專利名稱：鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法。
背景技術(shù)：
鯉魚(Cjprizw1S carpio),又稱鯉拐子、鯉子,隸屬于魚綱,鯉形目，鯉科。其種類多，有紅鯉、團鯉、草鯉、荷色鯉、錦鯉、火鯉、芙蓉鯉、荷包鯉等。鯉魚對水體環(huán)境適應(yīng)性強，是我國淡水養(yǎng)殖傳統(tǒng)的優(yōu)良品種。氨基酸轉(zhuǎn)運載體rBAT/b°+AT是一種異源二聚體，包含rBAT和b°+AT兩個亞基，是腎臟和小腸頂膜轉(zhuǎn)運堿性氨基酸的主要載體蛋白。rBAT為轉(zhuǎn)運亞基，b°+AT是催化亞基。rBAT蛋白是一個II型膜糖蛋白，具有與細菌糖苷酶同源的大胞外環(huán)結(jié)構(gòu)域，并且高度糖基化。氨基酸轉(zhuǎn)運載體不僅介導(dǎo)氨基酸從胞外轉(zhuǎn)入胞內(nèi)發(fā)揮其營養(yǎng)作用，同時也介導(dǎo)氨基酸作為神經(jīng)遞質(zhì)進出細胞內(nèi)外，完成神經(jīng)細胞抑制或興奮等重要功能。氨基酸轉(zhuǎn)運吸收異常會導(dǎo)致范科尼綜合癥、胱氨酸尿癥、家族性腎原性亞甘氨酸尿癥、肥胖和哈氏遺傳性疾病等氨基酸代謝障礙性疾病。因此，研究氨基酸轉(zhuǎn)運載體分子特性及功能等方面對于機體營養(yǎng)代謝及疾病病理的研究具有重要意義。為了研究rBAT基因表達和轉(zhuǎn)運活性的調(diào)控因素及調(diào)控機理，需要高特異性的rBAT抗體。rBAT抗體可為rBAT的組織定位、細胞定位、表達定量、魚類氨基酸代謝障礙等系列研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。獲得大量有活性的rBAT蛋白作為免疫抗原是制備高活性抗體的關(guān)鍵。由于鯉魚rBAT蛋白是典型的跨膜蛋白，組織含量低，具有I個跨膜域，因此，不能有效地分離純化及體外表達超量具有生物活性的rBAT抗原蛋白成了制備rBAT抗體的瓶頸。

與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)一的技術(shù)方案是通過蛋白質(zhì)分離純化的方法，從組織中直接分離純化rBAT蛋白作免疫抗原。其缺點是細胞內(nèi)蛋白一般含量很低，提取方法復(fù)雜，得到的蛋白量相對較少，含雜質(zhì)多，需要復(fù)雜的純化過程，成本高。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)二的技術(shù)方案是通過構(gòu)建工程菌體外表達外源蛋白作免疫抗原。其缺點是通過構(gòu)建原核或真核表達系統(tǒng)來表達抗原蛋白，雖然體外表達的效率和表達量比較高，但是這種方法有很多的局限性，很多特殊結(jié)構(gòu)異源基因如富含AT堿基和一些跨膜蛋白的基因很難在微生物中表達或者表達量很低，有的即使表達了但是沒有活性。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)三的技術(shù)方案是通過無細胞表達系統(tǒng)表達外源蛋白，無細胞表達系統(tǒng)是指以細胞裂解液為基礎(chǔ)，加之外援的RNA模板、氨基酸和能量所構(gòu)成的細胞外表達體系。其缺點是無細胞表達系統(tǒng)可以表達一些跨膜蛋白，但是這項技術(shù)在國內(nèi)外還處于實驗室研究水平，技術(shù)難度大，成本高，目前還無法實際應(yīng)用。國內(nèi)外已經(jīng)完成了對鯉魚rBAT全長的測序工作，包括Y端非翻譯區(qū)(5' UTR),3'端非翻譯區(qū)(3' UTR)，一個2000bp左右的開放閱讀框(0RF)。經(jīng)序列同源性分析顯示，rBAT氨基酸序列具有高度保守性，鯉魚rBAT氨基酸序列和斑馬魚的相似性最高達80%以上，與豬的rBAT氨基酸序列相似性最低(低于60%)。鯉魚腸道rBAT基因全長2040 bp，其rBAT蛋白含有跨膜域，所以重組表達rBAT基因全長存在一定的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是:鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟:(1)克隆鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的基因，通過分析膜蛋白rBAT的三維結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和抗原決定簇，利用原核表達具有抗原決定簇的部分rBAT基因片段作為免疫抗原蛋白代替表達全長基因；(2)構(gòu)建氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的基因工程菌；(3)氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT基因工程菌的誘導(dǎo)表達與鑒定；
(4)制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT抗原；(5)免疫兔子；(6)采血樣測定鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的效價；(7)頸動脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的兔抗血清；(8)免疫組織化學(xué)方法檢測。本發(fā)明所述的制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT抗原的具體步驟為:將步驟(3)誘導(dǎo)表達的菌液離心，棄上清，按照濕重I g的菌體加6 ml蒸餾水，吹打混勻，再加入與上述菌體混合液等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴10 min，使蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將分離膠放于0.3 M KCl溶液里染色，顯示目的條帶，切下膠上的目的蛋白條帶，放入ddH20里清洗，將膠條剪碎放入塑料培養(yǎng)皿中，冷凍干燥I d，放入研缽中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計檢測蛋白濃度。本發(fā)明所述的免疫兔子的具體步驟為:按注射要求將蛋白溶液稀釋；乳化:耳緣靜脈注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩，皮內(nèi)注射:1 ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法:第一、二次采用耳緣靜脈注射法，第三、四次采用皮內(nèi)多點注射法；每隔10 d加強免疫I次，第I次免疫加完全弗氏佐齊U，以后加強免疫時用不完全弗氏佐劑。本發(fā)明所述的頸動脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的兔抗血清的具體步驟為:步驟(5)中第四次免疫后8 d頸動脈采血，兔子在采血前禁食I d，采集血樣收集于經(jīng)滅菌并不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2 h，待血液凝塊后，4 °C保存使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中，血凝塊以1500 rpm離心10 min,吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分裝冷凍干燥保存，部分放于4 °C備用。本發(fā)明采用表達跨膜蛋白的具有抗原決定簇部分基因片段作為抗原蛋白代替全長基因，解決了跨膜蛋白無法表達的難題，并且該方法簡單易行，快速，穩(wěn)定，成本低，周期短，表達量高，制備的抗體特異性強，效價高。


圖1是本發(fā)明制備方法的流程圖，圖2是鯉魚全長rBAT基因PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析圖，圖3是鯉魚部 分rBAT基因rBAT-P PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析圖，圖4是重組rBAT_PSDS-PAGE電泳分析圖，圖5鯉魚腸道PepTl表達的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果圖(100 χ)。
具體實施例方式結(jié)合附圖詳細描述實施例。1.鯉魚腸道rBAT的克隆與表達 (I) PCR引物設(shè)計
利用Primer Primern 5.0設(shè)計兩對引物,基于本實驗室已獲得的鯉魚腸道rBAT基因的全長序列，設(shè)計一對特異性引物rBAT - F和rBAT - R:rBAT - F:5，-GGGACTGAAGGAAGCAAG-3，rBAT - R:5’-GTCGCTTCT ATCTTCAACACTT-3’
另一對為含Kpn 及Not 雙酶切位點的特異性引物rBAT-F2和rBAT_R2: rBAT-F2:5’-GGGGTACCATGAGTTCGACCAAAAA-3’
Kpn
rBAT-R2:5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGCGGTAGCAGGCTTTCC-3’
Not
劃線部分分別為Kpn 及Not 的酶切位點。(2)全長rBAT基因的克隆與序列分析
采用Trizol法提取鯉魚前腸組織總RNA，用01igo(dT)18引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，采用rBAT - F和rBAT - R引物進行PCR擴增，反應(yīng)條件為95°C 3 min, 94°C30s, 53.5°C 50s, 72°C 2min 15s，33 個循環(huán)，72°C lOmin，16°C保溫。PCR 產(chǎn)物進行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析。擴增到了大約2000bp左右的DNA片段(圖2)，將rBAT PCR擴增產(chǎn)物與pGEM_TVector連接，構(gòu)建pGEM-T-rBAT重組質(zhì)粒，連接載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌iE.coli JM109)感受態(tài)細胞中，藍白斑篩選出陽性克隆，將陽性克隆的菌液送至中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司測序。結(jié)果表明，該核酸片段長度為2040 bp，經(jīng)序列比對顯示，該DNA片段即為鯉魚腸道rBAT的ORF區(qū)。采用在線服務(wù)器TMHMM Server v.2.0.對5^7 7進行結(jié)構(gòu)分析，具有I個跨膜區(qū)域。鯉魚rBAT基因編碼679個氨基酸殘基，采用SignalP 3.0在線服務(wù)器對rBAT氨基酸序列預(yù)測分析，結(jié)果顯示1-105位氨基酸(MSSTKITNIDAVELQEGIQNAAFHEDDDDTSNASSSREQQATSVSVTRPEENEYTQIKPYAGMPKEVLMLYSRKACYR)可能為其抗原決定簇。本實驗采用原核表達系統(tǒng)，表達長度為78個氨基酸、具有一個抗原決定簇的多肽。(3)抗原決定簇部分rBAT基因rBAT_P的克隆及重組質(zhì)粒pMD 19_T_rBAT-P的構(gòu)
建
采用rBAT-F2和rBAT_R2引物，以pGEM_T_rBAT質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件為950C 3 min, 940C 30s, 53.5°C 50s, 72°C 2min 15s，33 個循環(huán)，72°C lOmin，16°C保溫。在250 bp附近獲得一條特異性條帶(圖3)(實際大小為234 bp)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pMD 19-T載體連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，選取陽性克隆菌株擴大培養(yǎng)，用Plasmid Mini Kit I質(zhì)粒提取試劑盒提取pMD 19-T-rBATT0質(zhì)粒。(4)重組表達質(zhì)粒pET-rBAT-P的構(gòu)建、鑒定將陽性克隆pMD 19-T-rBAT-P與原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)分別用Kpn 及Not ，37 °C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收rBAT-P片段和線性化pET-32a(+)質(zhì)粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設(shè)計連接反應(yīng)體系，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-rBAT-P,并轉(zhuǎn)化萬.co7iRosetta,篩選陽性克隆，進行單雙酶切鑒定。(5) rBAT蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定
將構(gòu)建的基因工程菌按1%接種量接種于新鮮的含有AMP的TB培養(yǎng)液中，37 °C, 200rpm振蕩培養(yǎng)至菌液OD600達到0.5-0.6，加入IPTG (終濃度I mmol/L), 37 V，200 rpm振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h-10 h。誘導(dǎo)表達后的菌液5000 rpm離心3min得到菌體，棄上清，加適量(1(1!120水，與2X上樣緩沖液1:1在1.5 ml Eppendorf管中混合。沸水浴10 min, 5000 rpm離心30 S。取35 μ I樣品進行SDS-PAGE電泳分析，以未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對照菌體樣品和誘導(dǎo)的含有空載體pET-32a(+)表達菌體為對照。SDS-PAGE電泳顯示I條特異性表達條帶，大小約26 kDa (圖4)，而陰性對照組在此位置沒有特異性條帶。2.鯉魚腸道rBAT抗血清的制備
(I)融合蛋白的獲得、純化
將誘導(dǎo)表達的菌液離心，棄上清，按照I g菌體(濕重)加6 ml蒸餾水，吹打混勻，再加等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴10 min，使蛋白變性。進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將分離膠放于0.3 M KCl里染色幾分鐘，顯示目的條帶。切下膠上的目的蛋白條帶，放入ddH20里清洗。將膠條剪碎放入塑料培養(yǎng)皿中，冷凍干燥I d，放入研缽中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計檢測蛋白濃度。( 2 )免疫新西蘭長耳兔與采血
將蛋白溶液稀釋一定的比例，使終蛋白濃度維持在一定濃度；乳化:耳緣靜脈注射:
0.8 ml蛋白溶液(約375 μδ/πι1)+0.4 ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；皮內(nèi)注射:1 ml蛋白溶液(約200 μδ/πι1)+1 ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法:第一、二次采用耳緣靜脈注射法，第三、四次采用皮內(nèi)多點(4-6點)注射法；每隔10 d加強免疫I次(第I次免疫加完全弗氏佐劑，以后加強免疫時用不完全弗氏佐劑)。④第四次免疫后8 d頸動脈采血(兔子在采血前禁食I d)。采集血樣收集于經(jīng)滅菌并不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2 h，待血液凝塊后，放4 °C過夜，使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中，血凝塊以1500 rpm離心10 min,吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分裝冷凍干燥保存，部分放于4 °C備用。3.鯉魚腸道rBAT抗血清的檢測
(I)抗血清效價的測定
采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):將抗原(純化過的Sgltl融合蛋白)稀釋于包被緩沖液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)中，終濃度為10 Pg/ml，每孔加100 μ ，并設(shè)立空白對照(只加包被緩沖液)，4°C包被過夜后，用IXPBST[I XPBS + (0.05%)Tween 20]，于室溫下洗滌3次，每次3min，然后每孔加100 μ 封閉液(0.5% BSA)，37 °C孵育2 h，IXPBST洗滌3次，加入一抗，血清樣品按IO2-1O9倍比稀釋于IXPBST中，每孔100 μ1，37 °C孵育I h，I X PBST洗滌3次，加入羊抗兔酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗按1: 1000稀釋于IXPBST中，每孔100 μ1，37 °C，1 h，I X PBST洗滌3次，每孔加100μ 顯色液(TMB溶液)，室溫放置10-15 min，加入50 μ1，2 mol/L H2SO4終止，酶標(biāo)儀上判讀結(jié)果?？寡逍r測定結(jié)果見表I。A行是不同稀釋倍數(shù)抗血清(序號1-8) ;B行為正常兔子的血清；C行是沒有包被抗原的陰性對照。通過酶標(biāo)儀測定Sgltl抗血清OD45tl值，采用終點“滴度”表示法判斷結(jié)果，rBAT抗血清的效價為4X 105。表I ELISA測定抗體效價
權(quán)利要求
1.鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟:(I)克隆鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的基因，通過分析膜蛋白rBAT的三維結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和抗原決定簇，利用原核表達具有抗原決定簇的部分rBAT基因片段作為免疫抗原蛋白代替表達全長基因；(2)構(gòu)建氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的基因工程菌；(3)氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT基因工程菌的誘導(dǎo)表達與鑒定；(4)制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT抗原；(5)免疫兔子；(6)采血樣測定鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的效價；(7)頸動脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的兔抗血清；(8)免疫組織化學(xué)方法檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)中制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT抗原的具體步驟為:將步驟(3)誘導(dǎo)表達的菌液離心，棄上清，按照濕重I g的菌體加6 ml的蒸餾水，吹打混勻，再加入與上述菌體混合液等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴10 min，使蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將分離膠放于0.3 M KCl溶液里染色，顯示目的條帶，切下膠上的目的蛋白條帶，放入ddH20里清洗，將膠條剪碎放入塑料培養(yǎng)皿中，冷凍干燥I d，放入研缽中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計檢測蛋 白濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)中免疫兔子的具體步驟為:按注射要求將蛋白溶液稀釋；乳化:耳緣靜脈注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩，皮內(nèi)注射:1 ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法:第一、二次采用耳緣靜脈注射法,第三、四次采用皮內(nèi)多點注射法；每隔10 d加強免疫I次，第I次免疫加完全弗氏佐劑，以后加強免疫時用不完全弗氏佐劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于所述的步驟(7)中頸動脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的兔抗血清的具體步驟為:步驟(5)中第四次免疫后8 d頸動脈采血，兔子在采血前禁食I d，采集血樣收集于經(jīng)滅菌并不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2 h，待血液凝塊后，4 1:保存使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中，血凝塊以1500 rpm離心10 min，吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分裝冷凍干燥保存，部分放于4 °C備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案要點為鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT兔抗血清的制備方法，包括以下步驟(1)克隆鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的基因；(2)構(gòu)建rBAT的基因工程菌；(3)氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT基因工程菌的誘導(dǎo)表達與鑒定；(4)制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT抗原；(5)免疫兔子；(6)采血樣測定鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的效價；(7)頸動脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運亞基rBAT的兔抗血清；(8)免疫組織化學(xué)方法檢測。本發(fā)明采用表達跨膜蛋白的具有抗原決定簇部分基因片段作為抗原蛋白代替全長基因，解決了跨膜蛋白無法表達的難題。
文檔編號C07K16/18GK103214575SQ20131008452
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者聶國興, 王俊麗, 明紅, 王貝, 劉起麗, 段艷艷 申請人:河南師范大學(xué)