公雞性早熟相關(guān)基因——gdf9基因5’調(diào)控區(qū)snp分型及啟動(dòng)子活性快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，利用PCR-RFLP和雙報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)提供一種 公雞性早熟相關(guān)基因--生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子_9 (GDF9) 5'調(diào)控區(qū)SNP分型及啟動(dòng)子活性快速檢 測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子-9 (growth differentiation factor-9，GDF9)是轉(zhuǎn)移因 子(TGF-0)超家族的成員之一，作為控制哺乳動(dòng)物繁殖性狀的主效基因或候選基因 已被報(bào)道（Hanrahan at el 2004，Palmer at el 2010，Barzegari，at el 2006)。研宄發(fā) 現(xiàn)GDF9在母雞的卵巢中特定表達(dá)，并能促進(jìn)雞卵母細(xì)胞的有絲分裂、加強(qiáng)顆粒細(xì)胞的增殖 (Johnson at el 2005)。盡管⑶F9對(duì)雌性動(dòng)物的繁殖能力起重要作用，其在雄性動(dòng)物的研 宄中卻很少，且僅停留在表達(dá)水平。研宄發(fā)現(xiàn)⑶F9在人和牛的睪丸中表達(dá)（Aaltonen at el 1999，Pennetier at el 2004)，⑶F9是大鼠睪丸的生殖細(xì)胞特異性因子，并可以調(diào)節(jié) 調(diào)節(jié)睪丸支持細(xì)胞的生長(zhǎng)（Nicholls at el 2009)。但GDF9在公雞的研宄卻沒(méi)有報(bào)道，雞 冠的發(fā)育是雞第二性征中最明顯，最重要的特征，可作為衡量性成熟程度的指標(biāo)（雷秋霞， 2005)，因此⑶F9基因可以作為控制公雞性成熟的主效基因或候選基因。
[0003] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)，作為第三代遺傳標(biāo)記 已得到飛速發(fā)展，目前已經(jīng)有多種發(fā)展成熟的檢測(cè)技術(shù)，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP)、限制性 酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)、DNA芯片以及Taqman探針等技術(shù)手段。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài) 性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP)技術(shù)就是利用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶 消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分型。該技術(shù)具有特異性高、檢測(cè)快速、通用 性強(qiáng)、適用范圍廣、成本低廉等特點(diǎn)，目前已成功應(yīng)用于人類疾病及禽病相關(guān)基因分子標(biāo)記 的SNP檢測(cè)和基因診斷試劑盒的研發(fā)。
[0004] 報(bào)告基因是一種編碼某種易于檢測(cè)蛋白質(zhì)或酶的基因，通過(guò)它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定 目的基因的表達(dá)調(diào)控。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是高靈敏度、可信性及檢測(cè)方便且適合大規(guī)模檢 測(cè)。目前已廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子分析、監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)、細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物的篩選等 多種細(xì)胞事件。隨著技術(shù)和檢測(cè)方法的進(jìn)步，熒光分析以其能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)報(bào)告基因的活性 可視化和對(duì)細(xì)胞的非破壞性而越來(lái)越成為主流，因此熒光素酶和綠色熒光蛋白這兩種可發(fā) 出熒光的報(bào)告基因成為眾多報(bào)告基因中的后起之秀。雙報(bào)告基因技術(shù)結(jié)合了螢火蟲(chóng)熒光素 酶測(cè)試和海洋腔腸熒光素酶測(cè)試，在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試，快速、靈敏、簡(jiǎn) 便。報(bào)告基因表達(dá)活力的相對(duì)改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，雙報(bào)告基因技 術(shù)使偶聯(lián)到組成型啟動(dòng)子的第二個(gè)報(bào)告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對(duì)照，使測(cè)試不被實(shí)驗(yàn)條 件變化所干擾，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0005] 經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和專利的檢索，至今未見(jiàn)有GDF9基因5'調(diào)控區(qū)多態(tài)性位 點(diǎn)及其啟動(dòng)子活性與公雞性早熟相關(guān)性的報(bào)道。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0006] 本實(shí)用新型的目的是為了給公雞性早熟相關(guān)基因一一⑶F9基因5'調(diào)控區(qū) G-333T(由啟動(dòng)子的第一個(gè)堿基向調(diào)控區(qū)方向的第333個(gè)堿基）位點(diǎn)的檢測(cè)提供一種基因 分型及啟動(dòng)子活性檢測(cè)試劑盒，該試劑盒準(zhǔn)確性高、快速、價(jià)格低廉。
[0007] 本實(shí)用新型的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，公雞性早熟相關(guān)基因一一⑶F9基 因5'調(diào)控區(qū)SNP分型及啟動(dòng)子活性快速檢測(cè)試劑盒，包括盒體，盒體為雙層結(jié)構(gòu)，包括上層 盒體和下層盒體，上、下層盒體內(nèi)均設(shè)有襯墊，襯墊上設(shè)有孔腔；所述下層盒體為低溫層；
[0008] 上層盒體襯墊孔腔內(nèi)分別設(shè)有用于⑶F9基因5'調(diào)控區(qū)PCR擴(kuò)增的上下游引物混 合物、DNATag酶擴(kuò)增緩沖液、內(nèi)切酶緩沖液、dNTP、轉(zhuǎn)染試劑、、1XPBS;
[0009] 下層盒體襯墊孔腔內(nèi)分別設(shè)有DNATag酶、Hin6I內(nèi)切酶、 pGL3-GDF9-333-GG-Basic/promoter質(zhì)粒 1、pGL3-GDF9-333-TT-Basic/promoter質(zhì)粒 2、pGL3_Basic質(zhì)粒 3、pRL-CMV質(zhì)粒 4、Dual-GloLuciferaseReagent雙焚光素酶試劑、 Dual-GloStop&GloSubstrate雙焚光素酶終止反應(yīng)底物、Dual-GloLuciferaseReagent Buffer雙熒光素酶緩沖液。
[0010] 優(yōu)選地，所述盒體橫截面是橢圓形。
[0011] 優(yōu)選地，所述盒體上設(shè)有盒蓋，盒蓋為橢圓形。
[0012] 引物混合物P表示用于⑶F9基因5'調(diào)控區(qū)PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物，引物 信息如下：
[0013] 上游引物S:5'CACCACAGTCAAAACAGCTTTAAGA3'
[0014] 下游引物A:5'GTCAGGCTGAGCCTTTGCAC3'。
[0015] 質(zhì)粒 1 (pGL3-GDF9-333-GG-Basic/promoter)表示將啟動(dòng)子區(qū)域（-333 堿基為 G) 正確插入報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL3-Basic)中的重組質(zhì)粒（大寫(xiě)字母為啟動(dòng)子區(qū)域，小寫(xiě)字母為 pGL3-Basic質(zhì)粒部分序列，帶框ATG為啟動(dòng)子，帶框G為啟動(dòng)子第一個(gè)字母向調(diào)控區(qū)方向的 第333個(gè)堿基），其信息如下：
[0016] ggtaccgagctcttacgcgtCACCACAGTCAAAACAGCTTTAAGAGATGTAAGAAAAAAGGTGATGTT GTTTCACATTACAGATTGCTATCTGAATTAACCTTCCACTCCAAATGAAAGAATTCTGTAAGTCAATTAAGCATTCT CTGAACAAGCACTCCTTACTTAGAAGCCGTAAGATGTGAAAGCTAGATTACAGGTGACACTTCACTAGATTACTGAC AGCACAGCTCTAATTAAAAACATCTGGCATGAAAACACATTCCCTTACACATTTTCCTCACTCAATAAAACAAAAAT CCACCCCTTTCATTACATCCTGTAAGAAGAGTTTCTAAACACTCCAGGCAGGCACTACTACTCCAGTCGGAGTCTTC GGGAGCAATAATGTTTAGCATCTTATATACATTTAGCAATGCTAACTGGCGCTGTTGCTGCCCTTGCTTTAACAGCT AACCCACGAATACCGGAATTCCCGCAGGTCGCGCTCTCAGCCGGACCGGCGGCATCCCTTCCCCTCCCGGCTCCCCC TGGGGGCCGATCCACGAACAGTCGTGCCTTACAGTTTACCAGGTAGAAAAGTGTAACCCTGAGAAGCAGCGTTTGTT GGTGAGACGCCGCCACGTGCAAAGGCTCAGCCTGACCGCACACACACACGTGGGTTCCACAGCCAGCTGCGGGGCTT TCCCTTTGGTTTCTAATCACAAAGAAACCTCCCTCCTGAGCCACAGCTGAAACACATATAACAGCTCGAGCTCGCGT GCTCTTTTTTCTTGAATGCTTGGGGGGAGGCGTTGTTAGGCTACAGCCCTGAAGAGCAT^GAGGGTACGTGGAGG ATCTGTGTTTGTTTCTATTGCTGCATTCACTGGCTTctcgagatctgcgatctaagtaagctt
[0017] 質(zhì)粒 2 (pGL3-DRDl-333-TT-Basic/promoter)表示將啟動(dòng)子區(qū)域（-333 堿基為 T) 正確插入報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL3-Basic)中的重組質(zhì)粒（大寫(xiě)字母為啟動(dòng)子區(qū)域，小寫(xiě)字母為 pGL3-Basic質(zhì)粒部分序列，帶框ATG為啟動(dòng)子，帶框T為啟動(dòng)子第一個(gè)字母向調(diào)控區(qū)方向的 第333個(gè)堿基），其信息如下：
[0018] ggtaccgagctcttacgcgtCACCACAGTCAAAACAGCTTTAAGAGATGTAAGAAAAAAGGTGATGTTG TTTCACATTACAGATTGCTATCTGAATTAACCTTCCACTCCAAATGAAAGAATTCTGTAAGTCAATTAAGCATTCTC TGAACAAGCACTCCTTACTTAGAAGCCGTAAGATGTGAAAGCTAGATTACAGGTGACACTTCACTAGATTACTGAC AGCACAGCTCTAATTAAAAACATCTGGCATGAAAACACATTCCCTTACACATTTTCCTCACTCAATAAAACAAA