專利名稱：真核基因表達(dá)盒和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因表達(dá)盒。該表達(dá)盒可用于在真核細(xì)胞中指導(dǎo)異源基因的長期表達(dá)。本發(fā)明還涉及所說表達(dá)盒在基因治療，疫苗生產(chǎn)，以及基因作用分析的方法中的用途。本發(fā)明也涉及包含所說表達(dá)盒的載體，包括病毒毒株。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(HSV)經(jīng)常作為神經(jīng)系統(tǒng)的合適的基因傳遞的載體，因為它為神經(jīng)營養(yǎng)生活型并具有在神經(jīng)元中保持細(xì)胞終生的潛伏能力。這一獨特能力暗示，通過合適的開發(fā)這種載體系統(tǒng)僅僅施用一次就可對一定的疾病具有終生治療益處，如帕金森氏病其中酪氨酸羥化酶或者GDNF在人腦中的表達(dá)顯示了優(yōu)勢。
然而，雖然不完整皰疹病毒顯示了在體內(nèi)有效地向神經(jīng)系統(tǒng)和其它組織傳送基因，但由皰疹基因組表達(dá)的異源基因的轉(zhuǎn)錄常常只持續(xù)很短的時間(＜1周)。當(dāng)皰疹基因組處于病毒潛伏狀態(tài)期間所保持的轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄就停止。這樣，盡管皰疹載體DNA在治療的細(xì)胞中有可能保持至細(xì)胞終生，然而由于異源基因通常不被轉(zhuǎn)錄(目前)，所以治療效果僅僅在短期內(nèi)得以顯示。
那么，如果開發(fā)出在潛伏期間能保持活性的啟動子系統(tǒng)，當(dāng)治療效果在病毒的潛伏期間仍能繼續(xù)，就能認(rèn)識到這些皰疹病毒載體的廣泛的潛在價值。這類啟動子的另一種所需性質(zhì)是它們只在將要治療的細(xì)胞類型(即神經(jīng)元或神經(jīng)元亞類或其它特定的細(xì)胞類型)中具有活性，這樣阻止了在某些情況下可能有害的潛在地治療基因的不適當(dāng)表達(dá)。這樣基因治療限于作用于將要治療的靶細(xì)胞。
單純皰疹病毒(造成唇皰疹(HSV1)或生殖皰疹(HSV2))通過皮膚或粘膜表面的磨損感染感覺神經(jīng)元的軸索的末端，接著，它們在細(xì)胞體中遷移至核，并建立潛伏感染或發(fā)生裂解復(fù)制。影響決定潛伏或裂解感染的因素尚未得以充分了解。然而，在不完整病毒載體的情況下只有潛伏途徑是可能的。
在潛伏期間，皰疹基因組很大程度上為轉(zhuǎn)錄失活。然而在該基因組的長重復(fù)片段中的一個小區(qū)域轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生與潛伏有關(guān)的轉(zhuǎn)錄物(LAT)，本文描述的是HSV1(HSV2類似)。LATs分為兩類，分別為由含TATA啟動子(參見Coffin和Latchman，1996；本文敘述為LAT p1)轉(zhuǎn)錄的低豐度的共線性的較大(約8千堿基(kb))的轉(zhuǎn)錄物，和豐度稍高的約2kb和1.5kb的轉(zhuǎn)錄物(其被認(rèn)為是由較大轉(zhuǎn)錄物剪接的嵌套的穩(wěn)定內(nèi)含子)。1.5kb轉(zhuǎn)錄物僅僅在神經(jīng)元中檢測到，并且在潛伏期間二者的豐度增加。在LAT p1和2kb LAT的起點之間鑒定出第二個具有十分弱的啟動子活性的區(qū)域(參見Goins等，1994；本文敘述為LAT P2)，這說明在它一些條件下該區(qū)可以單個獨轉(zhuǎn)錄物的形式進(jìn)行表達(dá)。
利用LAT啟動子驅(qū)動插入到病毒基因組中的異源基因的長期表達(dá)幾乎不能成功。利用LAT P1啟動子在短期內(nèi)能引起高表達(dá)水平，但是在幾天后轉(zhuǎn)錄迅速被關(guān)閉。異源基因在內(nèi)源性LAT P2啟動子后各個位置的插入確實顯示了長期活性，但活性十分微弱(參見Coffin和Latchman，1996)。類似地，已報導(dǎo)一個插入到由LAT P2啟動子(其連接在lacZ編碼區(qū)上)組成的LAT區(qū)域(在糖蛋白C區(qū)域)的外部的構(gòu)建體在背根神經(jīng)節(jié)中體外情況下顯示長期活性，但是活性也是十分微弱(例如，Goins等，1994)。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及一種表達(dá)盒，其包含單純皰疹病毒LAT P2區(qū)，啟動子以及異源基因(按該順序有效連接)。本發(fā)明基于LAT P2區(qū)域可使鄰近啟動子具有長期活性這一驚人發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上。更重要的是，利用LAT P2區(qū)域和鄰近啟動子來驅(qū)動異源基因的表達(dá)不僅引起異源基因的長期表達(dá)，而且處于表達(dá)高水平。單個LAT P2元件也可用來驅(qū)動由成對啟動子控制地長期表達(dá)。此時位于中間的LAT P2元件的側(cè)翼是兩個背向它并且方向相反的啟動子，這樣將兩個異源基因與這些啟動子有效連接，可使這兩個基因得到長期表達(dá)。
我們的假說是上述稱作為LAT P2(參見Coffin和Latchman，1996)或LAP 2啟動子(Goins等，1994)的HSV基因組的區(qū)域在潛伏狀態(tài)期間其自身不提供啟動子活性。而是，它在周圍區(qū)域提供改變的DNA結(jié)構(gòu)使得在以其它方式轉(zhuǎn)錄失活的潛伏基因組中由鄰近啟動子控制的轉(zhuǎn)錄能夠持續(xù)。
核酸構(gòu)建體(包括病毒毒株，特別是HSV毒株及包含所說的表達(dá)盒可用于，例如，在治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損傷(包括帕金森氏病，脊柱損傷或中風(fēng))，或者眼疾，心臟或骨胳肌疾病，或惡性腫瘤的方法中傳遞治療基因，或者傳遞編碼特定以作為疫苗的抗原的基因。
本發(fā)明也涉及用于研究真核細(xì)胞(尤其是哺乳動物的細(xì)胞)的基因的功能的方法中，例如，鑒定基因互補(bǔ)細(xì)胞機(jī)能障礙，或者在野生型或突變體細(xì)胞中研究突變基因表達(dá)的影響。本發(fā)明的方法特別適用于疾病相關(guān)基因的功能研究。
因此本發(fā)明提供了一種包含按該順序有效連接的HSV潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄物P2區(qū)，啟動子以及異源基因的表達(dá)盒。優(yōu)選的所說的啟動子是與潛伏非相關(guān)的轉(zhuǎn)錄啟動子。更優(yōu)選的啟動子是病毒的啟動子或哺乳動物的啟動子。優(yōu)選的啟動子是使得異源基因在哺乳動物細(xì)胞中得以表達(dá)的病毒啟動子或哺乳動物的啟動子，其中所說的細(xì)胞優(yōu)選的是中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞，或眼的細(xì)胞，心臟或骨骼肌的細(xì)胞，更優(yōu)選的是中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。啟動子也可以是誘導(dǎo)型和/或組織特異性。
這樣表達(dá)盒或載體(優(yōu)選的是病毒毒株，更優(yōu)選的是HSV毒株及包含本發(fā)明的表達(dá)盒)可用于將異源基因傳送至它將加以表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)。這樣的表達(dá)盒和載體在多種應(yīng)用中有用，例如，基因治療，疫苗，基因功能的體外或體內(nèi)分析方法或研究。
術(shù)語異源基因旨在包括任何在HSV基因組中未發(fā)現(xiàn)的基因。異源基因可以是任何野生型基因的等位基因的變體，或者是突變基因。異源基因優(yōu)選地編碼具有治療用途的多肽，包括具有細(xì)胞毒性的或能夠把前藥轉(zhuǎn)化成為細(xì)胞毒性化合物的多肽。
基因治療和其它治療應(yīng)用可能都要求施用多基因。多基因的表達(dá)對多種疾病的治療有利，例如利用多神經(jīng)營養(yǎng)因子。由于HSV沒有其它病毒載體系統(tǒng)的包裝能力限制，因此HSV格外適用。這樣可將多個異源基因置于它的基因組內(nèi)部。本發(fā)明，例如，至少有兩種方法可完成這一目的。例如，可將多個本發(fā)明的表達(dá)盒引入到特定HSV毒株中。每一表達(dá)盒可以包含一個異源基因。另一方法是利用成對的背向定位中間的LAT P2元件并且方向相反的啟動子(相同或不同的啟動子)，這些啟動子分別驅(qū)動異源基因(相同或不同的異源基因)的表達(dá)。
這樣本發(fā)明也提供了一種還包含第二啟動子和第二異源基因的表達(dá)盒，其中所說的啟動子和異源基因按該順序與HSV LAT P2區(qū)有效連接，并以與第一啟動子和第一異源基因取向相反的方式連接。第二啟動子可以與第一啟動子相同或不同。第二異源基因可以與第一異源基因相同或不同。在特別優(yōu)選的實施方案中，第一啟動子是非LAT啟動子，第二啟動子是LAT p1啟動子。
總之，這種排列提供了一對啟動子/異源基因構(gòu)建體以方向相反的方式位于單個LAT P2區(qū)的側(cè)翼，這使得成對的基因得以長期表達(dá)，其中所說的基因可以相同或不同，可由相同或不同的啟動子驅(qū)動。
也可利用組合方法，即將一個或多個第一種類型的表達(dá)盒與一個或多個第二種類型的表達(dá)盒一起導(dǎo)入到HSV毒株的基因組內(nèi)。因而，在合適的地方，被稱為″表達(dá)盒″的應(yīng)包括任一類型的多重表達(dá)盒。
本發(fā)明進(jìn)一步提供表達(dá)盒與載體的利用，優(yōu)選的是包含表達(dá)盒的HSV毒株在人類和動物的治療上的用途。例如，包含表達(dá)盒的HSV毒株可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損傷(包括帕金森氏病，脊柱損傷或中風(fēng))，或者眼疾，心臟或骨胳肌疾病，或惡性腫瘤的治療。減毒處理這些HSV毒株，使得它們不能在人和動物細(xì)胞中經(jīng)歷裂解循環(huán)。
本發(fā)明的表達(dá)盒也可用于研究真核細(xì)胞(優(yōu)選的是哺乳動物的細(xì)胞)的基因的功能的方法中，例如，鑒定基因互補(bǔ)細(xì)胞機(jī)能障礙，或者在野生型或突變體細(xì)胞中研究突變基因表達(dá)的影響。本發(fā)明的方法特別適用于疾病相關(guān)基因的功能研究。
本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生病毒毒株(優(yōu)選的是包含本發(fā)明的表達(dá)盒的HSV毒株)的方法，該方法包括優(yōu)選地通過同源重組的方法將本發(fā)明的表達(dá)盒導(dǎo)入到病毒毒株的基因組內(nèi)。發(fā)明詳述A.表達(dá)盒-LAT P2區(qū)，啟動子，異源基因本發(fā)明的表達(dá)盒本質(zhì)上包括按該順序有效連接的LAT P2區(qū)，啟動予以及異源基因。術(shù)語″有效連接″是指并列連接，其中的組分處于可使他們按所計劃的方式起作用的關(guān)系中。這樣，例如，與異源基因序列有效連接的啟動子以可使異源基因在一定條件(其適合由啟動子控制的表達(dá)活化)下可完成表達(dá)的方式進(jìn)行連接。
表達(dá)盒還包含按該順序與HSV LAT P2區(qū)有效連接并與第一啟動子和第一異源基因以取向相反的方式連接的第二啟動子和第二異源基因，其中所說的第二啟動子和第二異源基因可以與第一啟動子和第一異源基因相同或不同。這樣一對啟動子/異源基因構(gòu)建體以方向相反的方式位于單個LAT P2區(qū)側(cè)翼，這使得成對的基因得以長期表達(dá)，其中所說的基因可以相同或不同，可由相同或不同的啟動子驅(qū)動。此外，在合適的生理條件下，第一異源基因的產(chǎn)物可調(diào)節(jié)第二異源基因或反過來也一樣的表達(dá)。
術(shù)語″長期表達(dá)″是指在被本發(fā)明的單純皰疹病毒感染的細(xì)胞中即使單純皰疹病毒進(jìn)入潛伏狀態(tài)后的異源基因的表達(dá)，優(yōu)選的，至少兩周，更優(yōu)選的在感染后至少一個或兩個月，最優(yōu)選的是細(xì)胞終生。
表達(dá)盒的構(gòu)筑可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)克隆技術(shù)(參見，例如，Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊；冷泉港出版社)。1.LAT P2域本文定義LAT P2域為HSV1核苷酸118，866-120，219(基因庫HE1CG從PstI-BstXI位點)或者該區(qū)域的片段或衍生物，其中所說的區(qū)域包括能使異源基因在本發(fā)明的表達(dá)盒中長期表達(dá)的與HSV2同源的區(qū)域。2.啟動子啟動子是指非來源于HSV的LAT P2區(qū)域的轉(zhuǎn)錄啟動子。術(shù)語啟動子為本領(lǐng)域人員所熟知，其包括在大小和復(fù)雜度上從最小的啟動子至包含上游元件和增強(qiáng)子的啟動子的核酸區(qū)域。將啟動子與LAT P2區(qū)域和其下游有效連接。將第二啟動子以相反的取向有效連結(jié)在LATP2區(qū)域的上游也是可能的，這樣LAT P2區(qū)域授與兩個啟動子具有長期活性。
啟動子從在哺乳動物(優(yōu)選的是人類)的細(xì)胞中具有功能的啟動子中進(jìn)行選擇。啟動子可來源于病毒或真核基因的啟動子序列。例如，它可以是來源于在其內(nèi)的異源基因的表達(dá)能發(fā)生的細(xì)胞的基因組的啟動子，優(yōu)選的是哺乳動物的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。關(guān)于真核啟動子，它們可以是以普遍方式起作用的啟動子(如α-肌動蛋白的，β-肌動蛋白，微管蛋白的啟動子)，或者，還有以組織特異性方式起作用的啟動子(如丙酮酸激酶基因的啟動子)。尤其優(yōu)選的是僅僅在特定神經(jīng)元的細(xì)胞類型內(nèi)活化的啟動子(例如酪氨酸羥化酶(TH)的，L7的，或神經(jīng)元特異性的烯醇化酶(NSE)的啟動子)。它們也可以是對特定刺激作出反應(yīng)的啟動子，例如結(jié)合甾族激素受體的啟動子。也可利用病毒的啟動子，例如Moloney鼠白血病病毒長末端重復(fù)序列，(MMLV LTR)啟動子，HSVI或HSV2 LAT p1啟動子，rous肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人類巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動子。
啟動子為誘導(dǎo)型的更有利，這樣在細(xì)胞生命期內(nèi)可調(diào)節(jié)異源基因的表達(dá)水平。誘導(dǎo)性是指可以調(diào)節(jié)利用啟動子所獲得的表達(dá)水平。例如，在優(yōu)選的實施方案中其中兩個啟動子以相反的方向位于單個LATP2區(qū)域的側(cè)翼，其中一個啟動子包含了對以前報導(dǎo)的tet阻遏物/VP16轉(zhuǎn)錄激活融合蛋白質(zhì)作出響應(yīng)的啟動子(Gossen和Bujard，1992；Gossen等，1995)，其并且驅(qū)動要調(diào)節(jié)的異源基因的表達(dá)。第二啟動子將包含一個強(qiáng)啟動子(例如CMV IE啟動子)，其驅(qū)動tet阻遏物/VP16融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。這樣在這一例子中第一異源基因的表達(dá)將取決于四環(huán)素的存在或缺乏。
此外，這些啟動子的之任一可以通過增加另外的調(diào)節(jié)序列(例如增強(qiáng)子序列)進(jìn)行修飾。也可以利用嵌合的啟動子，其包含來自上述兩個或多個不同啟動子的序列元件。3.異源基因術(shù)語″核酸″包括核糖核酸，脫氧核糖核酸以及其類似物。術(shù)語異源基因包含任何除了HSV基因組中存在的基因。異源基因可以是任何野生型基因的等位基因的變體，或者是突變基因。術(shù)語″基因″旨在于包括能至少被轉(zhuǎn)錄的各種核酸序列。這樣，這一定義包括了編碼信使核糖核酸，轉(zhuǎn)移RNA和rRNA的序列。關(guān)于啟動子其序列可以是有義或反義取向。按照大家熟知技術(shù)可利用反義構(gòu)建體阻止細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。編碼信使核糖核酸的序列可以選擇性地包括一些或所有5′和/或3′端天然轉(zhuǎn)錄的但是不翻譯的側(cè)翼序列，或者其以其它方式與翻譯的編碼序列相聯(lián)。它還可選擇性地包括通常與所轉(zhuǎn)錄的序列相關(guān)聯(lián)的有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄終止信號，聚腺苷酸化位點以及下游增強(qiáng)子元件。
異源基因可以編碼，例如，與細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)的有關(guān)蛋白質(zhì)，例如生長因子(包括神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(如腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子，膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子，NGF，NT3，NT4和NT5))，細(xì)胞因子(如α-，β-或γ-干擾素，白介素(包括IL-I，IL-2)，腫瘤壞死因子，或類胰島素的生長因子I或II)，蛋白激酶(如MAP激酶)，蛋白磷酸酶和任何上述物質(zhì)的細(xì)胞受體。異源基因可以編碼與細(xì)胞代謝途徑有關(guān)的酶，例如與氨基酸的生物合成或降解有關(guān)的酶(如酪氨酸羥化酶)，與嘌呤或嘧啶生物合成或降解有關(guān)的酶，以及與神經(jīng)遞質(zhì)(如多巴胺)的生物合成或降解有關(guān)的酶，或者編碼調(diào)節(jié)這些途徑的蛋白質(zhì)，例如蛋白激酶和磷酸酶。異源基因也可編碼與它們的調(diào)節(jié)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或蛋白質(zhì)，例如Bm3家族的成員，或Rb家族的小型蛋白諸如Rb或p107，膜蛋白(如視紫紅質(zhì))，結(jié)構(gòu)蛋白(如肌營養(yǎng)不良蛋白)或熱休克蛋白質(zhì)如hsp70。
優(yōu)選的是異源基因編碼具有治療用途的多肽或其功能可能與疾病過程相關(guān)的多肽。例如，上述蛋白質(zhì)中的酪氨酸羥化酶和膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子可用于治療帕金森氏病，視紫紅質(zhì)可用于治療眼疾，肌營養(yǎng)不良蛋白可用來治療肌肉萎縮，熱休克蛋白質(zhì)可用來治療與局部缺血緊張相關(guān)的心腦病。治療用途的多肽也可包括細(xì)胞毒性多肽(如蓖麻毒蛋白)或利用(例如，定位病毒的酶前藥治療或定位基因的酶前藥治療的方法，能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)化成為細(xì)胞毒性的化合物的酶。在后者情況下，要求保證酶具有合適的信號序列以定位到細(xì)胞表面，優(yōu)選的是使得酶暴露在細(xì)胞表面的外部但錨定在細(xì)胞膜上的信號序列。合適的酶包括細(xì)菌的硝基還原酶(如WO93/08288描述的大腸桿菌硝基還原酶)或羧肽酶，尤其是WO88/07378描述的羧肽酶CPG2。其它酶在參考EP-A-415731中可找到。合適的前藥包括氮芥前藥和其它化合物如本文一并參考的WO88/07378，WO89/10140，WO90/02729和WO93/08288中所描述的那些化合物。
異源基因也可編碼作為疫苗利用的抗原多肽。優(yōu)選地，這些抗原多肽來自致病有機(jī)體例如細(xì)菌或病毒或腫瘤。
異源基因也可包括標(biāo)記基因(例如編碼β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白)或其產(chǎn)物調(diào)節(jié)其它基因的表達(dá)的基因(例如，上述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子包含tet阻遏物/VP16轉(zhuǎn)錄激活融合蛋白)。B.載體表達(dá)盒可以以裸露的核酸構(gòu)建體形式進(jìn)行利用。此外，可將它導(dǎo)入到各種核酸載體中。載體包括質(zhì)粒和病毒載體，優(yōu)選的是HSV載體。載體還可包含位于表達(dá)盒側(cè)翼的序列，它們含有與真核基因組序列同源的序列，優(yōu)選的是哺乳動物的基因組序列，或病毒的基因組序列。這可把表達(dá)盒通過同源重組而導(dǎo)入真核細(xì)胞或病毒的基因組內(nèi)。具體地說，包含側(cè)翼為病毒序列(優(yōu)選的是HSVI或HSV2序列)的表達(dá)盒的質(zhì)粒載體可用來制備適于向哺乳動物的細(xì)胞傳送表達(dá)盒的病毒載體(優(yōu)選的是HSV載體)。下文詳述單純皰疹病毒。然而，所采用的技術(shù)是技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，并且其適于其它病毒如腺病毒。其它的合適的病毒載體的例子包括能夠?qū)⑵渌鼈兊娜旧w組整合到宿主細(xì)胞的基因組上的病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒和腺伴隨病毒。C.單純皰疹病毒載體1.病毒毒株本發(fā)明的包含表達(dá)盒的HSV毒株可來自例如HSV1或HSV2毒株，或者其衍生物，優(yōu)選的是HSV1。衍生物包括包含HSV1和HSV2毒株的DNA的類型內(nèi)的重組體。優(yōu)選地，衍生物具有與HSV1或HSV2基因組至少70％的序列同源性，更優(yōu)選的至少90％，尤其優(yōu)選的95％。
在治療方法中利用HSV毒株要求減毒毒株處理，這樣它們不能建立裂解循環(huán)。具體地說，如果將HSV載體用于人類基因治療中，表達(dá)盒應(yīng)該優(yōu)選地插入一個必需基因。這是因為如果載體病毒遇到野生型病毒，通過重組可以發(fā)生異源基因轉(zhuǎn)移到野生型病毒。然而，只要異源基因中插入了一個必需基因，重組轉(zhuǎn)移將使受體病毒中缺失必需基因，并且阻止異源基因“逃跑”成為感受態(tài)野生型病毒的復(fù)制。
減毒毒株可用來產(chǎn)生本發(fā)明的HSV毒株，本文僅僅給出其例子，包括在ICP34.5或ICP27有突變的毒株，例如均發(fā)生ICP34.5突變的毒株1716(MacLean等，1991)，毒株R3616和R4009(Chou和Roizman，1992)和R930(Chou等，1994)，以及ICP27缺失的d27-1(Rice和Knipe，1990)。此外，ICP4，ICP0，ICP22，ICP6，ICP47，vhs或gH缺失的毒株，在VMW65發(fā)生失活突變的毒株，或上述的任何組合均可用來產(chǎn)生本發(fā)明的HSV毒株。
用于描述各種HSV基因的術(shù)語參見Coffin和Latchman，1996。2.互補(bǔ)細(xì)胞系ICP27缺損的HSV病毒在表達(dá)ICP27細(xì)胞株中進(jìn)行繁殖，例如V27細(xì)胞(Rice和Knipe，1990)，2-2細(xì)胞(Smith等，1992)或B130/2細(xì)胞(參見實施例)，優(yōu)選的是B130/2細(xì)胞。
通過用一種包含功能HSV ICP27基因(其能在所說的細(xì)胞中被表達(dá))的載體(優(yōu)選的是質(zhì)粒載體)和編碼選擇性標(biāo)記(例如新霉素抗性)的載體(優(yōu)選的是質(zhì)粒載體)共轉(zhuǎn)染哺乳動物的細(xì)胞(例如Vero或BHK細(xì)胞)可制備表達(dá)ICP27的細(xì)胞系。然后篩選具有選擇性標(biāo)記的克隆，并進(jìn)一步確定哪些克隆也表達(dá)有功能的ICP27，例如利用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法(例如Rice和Knipe，1990所描述的方法)根據(jù)他們支持ICP27～突變HSV毒株的生長的能力確定。
如上述制備不會使ICP27～突變HSV毒株回復(fù)突變成具有有功能的ICP27毒株的細(xì)胞系，確保含有功能ICP27基因的載體不含有與ICP27～突變體病毒重疊(即同源)的序列。
當(dāng)本發(fā)明的HSV毒株包含對其它必需基因(例如ICP4)的失活修飾時，互補(bǔ)細(xì)胞系將還包含一個有功能的HSV基因，其以ICP27的所描述的相同方式互補(bǔ)被修飾的必需基因。3.突變方法通過本領(lǐng)域中熟知的幾種技術(shù)可使HSV基因的功能失活。例如，通過缺失，取代或插入(優(yōu)選的是缺失)可使它們功能失活。缺失可除去部分或整個基因。插入的序列可以包括上述的表達(dá)盒。
HSV毒株的突變可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的同源重組的方法得到。例如，用含有突變序列(其側(cè)翼為HSV的同源序列)的載體(優(yōu)選的是質(zhì)粒載體)轉(zhuǎn)染HSV基因組DNA。突變序列可包含缺失，插入或取代，所有這些可通過常規(guī)技術(shù)來構(gòu)建。插入可包括選擇性標(biāo)記基因，例如lacZ，例如，通過β-半乳糖苷酶活性來篩選重組病毒。
也可在其它HSV基因中獲得突變，例如基因ICP0，ICP4，ICP6，ICP22，ICP47，VMW65，gH或vhs。為VMW65基因時，整個基因不能全缺失，因為它編碼一種必需的結(jié)構(gòu)蛋白，但是可進(jìn)行小的失活插入其可消除VMW65轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)E基因的能力(Ace等，1989)。4.包含表達(dá)盒的HSV毒株表達(dá)盒可插入到HSV基因組中的任何位置，只要病毒仍然可以繁殖，如果異源基因插入在必需基因內(nèi)，那么要求利用攜帶另一個HSV必需基因的細(xì)胞系(如2.所描述的)。例如，如果異源基因插入在HSV毒株的ICP27基因內(nèi)，那么需要表達(dá)ICP27的細(xì)胞系。表達(dá)盒優(yōu)選插入到ICP27突變的區(qū)域內(nèi)，因為在不太可能事件中突變通過與野生型病毒的重組得到修復(fù)，這種修復(fù)除去了插入的表達(dá)盒。
例如，如同上述的導(dǎo)入突變，通過HSV毒株與具有表達(dá)盒(其側(cè)翼是HSV序列)的質(zhì)粒載體的同源重組可將表達(dá)盒插入到HSV基因組中。利用本領(lǐng)域熟知的克隆技術(shù)可將表達(dá)盒導(dǎo)入到包含HSV序列的合適的質(zhì)粒載體中。
在病毒基因組內(nèi)插入多個表達(dá)盒是可能的，這樣一個病毒載體可包含多個本發(fā)明的表達(dá)盒。
通過克隆包含了內(nèi)源性LAT P2區(qū)域的下游區(qū)有效連接了異源基因的啟動子的構(gòu)建體來利用內(nèi)源性LAT P2區(qū)域也是可能的。另一個構(gòu)建體可以相反的取向克隆到LAT P2區(qū)域的上游區(qū)。這樣所形成的病毒將包含本發(fā)明的表達(dá)盒，但是其通過與上述稍不同的方法來制備。D.施用本發(fā)明的表達(dá)盒可用來向需要治療的人或動物傳送治療基因。具體地說，單純皰疹病毒的神經(jīng)營養(yǎng)性質(zhì)使得利用包含本發(fā)明的表達(dá)盒的減毒HSV毒株非常適于治療某些疾病，例如帕金森氏病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，脊椎損傷，中風(fēng)或惡性腫瘤，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤。此外，本發(fā)明的表達(dá)盒可用來傳送作為疫苗用途的編碼潛在免疫原性的多肽的基因。
本發(fā)明的表達(dá)盒可以以裸露的核酸構(gòu)建體(優(yōu)選的還包含側(cè)翼的與宿主細(xì)胞基因組同源的序列)形式直接施用。通過幾種已知的技術(shù)(包括biolistic轉(zhuǎn)化和脂轉(zhuǎn)染技術(shù))促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞攝取裸露的核酸構(gòu)建體。
此外，表達(dá)盒可以作為核酸載體的一部分來施用，這些載體包括質(zhì)粒載體或病毒載體，優(yōu)選的是HSV。
優(yōu)選地，送遞載體(即，例如裸露的核酸構(gòu)建體或包含表達(dá)盒的病毒載體)以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相結(jié)合以產(chǎn)生藥物組合物。合適的載體和稀釋液包括等滲鹽溶液，例如磷酸緩沖鹽水?？蓪⒔M合物制成腸胃外，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，顱內(nèi)，皮下，眼內(nèi)，以及透皮施用的制劑。
將含有用于基因治療的治療基因的表達(dá)盒以其會在適當(dāng)?shù)膮^(qū)域整合到細(xì)胞內(nèi)的方法來施用藥物組合物。例如，當(dāng)基因治療的靶是中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)并且表達(dá)盒由單純皰疹病毒載體進(jìn)行傳送時，可在突觸末端定位的區(qū)域中施用組合物，這樣末端可攝取這些病毒并且通過逆行軸索運輸以一種逆行的方式經(jīng)軸突運輸至軸索的細(xì)胞體中。通常通過趨實體性接種方法將藥物組合物施用至人腦。當(dāng)施用藥物組合物至眼時，視網(wǎng)膜下注射是通常采用的技術(shù)。
當(dāng)用病毒載體將表達(dá)盒傳送至細(xì)胞時，所施用的病毒的量通常在103至1010pfu的范圍內(nèi)，優(yōu)選105至108pfu，更優(yōu)選106至107pfu。注射時，通常施用1-10μl位于藥學(xué)上可接受的合適的載體或稀釋劑中的病毒。
當(dāng)表達(dá)盒以裸露的核酸形式施用時，所施用的核酸的量通常在1μg-10mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選100μg至1mg。
當(dāng)異源基因處于誘導(dǎo)型啟動子的控制下時，在治療整段時期內(nèi)只需誘導(dǎo)基因的表達(dá)。一旦疾病治愈了，除去誘導(dǎo)物，異源基因的表達(dá)即停止。這點具有很大的臨床優(yōu)點。例如，這樣一種系統(tǒng)包括上述的施用抗生素四環(huán)素，其通過影響tet阻遏物/VP16融合蛋白質(zhì)而激活基因表達(dá)。
在利用本發(fā)明的表達(dá)盒的治療中，組織特異性啟動子具有協(xié)助作用。例如，幾種神經(jīng)疾病是由于僅僅在小子集細(xì)胞中的特定基因產(chǎn)物的異常表達(dá)而引起的。僅在相關(guān)影響的細(xì)胞類型中表達(dá)治療基因?qū)⑹怯欣模绕湓谶@樣的基因在其它細(xì)胞類型中表達(dá)時有毒性的情況下。
所描述的施用途徑和劑量僅僅作為指導(dǎo)，因為熟練的醫(yī)師能夠針對任何具體的患者與疾病決定最佳施用途徑和劑量。E.分析方法本發(fā)明的表達(dá)盒也可用于科學(xué)研究的方法中。這樣，本發(fā)明的另一方面還涉及在體外或體內(nèi)分析真核細(xì)胞(優(yōu)選的是哺乳動物的細(xì)胞)中的基因功能的方法。異源的功能可由下列方法來確定(a)將本發(fā)明的包含所說異源基因的表達(dá)盒導(dǎo)入到真核細(xì)胞內(nèi)；并且(b)檢測所說異源基因在所說的細(xì)胞中的表達(dá)作用。
例如，某些細(xì)胞具有細(xì)胞分裂時的溫度敏感缺陷。若按照本發(fā)明將包含異源基因的表達(dá)盒導(dǎo)入到缺陷細(xì)胞內(nèi)并且這些細(xì)胞在限定的溫度下生長，技術(shù)人員將易于檢測出異源基因是否能彌補(bǔ)細(xì)胞分裂中的缺陷。類似地，如果異源基因的表達(dá)能糾正細(xì)胞中可觀察到的突變表型，那么可以應(yīng)用其它已知的技術(shù)進(jìn)行檢測。
這種方法也可用于進(jìn)行異源基因的系統(tǒng)突變以確定由該基因編碼的蛋白質(zhì)的哪一個區(qū)域與恢復(fù)突變表型有關(guān)。
本方法也可用于具有所謂的″基因剔除″的動物，例如小鼠。利用本發(fā)明的表達(dá)盒將野生型異源基因?qū)氲絼游矬w內(nèi)，并利用本領(lǐng)域已知的各種行為學(xué)的，組織化學(xué)的，以及生化的分析方法確定對動物的影響。此外，可將突變的異源基因?qū)氲揭吧突颉寤蛉笔А宓膭游飪?nèi)，從檢測是否誘導(dǎo)疾病相關(guān)的病理學(xué)。這一應(yīng)用的例子是在嚙齒類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中利用編碼朊病毒的基因誘導(dǎo)Creutzfeld-Jacob和其它朊病毒類型的疾病。其它疾病模型可包括老年癡呆癥，運動神經(jīng)元疾病或帕金森氏病模型。
由于利用一種或多種表達(dá)盒將至少兩個不同的異源基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)是可能的，研究兩種或多種基因產(chǎn)物之間的相互作用也是可能的。
這樣，本發(fā)明的方法尤其可用于研究疾病相關(guān)基因的功能。利用本發(fā)明的方法來研究基因功能的一個優(yōu)點是控制特定基因的暫時表達(dá)的能力意味著在細(xì)胞發(fā)育或修復(fù)中確定哪個階段需要表達(dá)的基因(即使是完全表達(dá))是可能的。
參照下列實施例描述本發(fā)明，這些實施例是說明性的但不是限制性的。實施例實施例1至8，描述了下列構(gòu)建體的可引起長期表達(dá)的LAT P2區(qū)域的利用1.驅(qū)動lacZ長期表達(dá)的MMLV LTR啟動子，其來自ICP34.5缺失的并且VMW65反式激活活性消失的病毒(病毒毒株1764/pR14)中的LAT區(qū)域。本發(fā)明中，MMLV LTR/LacZ盒直接插入在LAT區(qū)域中LAT P2之后。2.驅(qū)動lacZ表達(dá)的CMV啟動子，其來自ICP27缺失的病毒(病毒毒株17+/D27/pR19lacZ)中的LAT區(qū)域。本發(fā)明中，CMV IE啟動子lacZ盒直接插入在LAT區(qū)域中LAT P2之后。3.驅(qū)動lacZ的LAT P2/CMV啟動子，其來自ICP27基因座(即又有ICP27缺失的病毒)(病毒毒株17+/D27/pR20)。本發(fā)明中，利用授與非LAT啟動子長期活性的LAT P2區(qū)域與其它LAT序列隔離。4.一段LAT P2區(qū)域，其下游側(cè)翼有MMLV LTR啟動子/GFP盒且上游端有相反取向的LAT p1啟動子/lacZ盒(pR20.9盒)，并且其被插入到ICP34.5缺失的并且具有VMW65失活突變的病毒(病毒毒株1764/pR20.9)的UL43基因。材料和方法病毒和細(xì)胞系通過同源重組的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，參見Coffin以及Latchman，1996；Coffin等，1996)接著通過X-gal染色檢測lacZ活性，噬斑純化和Southern印跡檢查重組病毒的正確基因組結(jié)構(gòu)從而制備所有病毒。(a)親本病毒和ICP27-互補(bǔ)細(xì)胞系17+/D27w用標(biāo)準(zhǔn)的方法，首先通過同源重組的方法從以前所產(chǎn)生的ICP27缺失的病毒(其中l(wèi)acZ已插入在ICP27基因座內(nèi))中除去lacZ基因，然后X-gal染色之后選擇白噬斑從而可獲得不包含標(biāo)記基因的ICP27缺失的突變體。該病毒命名為17+/D27w，它除了缺失核苷酸113，273-117，854外其它均為野生型，這樣它沒有編碼ICP27(UL54)的序列并且無非必需的基因UL55和UL56，因此它必須培育在表達(dá)ICP27的細(xì)胞系內(nèi)。核苷酸編號是指HSV1毒株17+序列(Genbankno.HE1CG)。
通過在以前制備的ICP27互補(bǔ)BHK細(xì)胞系B130/2中培育可產(chǎn)生ICP27缺失病毒并獲得其儲備，其中互補(bǔ)BHK細(xì)胞系是通過質(zhì)粒pSG130BS(Sekulovich等，1988)DNA與編碼新霉素抗性的質(zhì)粒pMamNeo(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染到BHK細(xì)胞內(nèi)然后選擇具有新霉素抗性的克隆來獲得的。選擇能使HSV1 ICP27缺失突變體高度生長的克隆(B130/2)用于培育病毒。pSG130BS含有來自HSV1(核苷酸113，322-115，743)的BamHI/SacI片段，其編碼完全的ICP27與部分UL55序列。1764以前已描述過HSV毒株1764(Coffin等，1996)。它缺失了編碼ICP34.5的基因(MacLean等，1991)并且在編碼VMW65(毒粒逆激活蛋白)的基因上發(fā)生了失活突變(Ace等，1989)。體外病毒生長ICP34.5是非必需的，而且VMW65可通過在培養(yǎng)基中加入環(huán)己烷-二乙酰胺得以補(bǔ)充(McFarlane等，1992)，因此可培育在BHK細(xì)胞上。實施例1-1764/pR14的構(gòu)建用純化的1764的基因組DNA與質(zhì)粒pR14共轉(zhuǎn)染到BHK細(xì)胞內(nèi)，然后X-gal染色之后選擇藍(lán)噬斑，這樣就可產(chǎn)生病毒毒株1764/pR14。pR14的制備通過將MMLV LTR/lacZ序列插入到pNot 3.5內(nèi)而獲得。pNot 3.5含有的來自克隆在pGem5(Promega)的NotI位點內(nèi)的HSV1的LAT區(qū)域(核苷酸118439-122025)的3.5Kb NotI片段。MMLV LTR/lacZ的插入由兩個步驟來完成1將來自pCH110(Phannacia)的lacZ基因(HindIII-BamHI)插入到pJ4(其包含MMLV LTR啟動子/聚連接物/SV40的聚A序列；(Morgenstern和Land，1990)的HindIII位點內(nèi)，得到pJ4lacZb。
2通過用NheI和PstI切割pJ4lacZ，將來自pJ4lacZ的MMLVLTR/lacZpolyA插入在pNot 3.5的BbsI位點(在LAT P2后端)上，得到pR14。取向LAT P1/LAT P2/LTR/lacZ。實施例2-17+/D27/pR19lacZ的構(gòu)建用純化的17+/D27w基因組DNA與質(zhì)粒pR19lacZ共轉(zhuǎn)染進(jìn)B130/2細(xì)胞內(nèi)，然后X-gal染色后選擇藍(lán)噬斑，來產(chǎn)生病毒毒株17+/D27/pR19lacZ。pR19lacZ是通過將CMV IE啟動子/lacZ/polyA盒插入到pNot 3.5的BstXI位點內(nèi)(即在LAT P2之后)而制備的。首先將來自pCH110(Pharmacia)的lacZ基因(HindIII-BamHI)克隆在pcDNA3(Invitrogen，包含CMV IE啟動子/聚連接物/polyA序列)的BamHI和HindIII位點之間。然后用NruI和BbsI切割CMV IE啟動子/lacZ/polyA盒，并插入到pNot 3.5中的BstXI位點內(nèi)。取向LAT P1/LAT P2/CMV/lacZ/polyA。實施例3-17+/D27/pR20的構(gòu)建用純化的17+/D27w基因組DNA與質(zhì)粒pR20共轉(zhuǎn)染到B130/2細(xì)胞內(nèi)，然后X-gal染色后選擇藍(lán)噬斑，來產(chǎn)生病毒毒株17+/D27/pR20。pR20是通過將LAT P2/CMV IE啟動子/lacZ/polyA盒(來自pR19lacZ的PstI-SrfI。SrfI位點恰好在pNot 3.5內(nèi)BstXI位點后。)插入到pDMN內(nèi)而獲得的。pDMN通過缺失克隆在pACYC184(NBL)內(nèi)的HSVI基因組的EcoR1 B片段的NotI/XmnI片段，留下包含ICP27基因和側(cè)翼序列(HSV1毒株17+核苷酸11095-118439)進(jìn)行制備。通過MluI消化和再連接除去一對編碼整個ICP27編碼序列的MluI片段與非必需基因UL55和56(核苷酸113273-116869)。然后在MluI位點插入LAT P2/CMV IE啟動子/lacZ/polyA盒。實施例4-1764/pR20.9的構(gòu)建用純化的1764基因組DNA與質(zhì)粒pR20.9/43共轉(zhuǎn)染，使得pR20.9盒插入在病毒毒株1764的UL43基因內(nèi)從而產(chǎn)生病毒毒株1764-pR20.9。該構(gòu)建體包含兩個異源基因，第一基因綠色熒光蛋白(GFP)處于MMLV LTR啟動子的控制下，而第二基因lacZ處于LAT p1啟動子的控制下。它們以相反的方向位于LAT P2區(qū)域的側(cè)翼，這樣各基因(lacZ和GFP)從中心位置的LAT P2區(qū)開始以相反的方向轉(zhuǎn)錄。
質(zhì)粒pR20.9/43由下列步驟進(jìn)行構(gòu)建(i)將GFP插入在質(zhì)粒pcDNA3(Invitrogen)內(nèi)，其通過用AgeI和NotI切割下質(zhì)粒pEGFP-N1(Clontech)的GFP基因并將其插入到質(zhì)粒pcDNA3的EcoR1和NotI位點之間來完成，這樣得到質(zhì)粒pcDNA3GFP。GFP基因的起始處定位在CMV啟動子之后。(ii)將來自pJ4(NheI-Hind III)的MMLV啟動子插入到pcDNA3GFP的BamHI位點內(nèi)的，得到了pcMMLVGFP，其中pJ4的NheI位點位于CMV啟動子之后。(iii)將來自pcMMLVGFP的MMLV/GFP/pA盒插入到pNot 3.5內(nèi)，其通過用HindIII和BbsI進(jìn)行切割并插入在pNot 3.5的BstXI位點之間(即在LAT P2序列之后)而完成，其中MMLV啟動子位于LAT P2區(qū)之后，這樣得到了質(zhì)粒p3.5MG。(iv)將來自Ddel-StyI的LAT P1啟動子(nt 118，179-118，877)插入在pGem5(Promega)的EcoRV和SpeI位點之間(方向StyI連接EcoRV，DdeI連接SpeI)，得到pGemSPI。(v)將來自pCH110(Pharmacia)的lacZ(HindIII-BamHI)插入在pGEM5PI的NcoI位點內(nèi)(方向HindIII在LAT P1序列之后)，得到pP1/lacZ。(VI)將編碼一個Srfl位點(5′-GCCCGGGCCATG)的寡核苷酸插入在pP1/lacZ的SphI位點內(nèi)，得到pP1/lacZSrf。(vii)將來自p3.5MG的LAT P2/MMLV/GFP/pA盒(PstI片段)插入在pP1/lacZSrf的NsiI位點內(nèi)，其中來自p3.5MG的LAT P2區(qū)位于pP1/lacZSrf的LAT P1區(qū)之后，得到質(zhì)粒pR20.9。(viii)將pR20.9盒插入在UL43側(cè)翼區(qū)中，其通過用SrfI切割并插入在p35唯一的NsiI位點內(nèi)而完成，得到pR20.9/43。p35含有克隆在pGeml(Promega)內(nèi)的HSV1 nts 91，610-96，751(BamHI-EcoRI)。實施例5-用1764/pR14/TH接種小鼠/大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)通過爪墊接種小鼠(1×107pfu)，接著處死小鼠并解剖腰背根神經(jīng)節(jié)來檢測1764/pR14。用標(biāo)準(zhǔn)方法(Coffin等，1996)進(jìn)行固定和X-gal染色，隨后分別在2天，2周，1個月和2個月(檢測的最長時間)可觀察到腰神經(jīng)節(jié)L4和L5處為藍(lán)色，這表明了長期的啟動子活性。中樞神經(jīng)系統(tǒng)在給大鼠紋狀體(200-220g路易斯大鼠)進(jìn)行趨實體性接種(2μl5×105pfu)后，接著分別在2天，2周，1個月和2個月(檢驗的最長時間)進(jìn)行固定和X-gal染色后，1764/pR14為藍(lán)色。這再次表明長期的啟動子活性。實施例6-用17+/D27/PR19接種大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)在給大鼠紋狀體(200-220g路易斯大鼠)進(jìn)行趨實體性接種(2μl5×106pfu)后，并分別在2天，2周，1個月和2個月(檢驗的最長時間)進(jìn)行固定和X-gal染色后，17+/D27/pR19顯示了強(qiáng)的藍(lán)色。這表明CMV IE啟動子當(dāng)放置在LAT P2之后時，能象MMLV LTR一樣顯示出長期活性。實施例7-用17+/D27/pR20接種大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)在給大鼠紋狀體(200-220g路易斯大鼠)進(jìn)行趨實體性接種(2μl5×106pfu)后，并分別在2天，2周，1個月(檢驗的最長時間)進(jìn)行固定和X-gal染色后，17+/D27/pR20也顯示了強(qiáng)的藍(lán)色。重要地是，這表明當(dāng)插入在皰疹基因組中的其它位置時(即不在LAT區(qū)域內(nèi))，LAT P2能使鄰近的啟動子具有長期活性。實施例8-用1764/pR20.9接種小鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)通過爪墊接種小鼠(1×107pfu)，接著處死小鼠并解剖腰背根神經(jīng)節(jié)來檢測1764/pR20.9。固定后在熒光顯微鏡(熒光光學(xué)設(shè)備)下能觀察到在腰神經(jīng)節(jié)L4和L5處(以及較低程度在其它DRG中)有強(qiáng)的綠色熒光，X-gal染色后在2天，2周，1個月和2個月(檢測的最長時間)時在相同細(xì)胞中可觀察到藍(lán)色。這表明兩個啟動子在長時間內(nèi)均處于激活狀態(tài)，并顯示了利用本發(fā)明的盒可有效地表達(dá)成對基因。
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權(quán)利要求
1.一種包含按該順序有效連接單純皰疹病毒潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄物P2區(qū)，啟動子以及異源基因的表達(dá)盒。
2.按照權(quán)利要求1的表達(dá)盒，其中所說的啟動子是非-LAT啟動子。
3.按照權(quán)利要求1或2的表達(dá)盒，其中所說的啟動子是病毒的啟動子。
4.按照權(quán)利要求1或2的表達(dá)盒，其中所說的啟動子是使所說的異源基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的哺乳動物的啟動子。
5.按照權(quán)利要求4的表達(dá)盒，其中所說的哺乳動物啟動子是組織特異性啟動子。
6.按照權(quán)利要求4或5的表達(dá)盒，其中所說的哺乳動物細(xì)胞是哺乳動物的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。
7.按照權(quán)利要求4或5的表達(dá)盒，其中所說的哺乳動物細(xì)胞是哺乳動物的眼，心臟或骨骼肌細(xì)胞。
8.按照上述權(quán)利要求之任一的表達(dá)盒，其中所說的異源基因編碼具有治療用途的多肽。
9.按照權(quán)利要求8的表達(dá)盒，其中所說的基因編碼細(xì)胞毒性多肽。
10.按照權(quán)利要求8的表達(dá)盒，其中所說的基因編碼能把藥物前體轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性化合物的多肽。
11.按照上述權(quán)利要求之任一的表達(dá)盒，其中所說的異源基因選自編碼下列物質(zhì)的基因與細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白質(zhì)、與細(xì)胞代謝途徑有關(guān)的酶、轉(zhuǎn)錄因子和熱休克蛋白質(zhì)。
12.按照上述權(quán)利要求之任一的表達(dá)盒，其還包含第二啟動子和第二異源基因，它們與HSV LAT P2區(qū)按該順序有效連接，并以與第一啟動子和第一異源基因取向相反的方式連接，其中所說的第二個啟動子與第一啟動子相同或不同，所說的第二個異源基因與第一異源基因相同或不同。
13.按照權(quán)利要求12的表達(dá)盒，其中所說的第二異源基因和所說的第二啟動子分別是如權(quán)利要求1-7和8-11之任一所限定的。
14.按照權(quán)利要求12或13的表達(dá)盒，其中所說的第一異源基因的產(chǎn)物在合適的生理條件下調(diào)節(jié)所說的第二異源基因的表達(dá)。
15.用于將所說的異源基因或基因傳送至真核細(xì)胞中的按照上述權(quán)利要求之任一的表達(dá)盒。
16.按照權(quán)利要求15的表達(dá)盒，其中所說的真核細(xì)胞是哺乳動物的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。
17.按照權(quán)利要求15的表達(dá)盒菌株，其中所說的真核細(xì)胞是哺乳動物的眼，心臟或骨骼肌的細(xì)胞。
18.包含上述權(quán)利要求之任一所限定的表達(dá)盒的核酸載體。
19.按照權(quán)利要求18的載體，其還包含位于所說表達(dá)盒側(cè)翼的哺乳動物的基因組序列。
20.按照權(quán)利要求18或19的載體，其還包含位于所說表達(dá)盒側(cè)翼的HSV基因組序列。
21.包含上述權(quán)利要求1-17之任一所限定的表達(dá)盒的病毒毒株。
22.按照權(quán)利要求21的病毒毒株，其中所說的病毒毒株是HSV毒株。
23.按照權(quán)利要求22的病毒毒株，其中所說的LAT P2區(qū)是內(nèi)源性HSV LAT P2區(qū)。
24.用于人或動物體的治療方法中的按照權(quán)利要求1-17之任一的表達(dá)盒，按照權(quán)利要求18-20之任一的載體或者按照權(quán)利要求21-23之任一的病毒毒株。
25.用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損傷(包括帕金森氏病，脊柱損傷或中風(fēng))，或者眼疾，心臟或骨胳肌疾病，或惡性腫瘤的按照權(quán)利要求1-17之任一的表達(dá)盒，按照權(quán)利要求18-20之任一的載體或者按照權(quán)利要求21-23之任一的病毒毒株。
26.按照權(quán)利要求1-17之任一的表達(dá)盒，按照權(quán)利要求18-20之任一的載體或者按照權(quán)利要求21-23之任一的病毒毒株在治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損傷(包括帕金森氏病，脊柱損傷或中風(fēng))，或者眼疾，心臟或骨胳肌疾病，或惡性腫瘤上的用途。
27.一種藥物組合物，該組合物包含按照權(quán)利要求1-17之任一的表達(dá)盒，按照權(quán)利要求18-20之任一的載體或按照權(quán)利要求21-23之任一的病毒毒株以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
28.一種用于研究真核細(xì)胞中一個或多個異源基因的功能的方法，該方法包括(a)將按照權(quán)利要求1-17之任一的表達(dá)盒，按照權(quán)利要求18-20之任一的載體或按照權(quán)利要求21-23之任一的病毒毒株導(dǎo)入至真核細(xì)胞內(nèi)；(b)檢測所說的異源基因或基因在所說的真核細(xì)胞中的表達(dá)作用。
29.按照權(quán)利要求28的方法，其中所說的并源基因是與致病相關(guān)的野生型或突變基因。
30.按照權(quán)利要求28或29的方法，其中所說的真核細(xì)胞有機(jī)能障礙，所說的異源基因是野生型的，并且所說的異源基因的表達(dá)作用由細(xì)胞功能分析來檢測。
31.按照權(quán)利要求28或29的方法，其中所說的真核細(xì)胞具有一個或多個通過突變失活的內(nèi)源性基因。
32.一種產(chǎn)生按照權(quán)利要求22的HSV毒株的方法，該方法包括將按照權(quán)利要求1-13之任一所限定的表達(dá)盒導(dǎo)入到單純皰疹病毒的基因組內(nèi)。
33.一種產(chǎn)生按照權(quán)利要求22的HSV毒株的方法，該方法包括通過單純皰疹病毒的基因組與權(quán)利要求18定義的載體之間的同源重組將權(quán)利要求1-13之任一所限定的表達(dá)盒導(dǎo)入到所說的基因組內(nèi)。
34.一種治療人或動物體的方法，該方法包括施用有效量的按照權(quán)利要求27的藥物組合物至需要這樣的治療的人或動物體內(nèi)。
35.按照權(quán)利要求34的方法，其用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損傷(包括帕金森氏病，脊柱損傷或中風(fēng))，或者眼疾，心臟或骨胳肌疾病，或惡性腫瘤。
36.一種在人或動物體中進(jìn)行基因治療的方法，該方法包括將按照權(quán)利要求1-17之任一的表達(dá)盒，按照權(quán)利要求18-20之任一的載體或按照權(quán)利要求21-23之任一的病毒毒株，以足以使編碼治療多肽的異源基因在所說的細(xì)胞中有效地表達(dá)的量導(dǎo)入至需要這樣的治療的人或動物體內(nèi)。
37.按照權(quán)利要求1-7之任一的表達(dá)盒，其中所說的異源基因編碼含有至少一個表位的多肽。
38.按照權(quán)利要求37的表達(dá)盒，其中所說的多肽來自病原體。
39.一種包含按照權(quán)利要求37或38的表達(dá)盒的載體。
40.一種包含按照權(quán)利要求37或38的表達(dá)盒的病毒毒株。
41.用于接種哺乳動物的方法的按照權(quán)利要求37或38的表達(dá)盒，按照權(quán)利要求39的載體或按照權(quán)利要求40的病毒毒株。
42.一種疫苗，該疫苗包含按照權(quán)利要求37或38的表達(dá)盒，按照權(quán)利要求39的載體或按照權(quán)利要求40的病毒毒株以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
全文摘要
一種包含單純皰疹病毒潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄物P2區(qū),啟動予以及異源基因(按該順序有效連接)的表達(dá)盒。所說的表達(dá)盒摻入到單純皰疹病毒載體中使得可以向哺乳動物細(xì)胞傳遞異源基因,供長期表達(dá)。
文檔編號C12N7/00GK1250480SQ9880321
公開日2000年4月12日 申請日期1998年1月12日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月10日
發(fā)明者R·S·科芬, D·S·拉奇曼 申請人:紐羅維克斯有限公司