專利名稱：恩拉霉素的提取分離和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從恩拉霉素發(fā)酵液中提取、純化恩拉霉素的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
恩拉霉素是由包括13個(gè)不同種類的17個(gè)氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的有機(jī)堿。其中氨基酸分子構(gòu)成環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，脂肪酸位于多肽結(jié)構(gòu)末端。據(jù)其末端脂肪酸種類不同，分為恩拉霉素A和恩拉霉素B，恩拉霉素則是由這兩種成分組成的混合物。恩拉霉素的鹽酸鹽為白色結(jié)晶性粉末，分子量約為2500，熔點(diǎn)為238 ，易溶于二甲亞砜，可溶于甲醇、含水乙醇，難溶于丙酮，不溶于苯、氯仿。恩拉霉素的鹽酸鹽對(duì)熱、光照和潮濕有極好的穩(wěn)定性。恩拉霉素在飼料中具有很高的穩(wěn)定性，在室溫條件下長(zhǎng)期儲(chǔ)藏很少降解，在制成顆粒料過(guò)程中也非常穩(wěn)定，與飼料混合后在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)藏效價(jià)下降甚微。在腸道內(nèi)不被降解，能夠保持原有的抗菌活性。其抗菌機(jī)理主要是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。阻止粘肽的合成，使細(xì)胞壁缺損，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，細(xì)胞外液滲入菌體，使細(xì)菌變形腫大，破裂而死亡。恩拉霉素主要作用于細(xì)菌的裂殖階段，不僅殺菌，而且溶菌，最小抑菌濃度為0. 05 3. 13μ g/ml。恩拉霉素在飼料中的微量添加，就可起到良好的促進(jìn)生長(zhǎng)和顯著提高飼料報(bào)酬的效果。無(wú)論在有氧和厭氧條件，恩拉霉素都能對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌顯示良好的抗菌作用。但是，現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)的恩拉霉素產(chǎn)品純度較低、色澤深，產(chǎn)品收率較低，生產(chǎn)操作復(fù)雜，從而影響了經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何提取分離并純化得到高純度的恩拉霉素。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種從恩拉霉素發(fā)酵液中提取、分離和純恩拉霉素的方法。本發(fā)明的恩拉霉素發(fā)酵液的來(lái)源可以為采用本領(lǐng)域常用菌種進(jìn)行常規(guī)發(fā)酵后所得的發(fā)酵液，例如以鏈霉菌(Sti^ptomyces)為生產(chǎn)菌種，諸如殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)，將其孢子液在液氮環(huán)境下保存；將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)得種子液；然后將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到恩拉霉素發(fā)酵液。本發(fā)明從恩拉霉素發(fā)酵液中提取、分離和純化恩拉霉素的方法包括如下步驟將恩拉霉素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)熱處理后，過(guò)濾，離心，收集菌體；向菌體加入甲醇溶液后，超聲，過(guò)濾；所得甲醇提取液先酸化后堿化，然后脫色，脫色液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，用甲醇先沖洗后洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濃縮結(jié)晶后，冷凍干燥，得到恩拉霉素。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述熱處理為將恩拉霉素發(fā)酵液加熱至55 65°C，
3優(yōu)選60°C，然后真空濃縮至恩拉霉素含量為10 100g/L。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，熱處理后的恩拉霉素發(fā)酵液采用陶瓷膜過(guò)濾；優(yōu)選地，采用截留分子量為10萬(wàn) 50萬(wàn)D的陶瓷膜過(guò)濾；更優(yōu)選地，采用截留分子量為30萬(wàn)D的陶瓷膜過(guò)濾。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述甲醇溶液的加入量為所得菌體的2 5倍v/m ；甲醇溶液的濃度為45 55% (體積比)，優(yōu)選為50% ；甲醇超聲的時(shí)間為2 他，優(yōu)選3 4h。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)所得甲醇提取液先酸化后堿化處理，其中，酸化的目的是保持恩拉霉素的穩(wěn)定性，堿化的目的是較好地分離除去色素。優(yōu)選地，酸化后的pH值為1. 0 5. 0，堿化后的pH值為7. 5 9. 0。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述酸化為采用5% 30%鹽酸將甲醇提取液的pH調(diào)至1. 0 5. 0，于20 40°C下保溫1 4h，抽濾，得酸化濾液；所述堿化為采用1 10%氫氧化鈉將酸化濾液的PH調(diào)至7. 5 9. 0，抽濾，得堿化濾液。更優(yōu)選地，采用10% 15%鹽酸將甲醇提取液的pH調(diào)至2. 0 3. 0 ；更優(yōu)選地，采用4 8%氫氧化鈉將酸化濾液的pH調(diào)至7. 5 8. 5。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱時(shí)的流速均為2 4BV/h;所述大孔吸附樹(shù)脂優(yōu)選為HZ-816樹(shù)脂或HZ-818樹(shù)脂，其對(duì)恩拉霉素吸附量大，且對(duì)雜質(zhì)吸附量較少。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用經(jīng)預(yù)處理的活性炭柱脫色，脫色時(shí)的流速為2 4BV/h ；其中，所述預(yù)處理的方法為用3 4%鹽酸以1. 0 2. OBV/h的流速?zèng)_洗2 3BV柱體積后，浸泡l_2h，然后用水沖洗至流出液pH為4. 0 7. 0后，再用3 4%氫氧化鈉溶液以1. 0 2. OBV/h的流速?zèng)_洗2 3BV柱體積后，浸泡1_池，然后用水沖洗至流出液pH 為 7. 0 9. 0。優(yōu)選地，對(duì)活性炭柱的預(yù)處理方法為用4%鹽酸以1. 5BV/h的流速?zèng)_洗2BV柱體積后，浸泡lh，然后用水沖洗至流出液pH為5. 0后，再用4%氫氧化鈉溶液以1. 5BV/h的流速?zèng)_洗2BV柱體積后，浸泡lh，然后用水沖洗至流出液pH為8. 0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述沖洗為采用pH 7. 5 8.0的45 55%甲醇，以1 5BV/h的流速進(jìn)行反向沖洗和正向沖洗；優(yōu)選地，采用pH 8. 0的50%甲醇進(jìn)行沖洗；所述洗脫為采用PH 1. 0 4. 0的65 75%甲醇以1 4BV/h的流速進(jìn)行洗脫；優(yōu)選地，采用pH 2. 5的70%甲醇進(jìn)行洗脫。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將所述洗脫液在30 50°C、優(yōu)選45_50°C下減壓濃縮至有結(jié)晶出現(xiàn)，然后以3 5°C /h的速度降溫?cái)嚢?；降溫? 5°C、優(yōu)選5°C時(shí)，停止攪拌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將所得結(jié)晶在3000 5000rpm下離心分離，在真空冷凍條件下干燥。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)中存在的恩拉霉素產(chǎn)品純度低、色澤深，且產(chǎn)品收率低，操作復(fù)雜等不足之處，提供了一種提取、分離和純化恩拉霉素的方法，該方法采用過(guò)柱吸附，洗脫相結(jié)合的方式，能較完全的除去恩拉霉素溶液的雜質(zhì)，操作簡(jiǎn)單，發(fā)酵液處理所需時(shí)間短，符合大量生產(chǎn)要求，能低成本制得高純度的恩拉霉素。具體實(shí)施例以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1以殺真菌素鏈霉菌(Sti^ptomyces fungicidicus)為生產(chǎn)菌種，將其孢子液在液氮環(huán)境下保存；將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)得種子液；然后將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到棕黃色恩拉霉素發(fā)酵液(恩拉霉素含量5. 54g/L,總糖含量0. 98 %，還原糖含量0. 34 %，蛋白含量0. 39 %，溶磷78mg/L)。1)取IOL棕黃色恩拉霉素發(fā)酵液，加熱至60°C，真空濃縮至恩拉霉素含量為55. 4g/L，經(jīng)30萬(wàn)D陶瓷膜過(guò)濾后，用離心機(jī)以5000rpm的條件離心，得到菌絲體lOOOg，加入50%甲醇(體積比)4L，在超聲波條件下攪拌、破碎池，過(guò)濾，得到恩拉霉素甲醇提取液。2)用10%的鹽酸調(diào)節(jié)恩拉霉素甲醇提取液的pH至2. 5，于30°C下保溫池，抽濾，濾液用4% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8. 0，抽濾。3)將所得濾液以2BV/h的流速過(guò)處理好的活性炭柱進(jìn)行脫色，再以同樣的流速過(guò)HZ-818樹(shù)脂，以吸附恩拉霉素。吸附完成后，用pH8. 0的50%甲醇(體積比)，以3. OBV/h的流速進(jìn)行反向沖洗和正向沖洗。沖洗完畢后，用PH2. 5的70%甲醇(體積比)，以1.5BV/h的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液?；钚蕴恐念A(yù)處理方法為用4%鹽酸以1. 5BV/h的流速?zèng)_洗2BV柱體積后，浸泡lh，然后用水沖洗至流出液pH為5. 0后，再用4%氫氧化鈉溶液以1. 5BV/h的流速?zèng)_洗2BV柱體積后，浸泡lh，然后用水沖洗至流出液pH為8. 0。4)將洗脫液在50°C條件下，減壓濃縮至有晶體出現(xiàn)后，將濃縮液以5°C /h的速度進(jìn)行降溫?cái)嚢杞Y(jié)晶，降至5°C時(shí)，停止攪拌。將結(jié)晶晶體于5000rpm條件下進(jìn)行離心分離，晶體在真空冷凍條件下凍干10h，得白色恩拉霉素精品。所得恩拉霉素產(chǎn)品49. 8g，恩拉霉素含量為96. 8%，收率為87%。實(shí)施例2以殺真菌素鏈霉菌(Sti^ptomyces fungicidicus)為生產(chǎn)菌種，將其孢子液在液氮環(huán)境下保存；將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)得種子液；然后將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到棕黃色恩拉霉素發(fā)酵液(恩拉霉素含量5. 01g/L,總糖含量0. 89%,還原糖含量0.51%,蛋白含量0. 54%,溶磷103mg/L)。1)取10L棕黃色恩拉霉素發(fā)酵液，加熱至55°C，真空濃縮至恩拉霉素含量為50. lg/L，經(jīng)50萬(wàn)D陶瓷膜過(guò)濾后，用離心機(jī)以4500rpm的條件離心，得到菌絲體1200g，加入55%甲醇(體積比)4L，在超聲波條件下攪拌、破碎4h，過(guò)濾，得到恩拉霉素甲醇提取液。2)用15%的鹽酸調(diào)節(jié)恩拉霉素甲醇提取液的pH至2. 0，于30°C下保溫池，抽濾，濾液用5% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 0，過(guò)濾。3)將所得濾液以!3BV/h的流速過(guò)處理好的活性炭柱進(jìn)行脫色，再以同樣的流速過(guò)HZ-816樹(shù)脂，以吸附恩拉霉素。吸附完成后，用pH7. 5的55%甲醇(體積比)，以4. 0BV/h的流速進(jìn)行反向沖洗和正向沖洗。沖洗完畢后，用PH3.0的70%甲醇(體積比)，以2. OBV/h的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液?；钚蕴恐念A(yù)處理方法為用3%鹽酸以2BV/h的流速?zèng)_洗3BV柱體積后，浸泡
5lh，然后用水沖洗至流出液pH為5. 0后，再用3%氫氧化鈉溶液以2BV/h的流速?zèng)_洗3BV柱體積后，浸泡lh，然后用水沖洗至流出液pH為8.0。4)將洗脫液在40°C條件下，減壓濃縮至有晶體出現(xiàn)后，將濃縮液以4°C /h的速度進(jìn)行降溫?cái)嚢杞Y(jié)晶。降至；TC時(shí)，停止攪拌。將結(jié)晶晶體于5000rpm條件下進(jìn)行離心分離，晶體在真空冷凍條件下凍干10h，得白色恩拉霉素精品。所得恩拉霉素產(chǎn)品46. 5g，恩拉霉素含量為95. 9%，收率為89%。實(shí)施例3以殺真菌素鏈霉菌(Sti^ptomyces fungicidicus)為生產(chǎn)菌種，將其孢子液在液氮環(huán)境下保存；將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)得種子液；然后將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到棕黃色恩拉霉素發(fā)酵液(恩拉霉素含量4. 92g/L，總糖含量0.93%,還原糖含量0. 46%, 白含量0. 43%,溶磷93mg/L)。1)取IOL棕黃色恩拉霉素發(fā)酵液，加熱至65°C，真空濃縮至恩拉霉素含量為49. 2g/L，經(jīng)10萬(wàn)D陶瓷膜過(guò)濾后，用離心機(jī)以5000rpm的條件離心，得到菌絲體lOOOg，加入45%甲醇(體積比)5L，在超聲波條件下攪拌、破碎他，過(guò)濾，得到恩拉霉素甲醇提取液。2)用20%的鹽酸調(diào)節(jié)恩拉霉素甲醇提取液的pH至2. 5，于40°C下保溫lh，抽濾，濾液用8% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 0，過(guò)濾。3)將所得濾液以2. 5BV/h的流速過(guò)處理好的活性炭柱進(jìn)行脫色，再以同樣的流速過(guò)HZ-816樹(shù)脂，以吸附恩拉霉素。吸附完成后，用pH8.0的50%甲醇(體積比)，以3. OV/h的流速進(jìn)行反向沖洗和正向沖洗。沖洗完畢后，用PH2.0的70%甲醇(體積比)，以1.5BV/h的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液?；钚蕴恐念A(yù)處理方法為用4%鹽酸以1. 0BV/h的流速?zèng)_洗3BV柱體積后，浸泡1. 5h，然后用水沖洗至流出液pH為5. 0后，再用4%氫氧化鈉溶液以1. 0BV/h的流速?zèng)_洗3BV柱體積后，浸泡1. 5h，然后用水沖洗至流出液pH為8. 0。4)將洗脫液在30°C條件下，減壓濃縮至有晶體出現(xiàn)后，將濃縮液以3°C /h的速度進(jìn)行降溫?cái)嚢杞Y(jié)晶。降至2°C時(shí)，停止攪拌。將結(jié)晶晶體于5000rpm條件下進(jìn)行離心分離，晶體在真空冷凍條件下凍干10h，得白色恩拉霉素精品。所得恩拉霉素產(chǎn)品47. 2g，恩拉霉素含量為94. 8%，收率為91 %。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種從恩拉霉素發(fā)酵液中提取、分離和純化恩拉霉素的方法，包括如下步驟將恩拉霉素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)熱處理后，過(guò)濾，離心，收集菌體；向菌體加入甲醇溶液后，超聲，過(guò)濾；所得甲醇提取液先酸化后堿化，然后脫色，脫色液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，用甲醇先沖洗后洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濃縮結(jié)晶后，冷凍干燥，得到恩拉霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱處理為將恩拉霉素發(fā)酵液加熱至55 65°C，優(yōu)選60°C，然后真空濃縮至恩拉霉素含量為10 100g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，熱處理后的恩拉霉素發(fā)酵液采用陶瓷膜過(guò)濾；優(yōu)選地，采用截留分子量為10萬(wàn) 50萬(wàn)D的陶瓷膜過(guò)濾；更優(yōu)選地，采用截留分子量為30萬(wàn)D的陶瓷膜過(guò)濾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇溶液的加入量為所得菌體的2 5倍v/m ；甲醇溶液的濃度為45 55%，優(yōu)選為50% ；甲醇超聲的時(shí)間為2 他，優(yōu)選3 4h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酸化后的pH值為1.0 5. 0，堿化后的pH值為7. 5 9. 0 ；優(yōu)選地，所述酸化為采用5% 30%鹽酸將甲醇提取液的pH調(diào)至1. 0 5. 0，于20 40°C下保溫1 4h，抽濾，得酸化濾液；所述堿化為采用1 10%氫氧化鈉將酸化濾液的PH調(diào)至7. 5 9. 0，抽濾，得堿化濾液；更優(yōu)選地，采用10% 15%鹽酸將甲醇提取液的pH調(diào)至2.0 3.0 ；更優(yōu)選地，采用4 8%氫氧化鈉將酸化濾液的pH調(diào)至7. 5 8. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱時(shí)的流速為2 4BV/h ；所述大孔吸附樹(shù)脂為HZ-816樹(shù)脂或HZ-818樹(shù)脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于，采用經(jīng)預(yù)處理的活性炭柱脫色，脫色時(shí)的流速為2 4BV/h ；其中，所述預(yù)處理的方法為用3 4%鹽酸以1. 0 2. OBV/h的流速?zèng)_洗2 3BV柱體積后，浸泡l_2h，然后用水沖洗至流出液pH為4. 0 7. 0后，再用3 4%氫氧化鈉溶液以1. 0 2. OBV/h的流速?zèng)_洗2 3BV柱體積后，浸泡l_2h，然后用水沖洗至流出液PH為7.0 9.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述沖洗為采用pH7. 5 8. 0的45 55%甲醇，以1 5BV/h的流速進(jìn)行反向沖洗和正向沖洗；優(yōu)選地，采用pH 8. 0的50%甲醇進(jìn)行沖洗；所述洗脫為采用pH 1. 0 4. 0的65 75%甲醇以1 4BV/h的流速進(jìn)行洗脫；優(yōu)選地，采用PH 2. 5的70%甲醇進(jìn)行洗脫。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述洗脫液在30 50°C、優(yōu)選45-50°C下減壓濃縮至有結(jié)晶出現(xiàn)，然后以3 5°C /h的速度降溫?cái)嚢?；降溫? 5°C、優(yōu)選5°C時(shí)，停止攪拌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，將所得結(jié)晶在3000 5000rpm下離心分離，在真空冷凍條件下干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從恩拉霉素發(fā)酵液中提取、分離和純化恩拉霉素的方法，包括如下步驟將恩拉霉素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)熱處理后，過(guò)濾，離心，收集菌體；向菌體加入甲醇溶液后，超聲，過(guò)濾；濾液先酸化后堿化，然后脫色，脫色液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行吸附，用甲醇洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濃縮結(jié)晶后，冷凍干燥，得到恩拉霉素。該方法提取恩拉霉素的優(yōu)點(diǎn)在于所需時(shí)間短，產(chǎn)品純度高，工藝簡(jiǎn)單，操作費(fèi)用低。
文檔編號(hào)C07K7/64GK102382177SQ20111034487
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者張雪鋒, 李榮杰, 魏生 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司