度且在熔融時無黃變或異臭的3-羥基鏈烷酸共聚物。
本發(fā)明人對3-羥基鏈烷酸共聚物與3-羥基鏈烷酸均聚物進行比較的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴隨過氧化氫處理的分子量下降顯著的問題，為了解決該問題又進行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，進行過氧化氫處理時，通過用堿控制含3-羥基鏈烷酸共聚物的水懸浮液的pH則可防止嚴重的分子量下降。
即，本發(fā)明涉及的是精制微生物產(chǎn)生的3-羥基鏈烷酸共聚物的方法，該方法包括通過往含從微生物分離出的3-羥基鏈烷酸共聚物的水性懸浮液中連續(xù)或間歇性地添加堿，邊進行控制上述水性懸浮液的pH邊進行用過氧化氫的處理。
下面詳細描述本發(fā)明。
附圖的簡述

圖1示出為實施本發(fā)明的精制方法的裝置之一例的簡圖。
附號的說明1攪拌槽2攪拌裝置3 pH檢測控制裝置4泵5管路6堿貯槽7 pH計發(fā)明的詳述本發(fā)明中的微生物沒有特別的限制，只要是細胞內(nèi)蓄積有3-羥基鏈烷酸共聚物的微生物即可?？梢粤信e出，例如產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、ラルストニア屬(Ralstonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、固氮菌屬(Azotobacter)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)的菌等。特別是，脂解產(chǎn)堿菌(アルカリゲネス·リポリテイカ(A.lipolytica))、廣泛產(chǎn)堿菌(アルカリゲネス·ラトウス(A.latus))、豚鼠氣單胞菌(アエロモス·キヤビエ(A.caviae))、嗜水氣單胞菌(アエロモス·ハイドロフイラ(A.hydrophila))、ラルストニア·ユ-トロフア(R.eutropha)等的菌株，尤其是，導入了來自豚鼠氣單胞菌的3-羥基鏈烷酸共聚物合成酶組基因的菌株，特別是ラルストニア·ユ-トロフア(R.eutropha)(舊名是真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus)AC32)(根據(jù)布達佩斯條約國際保藏，國際保藏局獨立行政法人 產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所 特許生物保藏中心(日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地中央第6)、保藏日1997年8月7日、保藏號FERMBP-6038，從原保藏的FERM P-15786號轉(zhuǎn)保藏)(J.Bacteriol.，179，4821-4830頁(1997))等更為優(yōu)選。在適當條件下培養(yǎng)這些微生物可以使用菌體內(nèi)蓄積了3-羥基鏈烷酸共聚物的微生物菌體。對所述培養(yǎng)方法沒有特別限制，可以使用例如在特開平05-93049等中列舉的方法。
本發(fā)明中所說的3-羥基鏈烷酸共聚物，是含3-羥基鏈烷酸的共聚物的總稱。對于3-羥基鏈烷酸成分沒有特別限定，具體地，可以列舉D-3-羥基丁酸(3HB)與其他的3-羥基鏈烷酸的共聚物、或者含D-3-羥基己酸(3HH)的3-羥基鏈烷酸的共聚物等。另外還可以舉出，含有選自3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸和3-羥基辛酸中的2種或2種以上的單體的共聚物等。其中作為單體成分，從所得聚酯的物性方面考慮，更優(yōu)選含3HH的共聚物，例如，3HB與3HH的二元共聚物(PHBH)(Macromolecules，28，4822-4828(1995))、或者3HB與D-3-羥基戊酸(3HV)以及3HH的三元共聚物(PHBVH)(特許第277757號、特開平08-289797號)。這里對于構(gòu)成3HB與3HH的二元共聚物PHBH的各單體單元的組成比沒有特別限制，但使3HH單元為1～99mol％的組成比是合適的。另外，對于構(gòu)成3HB與3HV與3HH的三元共聚物PHBVH的各單體單元的組成比沒有特別限制，但優(yōu)選的范圍是，例如，3HB單元的含量為1～95mol％、3HV單元的含量為1～96mol％、3HH單元的含量為1～30mol％。
本發(fā)明中所謂“從微生物分離的3-羥基鏈烷酸共聚物”，指的是通過破碎含3-羥基鏈烷酸共聚物的微生物菌體而從微生物游離出的3-羥基鏈烷酸的共聚物。作為微生物菌體的破碎方法，沒有特別的限制，可以舉出以往公知的物理破碎、或通過添加堿的破碎等。
本發(fā)明中所謂“含從微生物分離的3-羥基鏈烷酸共聚物的水性懸浮液”，只要是把從微生物分離出的3-羥基鏈烷酸共聚物懸浮在水中的懸浮液即可，沒有特別的限定。另外，在沒有不良影響的范圍內(nèi)還可以與有機溶劑共存。通常，在該懸浮液中，混有由微生物菌體的破碎而產(chǎn)生的菌體構(gòu)成物質(zhì)等。
上述水性懸浮液，優(yōu)選的是通過邊攪拌含3-羥基鏈烷酸共聚物菌體的懸浮液，邊與物理破碎的同時添加堿而把3-羥基鏈烷酸共聚物以外的菌體構(gòu)成物質(zhì)全部或一部分溶解并分離出3-羥基鏈烷酸共聚物，然后把3-羥基鏈烷酸共聚物懸浮在水中的水性懸浮液。
本發(fā)明中的“含3-羥基鏈烷酸共聚物的水性懸浮液”的3-羥基鏈烷酸共聚物的濃度，從高效良好地進行精制的觀點考慮，優(yōu)選等于或低于500g/L，更優(yōu)選等于或低于300g/L。
在本發(fā)明中，與采用過氧化氫的上述水性懸浮液的處理的同時，通過連續(xù)或間斷地往上述水性懸浮液中添加堿，則可控制上述水性懸浮液的pH。由此，在進行采用過氧化氫的蛋白質(zhì)(殘存在懸浮液中的菌體構(gòu)成物質(zhì))分解的同時，還可以防止3-羥基鏈烷酸共聚物的分子量的嚴重下降。
作為用于本發(fā)明的堿，凡是能把pH調(diào)節(jié)至特定的范圍的堿，則沒有特別的限制。具體地可以舉出，含氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、氫氧化鈣等的堿金屬或堿土類金屬的氫氧化物；碳酸鈉、碳酸鉀等堿金屬碳酸鹽；醋酸鈉、醋酸鉀等有機酸的堿金屬鹽；硼砂等堿金屬的硼酸鹽；磷酸三鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鉀、磷酸氫二鉀等堿金屬的磷酸鹽；或氨水等。其中，從適于工業(yè)生產(chǎn)，且從價格方面考慮，優(yōu)選氫氧化鈉、碳酸鈉、氫氧化鉀等。
在本發(fā)明中，通過加堿時控制的pH范圍沒有特別的限制，但從防止共聚物的分子量下降的觀點考慮，優(yōu)選控制pH為7或7以上，更優(yōu)選控制pH為8或8以上，進一步優(yōu)選控制pH上限為13或13以下，更優(yōu)選控制pH上限為12或12以下。特別優(yōu)選調(diào)節(jié)為pH8～11之間。
作為控制的pH的上下波動幅度設(shè)定值分別在1以內(nèi)為優(yōu)選，更優(yōu)選上下波動幅度設(shè)定值分別在0.5以內(nèi)。
在本發(fā)明中，堿的添加速度沒有特別的限制，優(yōu)選邊測量上述水性懸浮液的pH推移，邊以可將上述pH控制在所希望的范圍那樣的速度添加堿。
通常，用過氧化氫處理3-羥基鏈烷酸共聚物時，可以觀察到，伴隨精制的進行，上述水性懸浮液的pH出現(xiàn)慢慢下降的現(xiàn)象。本發(fā)明為了抑制該現(xiàn)象而進行連續(xù)或間斷地添加堿則將上述水性懸浮液的pH控制在一定范圍內(nèi)。當添加使pH超過14那樣的過量的堿時，不僅引起過氧化氫分解和精制效率下降，而且也容易導致3-羥基鏈烷酸共聚物分子量的下降，另外，若堿的加量不足則過氧化氫的活性下降不能獲得充分的精制效果，另外，趨于酸性一側(cè)時，3-羥基鏈烷酸共聚物的分子量也有大幅度下降的傾向。但通過連續(xù)或間斷地添加合適量的堿來控制pH，就可以同時達到提高精制效率和抑制分子量下降的2個目的。
在本發(fā)明中，過氧化氫的添加量沒有特別的限制，作為水性懸浮液中的濃度優(yōu)選等于或低于10重量％，更優(yōu)選等于或低于5重量％，進一步優(yōu)選等于或低于1重量％。另外，為了得到合適的精制效果優(yōu)選等于或大于0.01重量％，較優(yōu)選等于或大于0.05重量％，更優(yōu)選等于或大于0.1重量％。
特別是本發(fā)明的場合，通過采用添加堿的方法控制水性懸浮液的pH，即使降低過氧化氫的添加量，也可以得到優(yōu)良的精制效果。過氧化氫添加量的減少，可以降低精制工序的成本或削減排放水的處理負擔所以是非常好的。即在本發(fā)明中，例如，即使過氧化氫的添加量是1重量％或1重量％以下，甚至不到0.5重量％也可以得到優(yōu)異的精制效果。而不進行采用添加堿來控制水性懸浮液的pH，只是進行過氧化氫的處理時，對于過氧化氫的添加量是這樣的低濃度，則是不可能達到充分的精制效果的。
在本發(fā)明中，通過過氧化氫的處理，優(yōu)選在從室溫或室溫以上的溫度到水性懸浮液的沸點的范圍進行。為了在短時間更好地提高精制效果，優(yōu)選在50℃或50℃以上，更優(yōu)選在70℃或70℃以上進行處理。另外，通常進行處理10分鐘～10小時，優(yōu)選30分鐘～5小時，更優(yōu)選1小時～3小時。
進行過氧化氫處理后，將進行離心分離得到的沉淀物用水或有機溶劑，優(yōu)選親水性溶劑，具體的是甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃等溶劑進行洗滌、干燥，由此可以分離出3-羥基鏈烷酸共聚物。
實施發(fā)明的最佳方案下面揭示實施例更詳細地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
(聚合物純度的測定方法)離心分離(2400rpm，15分鐘)聚合物的水性懸浮液除去上清液，用甲醇(但實施例4和比較例3的場合只用乙醇)洗滌2次后，在加熱·減壓下進行干燥得到聚合物粉末。將10mg聚合物粉末溶解到1ml氯仿中之后，加入0.85ml甲醇和0.15ml濃硫酸在100℃下處理140分鐘。將其冷卻后，加入0.5ml硫酸銨飽和水溶液激烈攪拌后靜置，對下層部分進行毛細管氣體色譜分析，求出聚合物的純度。
(聚合物分子量的測定方法)聚合物分子量，是將從菌體分離得到的沉淀物10mg溶解在1ml氯仿中之后，過濾除去不溶物。使用裝有Shodex K805L(300×8mm，2根連接)的SHIMADZU社制的GPC系統(tǒng)，并以氯仿為流動相對該溶液進行分析。
(聚合物熔融時的YI值的測定方法)離心分離(2400rpm，15分鐘)聚合物的水性懸浮液除去上清液，用甲醇(但只有實施例4和比較例3的場合是用乙醇)洗滌2次后，在加熱·減壓下進行干燥得到各試樣。對于PHBH試樣在加熱到170℃，對于PHB試樣在加熱到190℃的鋁片上熔融10分鐘作成顆粒，使用日本電色工業(yè)(株)制的分光式色彩計SE-2000進行測定，求出黃色度指數(shù)(YI值)。
(聚合物中的殘留氮量的測定方法)離心分離(2400rpm，15分鐘)聚合物的水性懸浮液除去上清液，用甲醇洗滌2次后，在加熱·減壓下進行干燥得到各試樣。關(guān)于各試樣用對于使用ダイヤインスツルメンツ社制的微量氮分析裝置TN-10測得的氮濃度乘以6.38進行蛋白質(zhì)換算出的值表示。
(含有從微生物分離的PHBH的水性懸浮液的配制)PHBH的懸浮液，是將導入了來自豚鼠氣單胞菌的3-羥基鏈烷酸共聚物合成酶組基因的ラルストニア·ユウトロフア(R.eutropha)(舊名是真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(アルカリゲネス·ユウトロフアス(Alcaligenes eutrophus))AC32(上述的保藏號FERM BP-6038))，按照J.Bacteriol.，179，4821-4830頁(1997)中記載的方法進行培養(yǎng)，得到了含PHBH約67重量％的菌體。往通過離心(5000rpm，10分鐘)從培養(yǎng)液分離出的糊狀菌體中加水，配制成758干菌體/L的水性懸浮液，添加作為堿的氫氧化鈉的水溶液，邊保持pH11.7邊進行攪拌和進行物理破碎，由此溶解PHBH以外的菌體構(gòu)成物質(zhì)并進行離心分離(3000rpm，10分鐘)得到沉淀物。進一步進行水洗沉淀物，分離出了平均分子量約為70萬，3HH摩爾分率5％，純度91％的PHBH。將得到的PHBH作成75g/L的水懸浮液，在下面的實施例1～2和比較例1～2中使用。
圖1是實施本發(fā)明的3-羥基鏈烷酸共聚物精制方法用的裝置之一例的簡圖。當然本發(fā)明并不限于所舉例的該裝置。
(實施例1)將PHBH的水性懸浮液50ml放入裝有pH電極的100ml攪拌槽中并在70℃下保溫。pH電極連接到丸菱バイオエンジン社制的MDL-6C型實驗室控制器上，設(shè)定成為pH達到設(shè)定值或其以下時，蠕動移液泵開始工作，并向該懸浮液內(nèi)添加氫氧化鈉水溶液直至達到設(shè)定值時。把實驗室控制器的pH設(shè)定為10，并向該懸浮液中以過氧化氫濃度相對于聚合物重量為5重量％(相對于懸浮液重量為0.375重量％)并進行攪拌1小時那樣添加30％過氧化氫水并進行攪拌1小時。然后通過對該懸浮液離心分離并水洗2次，再用甲醇進行洗滌2次之后，進行干燥而獲得粉末。
同樣地把實驗室控制器的pH設(shè)定為7和8并進行上述處理。這些結(jié)果示于表1中。
表1

從該結(jié)果可見，在過氧化氫處理時若添加堿控制pH，則可提高共聚物的純度且減少氮的殘留量，同時不改變共聚物的分子量，而且可以抑制共聚物熔融時的變黃現(xiàn)象。
(實施例2)用與實施例1同樣方法，把實驗室控制器的pH設(shè)定為10，在50℃下進行攪拌3小時。然后通過離心分離該懸浮液進行2次水洗，再用甲醇進行洗滌2次后，進行干燥獲得粉末。結(jié)果示于表2中。
表2

從該結(jié)果可見，若邊添加堿控制pH邊進行過氧化氫處理，則在提高共聚物純度的同時，共聚物的分子量也不改變，而且還可以抑制共聚物熔融時的變黃現(xiàn)象。
(實施例3)如下地配制懸浮液將與上述同樣進行處理得到的分子量148萬、3HH摩爾分率7％、純度99％的110g的PHBH懸浮在1000ml水中，并放入裝有pH電極和シルバ-ソン混合器(SILVERSON MIXER)的2000ml攪拌槽中并在70℃下保溫。pH電極連接到丸菱バイオエンジン社制的MDL-6C型實驗室控制器上，并設(shè)定成為pH達到設(shè)定值或其以下時，蠕動移液泵開始工作且將氫氧化鈉水溶液加到該懸浮液內(nèi)直至達到pH為設(shè)定值10時。把シルバ-ソン混合器轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)定為5000轉(zhuǎn)，并以過氧化氫濃度相對于聚合物重量為5重量％(相對于懸浮液重量為0.375重量％)那樣將30％過氧化氫水添加到該懸浮液中并進行攪拌50分鐘。然后通過對該懸浮液離心分離并水洗3次，再用甲醇進行洗滌2次之后，進行干燥而獲得粉末。這些結(jié)果示于表3中。
表3

從該結(jié)果可見，若邊添加堿控制pH邊進行過氧化氫處理，則共聚物的分子量不改變，而且還可以抑制共聚物熔融時的變黃現(xiàn)象。
(比較例1)將與實施例1中所用相同的PHBH的水性懸浮液(pH7.19)(處理1)50ml，和其中添加氫氧化鈉pH為9.16的懸浮液(處理2)50ml，各在100ml攪拌槽中70℃下保溫。以過氧化氫濃度相對于聚合物重量為5重量％(相對于懸浮液重量為0.375重量％)那樣將30％過氧化氫水添加到該懸浮液中，不進行pH調(diào)節(jié)地攪拌3小時。然后通過對該懸浮液離心分離并水洗2次，再用甲醇進行洗滌2次之后，進行干燥而獲得粉末。其結(jié)果示于表3中。
表4

從該結(jié)果可知，不調(diào)節(jié)pH地進行過氧化氫處理時，共聚物的分子量下降到不足處理前的分子量的90％。
(比較例2)將實施例1中所用的PHBH的懸浮液50ml的pH用稀鹽酸調(diào)至pH為5，放入裝有與實施例1相同的pH電極的100ml攪拌槽中于70℃下保溫。把實驗室控制器的pH設(shè)定為5，以過氧化氫濃度相對于聚合物重量為5重量％(相對于懸浮液重量為0.375重量％)那樣添加30％過氧化氫水，攪拌1小時。然后通過對該懸浮液離心分離并水洗2次，再用甲醇進行洗滌2次之后，進行干燥而獲得粉末。其結(jié)果示于表5中。
表5

從以上結(jié)果可見，若邊用酸控制pH邊進行共聚物的過氧化氫處理，雖然可以提高共聚物的純度，并抑制共聚物熔融時的變黃現(xiàn)象，但共聚物的分子量卻大幅度地下降了。
(實施例4)對于進行與上述同樣地處理得到的分子量80萬，3HH摩爾分率5％，純度＞99％的PHBH的懸浮液50ml，與實施例1進行同樣地處理。但實驗室控制器設(shè)定為pH8。其結(jié)果示于表6中。
(比較例3)除了不添加過氧化氫以外，進行與實施例4同樣的處理。其結(jié)果示于表6。
表6

從表6結(jié)果可見，若邊加堿控制pH邊進行過氧化氫處理，則可防止共聚物的分子量下降，并可抑制共聚物熔融時的變黃現(xiàn)象，但若不進行過氧化氫處理只由添加堿進行控制pH時，分子量下降，而且也幾乎不能控制熔融時的變黃現(xiàn)象。
(參考例1)以過氧化氫濃度相對于聚合物重量為5重量％(相對于懸浮液重量為0.375重量％)那樣將30％過氧化氫水添加到聚-3-羥基丁酸酯[アルドリツチ社制，純度95％，分子量65萬]的10％水性懸浮液中。不調(diào)節(jié)該水性懸浮液的pH，于70℃下加熱攪拌3小時。然后通過對該懸浮液離心分離并水洗2次，再用甲醇進行洗滌2次之后，進行干燥而獲得粉末。該粉末的結(jié)果示于表7中。
表7

對于均聚物，即使不調(diào)節(jié)pH地進行過氧化氫處理，分子量也不下降，而且還可以抑制熔融時的變黃現(xiàn)象。
(參考例2)用稀鹽酸將PHB[純度95％，分子量65萬]的10％水性懸浮液的pH調(diào)節(jié)成pH5，于70℃下保溫。以過氧化氫濃度相對于聚合物重量為5重量％(相對于懸浮液重量為0.375重量％)那樣將30％過氧化氫水添加到該懸浮液中，進行攪拌3小時。然后通過對該懸浮液離心分離并水洗2次，再用甲醇進行洗滌2次之后，進行干燥而獲得粉末的PHB。該粉末的分子量為65萬，保持了過氧化氫處理前的分子量。即使添加酸進行過氧化氫處理PHB也能保持其分子量。
從參考例1和2的結(jié)果可知，均聚物的場合過氧化氫處理之際不用堿控制pH時分子量不下降。即，過氧化氫處理之際分子量下降是不同于共聚物的現(xiàn)象，按照本發(fā)明的精制方法可以防止該共聚物的分子量下降。
工業(yè)實用性按照本發(fā)明的3-羥基鏈烷酸共聚物的精制方法，則可以通過非常簡便的方法，防止3-羥基鏈烷酸共聚物在過氧化氫處理時分子量的嚴重下降，而且，可以高收率地得到高純度且沒有熔融時的變黃或異臭的3-羥基鏈烷酸共聚物。
用該方法得到的極高純度的3-羥基鏈烷酸共聚物可用于廣泛的用途中，是工業(yè)上特別有用的。
權(quán)利要求
1.一種精制方法，該方法是精制微生物產(chǎn)生的3-羥基鏈烷酸共聚物的方法，其特征在于，通過連續(xù)或間斷地向含有從微生物分離出的3-羥基鏈烷酸共聚物的水性懸浮液中添加堿，邊進行控制上述水性懸浮液的pH邊進行采用過氧化氫的處理。
2.權(quán)利要求1所述的精制方法，其特征在于，控制水性懸浮液的pH在7～13之間.
3.權(quán)利要求1或2所述的精制方法，其特征在于，水性懸浮液中的過氧化氫的濃度是0.01重量％～1重量％的范圍。
4.權(quán)利要求1～3中的任一項所述的精制方法，其中3-羥基鏈烷酸共聚物，是D-3-羥基己酸與其他的D-3-羥基鏈烷酸的共聚物。
5.權(quán)利要求1～3中的任一項所述的精制方法，其中3-羥基鏈烷酸共聚物，是含有選自3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸和3-羥基辛酸中的2種或2種以上的單體構(gòu)成的共聚物。
6.權(quán)利要求1～3中的任一項所述的精制方法，其中3-羥基鏈烷酸共聚物，是D-3羥基己酸與D-3羥基丁酸的二元共聚物，或D-3羥基己酸與D-3羥基丁酸與D-3羥基戊酸的三元共聚物。
7.權(quán)利要求1～6中的任一項所述的精制方法，其中產(chǎn)生3-羥基鏈烷酸共聚物的微生物是屬于氣單胞菌屬的微生物。
8.權(quán)利要求7中所述的精制方法，其中產(chǎn)生3-羥基鏈烷酸共聚物的微生物是豚鼠氣單胞菌或嗜水氣單胞菌。
9.權(quán)利要求1～6中的任一項所述的精制方法，其中產(chǎn)生3-羥基鏈烷酸共聚物的微生物是導入了來自豚鼠氣單胞菌的3-羥基鏈烷酸共聚物合成酶組基因的菌株。
10.權(quán)利要求1～9中的任一項所述的精制方法，其中3-羥基鏈烷酸共聚物的水性懸浮液，是邊攪拌含3-羥基鏈烷酸共聚物菌體的懸浮液，邊通過與物理破碎的同時添加堿而使3-羥基鏈烷酸共聚物以外的菌體構(gòu)成物質(zhì)全部或一部分溶解并分離3-羥基鏈烷酸共聚物，再將3-羥基鏈烷酸共聚物懸浮在水中制成的水性懸浮液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種不顯著引起分子量下降且高純度地精制從含PHA的菌體分離出的PHA的方法。該方法是精制微生物產(chǎn)生的3－羥基鏈烷酸共聚物的方法，其包括通過連續(xù)或間斷地將堿添加到含有從微生物分離出的3－羥基鏈烷酸共聚物的水性懸浮液中，且邊控制上述水性懸浮液的pH邊進行采用過氧化氫的處理。
文檔編號C08G63/90GK1685048SQ0382343
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月30日
發(fā)明者小川典子, 官本憲二, 小坂田史雄, 松本圭司 申請人:株式會社鐘化