專利名稱：缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅰ二硫鍵變構(gòu)體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組蛋白及其在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是涉及ー種缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I ニ硫鍵變構(gòu)體及其制備方法以及作為藥物在預(yù)防和治療纖維化增生性疾病和血管增生性疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明是發(fā)明名稱為“新型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子突變體”(專利號(hào)CN 03101156. X)的發(fā)明專利的延伸。
背景技術(shù)：
角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor, KGF)屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)家族,具有肝素結(jié)合特性。目前已發(fā)現(xiàn)兩種角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，即角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I (KGF- I )和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-II (KGF- II )，又分別被命名為 FGF-7 和 FGF-10 (Aarono son SA et al，Ann N Y Acad Sci，1991，638 :62-77)。人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I (hKGF- I )最初由Rubin等人(Rubin JS et al, Proc Natl Acad Sci USA，1989，86 :802-806)從人胚胎肺成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)液中分離純化，因具有促進(jìn)小鼠角質(zhì)細(xì)胞有絲分裂的作用，故被命名為角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子；hKGF- II是Emoto等人(Emoto H et al, J Biol Chem，1997，272 :23191-23194)從肺中分離出編碼 KGF- II 的cDNA。hKGF- I基因位于15號(hào)染色體，編碼含194個(gè)氨基酸殘基的蛋白前體，包含一段31個(gè)氨基酸殘基的分泌信號(hào)肽，成熟的hKGF- I是ー個(gè)含163個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽。大量研究結(jié)果顯示，hKGF- I由間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，通過(guò)旁分泌的方式作用于上皮細(xì)胞，是一種多功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有廣泛的生物學(xué)作用。hKGF- I能夠促進(jìn)包括肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胃腸上皮細(xì)胞、II型肺泡上皮細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞和各種鱗狀上皮的角化細(xì)胞等多種上皮細(xì)胞(Finch Pff et al, Science, 1989,245 :752-755 ；Farrell CL et al,Int J Radiat Biol, 1999, 75 :609-20 ；Farrell CL et al,Cancer Res,1998, 58 :933-939 ;Ellison CA et al, J Clin Immunol, 2008,28 :600-615 ；Terry NH et al, Int J RadiatOncol Biol Phys, 2004, 58 :435-444 ;Imayasu M et al, Curr Eye Res2003, 27 133-141)的増殖、遷移、分化、存活，維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定，拮抗輻射損傷、促進(jìn)DNA修復(fù)以及誘導(dǎo)解毒酶的表達(dá)來(lái)加強(qiáng)上皮功能，有效保護(hù)上皮細(xì)胞免于毒性物質(zhì)和射線的損傷。損傷修復(fù)過(guò)程中hKGF- I可被大量誘生表達(dá)，促進(jìn)傷ロ愈合，加快角膜上皮細(xì)胞損傷恢復(fù)的速度，縮短角膜上皮細(xì)胞愈合時(shí)間。天然野生型hKGF- I由163個(gè)氨基酸組成，分子量為21KD，含5個(gè)Cys，分別位于第I位、第15位、第40位、第102位和第106位，其中形成Cysl_Cysl5、Cysl02_Cysl06兩對(duì)ニ硫鍵，Cys40以游離巰基形式存在于分子內(nèi)部(Osslund TD et al,Protein Sci, 1998,7 :1681-1690)。全長(zhǎng)hKGF- I蛋白質(zhì)具有不穩(wěn)定性，容易發(fā)生斷裂和聚集，利用基因工程技術(shù)，通過(guò)突變或缺失某些氨基酸可以改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。文獻(xiàn)報(bào)道(Osslund TD et al,Protein Sci,1998,7 1681-1690 ；Hsu E et al, Protein Eng Des Sel,2006,19 :147-153和美國(guó)專利US 5677278)缺失N端23個(gè)氨基酸，且形成Cysl02_Cysl06 ニ硫鍵(記為Λ 23hKGF- I )吋，不影響其生物活性，且會(huì)提高穩(wěn)定性。該事實(shí)說(shuō)明，N端第1-23位氨基酸及Cysl-Cysl5 ニ硫鍵與KGF- I的生物學(xué)活性無(wú)關(guān)。本發(fā)明人曾將hKGF- I天然序列第102位的Cys突變?yōu)镾er,使之無(wú)法形成Cysl02_Cysl06 ニ硫鍵,并缺失N端24個(gè)氨基酸,形成新型的hKGF- I突變體(記為102S Λ 24 hKGF- I )。該新型hKGF- I突變體能促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞増殖和抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，具有抗疤痕、抗纖維化和促進(jìn)表皮愈合的功能，該發(fā)明已獲得中國(guó)專利(CN 03101156. X)授權(quán)。在上述專利的基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過(guò)ニ硫鍵配對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)的缺失型hKGF- I (Δ23 hKGF- I )及上述的102S Λ 24 hKGF- I突變體均未形成對(duì)應(yīng)于天然 hKGF- I第40位和第106位Cys間的ニ硫鍵，其中Λ 23 hKGF- I僅有Cysl02和Cysl06間的ニ硫鍵形成，102S Λ 24 hKGF- I中無(wú)ニ硫鍵形成。本發(fā)明對(duì)ニ種序列中對(duì)應(yīng)于天然hKGF- I的Cys40和Cysl06人為形成分子內(nèi)ニ硫鍵的方法進(jìn)行了詳細(xì)的研究摸索，并對(duì)該ニ硫鍵形成后分子構(gòu)象進(jìn)行了確證。與Cys40和CyslOe間未形成ニ硫鍵的結(jié)構(gòu)相比，形成非天然CyS40-CyS106 ニ硫鍵后的hKGF- I缺失型突變體在空間構(gòu)象上有顯著變化，并經(jīng)系列研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了新的生物學(xué)功能，既能促進(jìn)上皮細(xì)胞増殖，又可逆轉(zhuǎn)組織纖維化，并有效抑制新生血管生長(zhǎng)。同時(shí)，本發(fā)明人構(gòu)建和制備了將第106位Cys突變成Ser的106SΔ23 hKGF- I缺失型突變體重組蛋白，采用本專利實(shí)施例的方法，結(jié)果未能實(shí)現(xiàn)非天然ニ硫鍵CyS40-CyS102的有效形成。組織纖維化是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，是許多疾病致殘、致死的主要原因。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)表明，全球因各種疾病致死的病人中，約40%可以歸因于組織纖維化疾病，如矽肺、肺囊蟲感染、病毒性肝硬化、酒精性肝硬化、腎小球腎炎、腎盂腎炎等。組織纖維化可導(dǎo)致器官組織內(nèi)結(jié)締組織增多，實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，持續(xù)發(fā)展可致組織硬化，使器官功能減退乃至衰竭，嚴(yán)重威脅人類健康和生命。到目前為止，尚無(wú)治療組織纖維化的有效藥物。而本發(fā)明提供的缺失型hKGF- Iニ硫鍵變構(gòu)體具有新的抑制纖維增生的生物學(xué)作用，能逆轉(zhuǎn)組織纖維化，有望開發(fā)成液體水針、凍干粉針、緩控釋劑和滴眼藥劑等形式的制劑，臨床上用于治療慢性肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、角膜纖維化和皮膚纖維化等組織纖維化疾病。還可開發(fā)成外用藥劑用于防治因皮膚纖維化導(dǎo)致的疤痕形成。本發(fā)明提供的缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體還具有新的抑制新生血管生長(zhǎng)的生物學(xué)作用，可用于抑制新生血管瘤的生長(zhǎng)以及腫瘤的血管增生，有望開發(fā)成抗癌藥物。檢索國(guó)內(nèi)外專利和文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，尚無(wú)關(guān)于hKGF- I的非天然ニ硫鍵形成、構(gòu)象變化及其生物學(xué)作用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種具有新的生物學(xué)作用的缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I (hKGF- I ) ニ硫鍵變構(gòu)體，其核心特征在于含有對(duì)應(yīng)于天然hKGF- I第40位和第106位半胱氨酸(Cys)間的非天然ニ硫鍵結(jié)構(gòu)，其新的生物學(xué)作用包括抑制纖維增生和抑制新生血管生長(zhǎng)。在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了ー種具有新的生物學(xué)作用的缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體的氨基酸序列或組成。
本發(fā)明所述的ニ硫鍵變構(gòu)體是指含有對(duì)應(yīng)于天然hKGF- I第40位和第106位半胱氨酸(Cys)間的非天然ニ硫鍵結(jié)構(gòu)，其分子構(gòu)象已發(fā)生顯著改變的hKGF- I缺失型突變體。該突變體在非天然ニ硫鍵形成以前既可特指本發(fā)明的ニ硫鍵變構(gòu)體，也可更廣義地被稱為突變體；在非天然ニ硫鍵形成后，因分子構(gòu)象已發(fā)生顯著變化，更狹義地被稱為ニ硫鍵變構(gòu)體。本發(fā)明所述的ニ硫鍵變構(gòu)體的氨基酸序列是指在天然野生型hKGF- I的氨基末端缺失23個(gè)氨基酸的缺失突變體(即Λ 23 hKGF- I )，具有Seq ID No : I的氨基酸序列特征。序列中第17位、第79位和第83位的半胱氨酸(Cys)分別對(duì)應(yīng)于天然hKGF- I的第40位、第102位和第106位。本發(fā)明同時(shí)包含在Seq ID No 1序列的基礎(chǔ)上，氨基末端增加或減少1_5個(gè)氨基酸的突變體。如在Seq ID No : I序列的氨基末端增加ー個(gè)甲硫氨酸(Met)，或增加序列為 Pro-Glu-His-Thr-Arg 或 Met-Glu-His-Thr-Arg 的 5 個(gè)氨基酸；或從 Seq ID No 1 序列的氨基末端減少ー個(gè)絲氨酸(Ser)，或減少序列為Ser-Tyr-Asp-Tyr的4個(gè)氨基酸，或減少序列為Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met的5個(gè)氛基酸。本發(fā)明同時(shí)也包含在Seq ID No : I序列的基礎(chǔ)上，將第79位的Cys (對(duì)應(yīng)于天然hKGF- I的第102位)突變?yōu)榉菢O性氨基酸。所述非極性氨基酸主要指Ser、Ala、Gly、Thr、Leu或He，本發(fā)明優(yōu)選的非極性氨基酸是Ser，記為Λ 23 S79 hKGF- I，具有Seq ID No:2的氨基酸序列特征。本發(fā)明上述的任何一種缺失型hKGF- I的ニ硫鍵變構(gòu)體或突變體，通過(guò)重組DNA技術(shù)制備而成。所述的重組DNA技術(shù)是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，合成或提取外源目的基因，對(duì)外源基因進(jìn)行缺失或點(diǎn)突變，然后將外源基因轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主，利用表達(dá)宿主表達(dá)外源目的蛋白。表達(dá)宿主可以是原核系統(tǒng)，也可以是真核系統(tǒng)，其中的原核表達(dá)系統(tǒng)可以是大腸桿菌，真核表達(dá)系統(tǒng)可以是酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)。在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種能夠促使上述任何一種缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體形成非天然ニ硫鍵(即Cysl7_Cys83 ニ硫鍵)的制備方法。本發(fā)明的核心特征在于，上述的任何一種缺失型hKGF- I的ニ硫鍵變構(gòu)體含有第17位和第83位(對(duì)應(yīng)于天然hKGF- I第40位和第106位)半胱氨酸間的非天然ニ硫鍵結(jié)構(gòu)。本發(fā)明上述的任何ー種hKGF- I的ニ硫鍵變構(gòu)體或突變體的獲得是通過(guò)重組DNA技術(shù)、微生物大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)和生物工程下游純化技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)變構(gòu)體的氨基酸序列，結(jié)合宿主菌的遺傳密碼子偏好型，化學(xué)合成對(duì)應(yīng)的缺失型hKGF- I突變體cDNA，連接到重組質(zhì)粒載體中，并成功構(gòu)建高效表達(dá)工程菌株；接種到培養(yǎng)基，采用微生物大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，高密度表達(dá)缺失型hKGF- I突變體蛋白；離心收集菌體并破菌后，采用生物工程下游純化技術(shù)，通過(guò)色譜層析手段，得到純度95%以上的缺失型hKGF- I的突變體重組蛋白。本發(fā)明所述的色譜層析手段，主要指離子交換層析、肝素親和層析、反相層析和凝膠過(guò)濾層析，更優(yōu)選地，為離子交換層析和肝素親和層祈。本發(fā)明通過(guò)特有的ニ硫鍵配對(duì)復(fù)性方法，促使第17位與第83位的Cys之間形成非天然ニ硫鍵，即Cysl7-Cys83 ニ硫鍵(對(duì)應(yīng)于天然hKGF- I的Cys40_Cysl06 ニ硫鍵)。其主要步驟為
①將得到的純度95%以上的缺失型hKGF- I突變體重組蛋白，在堿性條件下用還原劑處理，使其第17位和第83位的Cys的巰基(-SH)均處于游離狀態(tài)；②在堿性條件下經(jīng)菲洛林和銅離子配對(duì)復(fù)性，促進(jìn)形成Cysl7-Cys83 ニ硫鍵，獲得具有第17位和第83位Cys間非天然ニ硫鍵的變構(gòu)體。③采用色譜層析手段，從復(fù)性樣品中分離并得到純度95%以上的缺失型hKGF- Iニ硫鍵變構(gòu)體。本發(fā)明上述的制備方法中，所述的還原劑主要指ニ硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)、β_ 巰基こ醇、三[2-羧こ基]膦(Tris [2-carboxyethyl]phosphine, TCEP)以及半胱氨酸等試劑，更優(yōu)選地，為DTT。本發(fā)明所述的菲洛林是指1,10-菲洛林(I, ΙΟ-Phenanthroline),銅離子主要是指硫酸銅，但不限于硫酸銅，還可以是其它形式的銅離子。菲洛林和銅離子的摩爾比例范圍
I: 10 100 : I均可，更優(yōu)選地，為I : I 5 : I。本發(fā)明所述的堿性條件是指7. O 12. O的pH值范圍，更優(yōu)選地，為9. O 11. O。本發(fā)明所述的色譜層析手段，主要指離子交換層析、肝素親和層析、反相層析和凝膠過(guò)濾層析，更優(yōu)選地，為反相層析。本發(fā)明上述的任何一種缺失型hKGF- I的ニ硫鍵變構(gòu)體或突變體在非天然ニ硫鍵形成后，因分子構(gòu)象已發(fā)生顯著變化，更狹義地被稱為ニ硫鍵變構(gòu)體，并在其代號(hào)后追加“-M”以示區(qū)別。具有Seq ID No 1的氨基酸序列特征的缺失突變體(Λ 23 hKGF- I )，形成非天然ニ硫鍵后被記為Λ 23 hKGF-M，具有Seq ID No :2的氨基酸序列特征的突變體(Λ 23S79 hKGF- I )，形成非天然ニ硫鍵后被記為Λ 23 S79 hKGF-M。在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了上述任何一種缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體在預(yù)防和治療纖維化增生性疾病和血管增生性疾病上的應(yīng)用。本發(fā)明所述的缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體，與天然hKGF- I相比，構(gòu)象上發(fā)生了顯著變化。首先經(jīng)質(zhì)量肽圖結(jié)果證實(shí)了其中的Cysl7-Cys83 ニ硫鍵(對(duì)應(yīng)于天然hKGF- I的CyS40-CyS106 ニ硫鍵)的形成。計(jì)算機(jī)模建數(shù)據(jù)表明，與未形成前相比和與形成Cys79_Cys83 ニ硫鍵結(jié)構(gòu)相比(Λ 23 hKGF- I )，形成Cysl7_Cys83 ニ硫鍵后的分子構(gòu)象發(fā)生了極顯著變化(附圖I)。利用本發(fā)明提供的方法，制備獲得的ニ硫鍵變構(gòu)體重組蛋白進(jìn)行的圓二色譜(⑶)分析結(jié)果同樣表明，形成非天然Cysl7-Cys83 ニ硫鍵后⑶圖譜出現(xiàn)明顯差異(附圖2)。本發(fā)明所述的缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)具有抑制纖維增生和抑制新生血管生長(zhǎng)的生物學(xué)作用。本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞體外活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)證明，形成Cysl7-Cys83 ニ硫鍵后的缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體重組蛋白除保留原有促上皮細(xì)胞増殖(附圖3)的生物學(xué)活性外，還出現(xiàn)了新的生物學(xué)作用，能夠較明顯地抑制人組織纖維細(xì)胞(附圖4)和人血管內(nèi)皮細(xì)胞(附圖5)的生長(zhǎng)和増殖。此外，本發(fā)明通過(guò)SD大鼠肝纖維化模型、SD大鼠肺纖維化模型和雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)證明，形成Cysl7-Cys83 ニ硫鍵后的缺失型hKGF- I變構(gòu)體重組蛋白能夠有效地逆轉(zhuǎn)慢性肝損傷造成的肝纖維化(附圖6和附圖7)和急性肺損傷造成的肺纖維化(附圖8)，井能夠有效地抑制雞胚絨毛尿囊膜新生血管生長(zhǎng)(附圖9)。本發(fā)明所述的抑制纖維增生的生物學(xué)作用適用于預(yù)防和治療纖維化增生性疾病，包含但不限于慢性肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、角膜纖維化和皮膚纖維化，還包含其它組織器官的纖維化。本發(fā)明所述的抑制新生血管生長(zhǎng)的生物學(xué)作用適用于預(yù)防和治療血管增生性疾病，包含但不限于視網(wǎng)膜黃斑、新生血管瘤以及腫瘤的血管增生。本發(fā)明所述的預(yù)防和治療纖維化增生性疾病和血管增生性疾病的應(yīng)用，是通過(guò)含缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體重組蛋白的藥物組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所述的藥物組合物適用于各種給藥方式，例如ロ服給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、局部給藥、經(jīng)皮給藥、經(jīng)鼻給藥等。根據(jù)所采用的給藥方式，可將含有本發(fā)明缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體重組蛋白的藥物組合物制成合適的劑型，其中包含在有效劑量范圍的缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體重組蛋白和至少ー種藥學(xué)上可接受的藥用載體。

本發(fā)明所述的適當(dāng)劑型的實(shí)例包含但不限于片劑、膠囊、粒劑、糖漿、ロ服溶液、氣霧膠、鼻噴劑、滴眼劑、緩控釋劑、透皮制劑、用于皮膚表面的油膏和藥貼、以及可用于注射的無(wú)菌溶液等。含有本發(fā)明缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體重組蛋白的藥物組合物可以制成無(wú)菌液體或者凍干粉末，優(yōu)選地，用于胃腸外給藥。本發(fā)明所述的適當(dāng)劑型中還可含有其它常規(guī)組分，如防腐剤、穩(wěn)定劑、表面活性齊U、緩沖劑、乳化剤、增甜劑、著色劑、調(diào)味劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽等等。本發(fā)明藥物組合物中使用的穩(wěn)定劑優(yōu)選檸檬酸鈉、甘氨酸、甘露醇等。含有本發(fā)明藥物組合物的無(wú)菌液體或者 凍干粉末更優(yōu)選的配方包括缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體重組蛋白O. 1-5. Omg,甘露醇15-60mg，甘氨酸O. 1-8. Omg, pH 3. 0-6. 0，液體配方還含有注射用水O. 5-2. Oml0若有特殊治療要求，本發(fā)明所述的藥物組合物還可包含其他活性藥理成分，這種相伴使用有利于疾病的預(yù)防和治療。本發(fā)明所述的藥物組合物中，缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體重組蛋白的用量可以在ー個(gè)較大范圍內(nèi)變動(dòng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)ー些已知的因素，諸如疾病的種類、病情嚴(yán)重程度、病人體重、劑型、所選給藥途徑等很容易的加以確定。毎日用量根據(jù)制劑和治療目的的不同而有較大差異，通常的人體用量范圍為I. 0-100 μ g/kg，但不限于此范圍。至此已對(duì)本專利進(jìn)行了詳細(xì)的描述，通過(guò)參考下面的實(shí)施例能夠更清楚地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例僅為說(shuō)明目的而并不g在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。


附圖I :缺失型hKGF- I ニ硫鍵異構(gòu)體中不同ニ硫鍵配對(duì)的計(jì)算機(jī)模擬分子構(gòu)象比較圖。其中，圖A為不含ニ硫鍵的Λ23 hKGF- I的構(gòu)象圖，圖B為含Cys79-Cys83 ニ硫鍵的Λ 23 hKGF- I的構(gòu)象圖，圖C為含Cysl7-Cys83 ニ硫鍵的Λ 23 hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體的構(gòu)象圖，圖D為不含ニ硫鍵的Λ 23 S79 hKGF- I的構(gòu)象圖，圖E為含Cysl7_Cys83 ニ硫鍵的Λ 23 S79 hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體的構(gòu)象圖。附圖2 :缺失型hKGF- I ニ硫鍵異構(gòu)體中不同ニ硫鍵配對(duì)的圓二色譜(⑶)比較圖。其中，圖A為不含ニ硫鍵的Λ 23 hKGF- I的⑶圖，圖B為含Cys79_Cys83 ニ硫鍵的Δ 23 hKGF- I的CD圖，圖C為含Cysl7_Cys83 ニ硫鍵的Λ 23 hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體的CD圖，圖D為不含ニ硫鍵的Λ 23 S79 hKGF- I的⑶圖，圖E為含Cysl7_Cys83 ニ硫鍵的Λ 23S79 hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體的CD圖。
附圖3 NBL-7細(xì)胞株體外生物學(xué)活性測(cè)定刺激細(xì)胞生長(zhǎng)最大百分率示意圖。其中，A為對(duì)照品hKGF- I，B為Λ 23突變體，C為Λ 23-Μ變構(gòu)體，D為Λ 23 S79-M變構(gòu)體。附圖4 :HSC細(xì)胞體外生物學(xué)活性測(cè)定刺激或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)最大百分率示意圖。其中，A為對(duì)照品hbFGF，B為Λ 23突變體，C為Λ 23-Μ變構(gòu)體，D為Λ 23 S79-M變構(gòu)體。附圖5 =HUVEC細(xì)胞體外生物學(xué)活性測(cè)定刺激或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)最大百分率示意圖。其中，A為對(duì)照品hVEGF，B為Λ 23突變體，C為Λ 23-Μ變構(gòu)體，D為Λ 23 S79-M變構(gòu)體。附圖6 =CCl4肝損傷SD大鼠慢性肝纖維化模型中預(yù)防給藥各實(shí)驗(yàn)組的病理照片(VG染色)。其中，圖A為模型對(duì)照組，圖B為Λ 23突變體組，圖C為Λ 23-Μ變構(gòu)體組，圖D為Λ23 S79-M變構(gòu)體組。

附圖7 =CCl4肝損傷SD大鼠慢性肝纖維化模型中治療給藥各實(shí)驗(yàn)組的病理照片(Masson染色)。其中，圖A為正常對(duì)照組，圖B為模型對(duì)照組，圖C為Λ 23突變體組，圖D為Λ 23-Μ變構(gòu)體組，圖E為Λ 23 S79-M變構(gòu)體組。附圖8 :博萊霉素肺損傷SD大鼠急性肺纖維化模型中各實(shí)驗(yàn)組的病理照片(HE染色)。其中，圖A為正常對(duì)照組，圖B為模型對(duì)照組，圖C為Λ 23突變體組，圖D為Λ 23-Μ變構(gòu)體組，圖E為Λ 23 S79-M變構(gòu)體組。附圖9 :雞胚絨毛尿囊膜新生血管生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)照片示意圖。其中，圖A為生理鹽水組，圖B為bFGF組，圖C為Λ 23 S79-M變構(gòu)體組。附圖10 :cDNA測(cè)序圖譜結(jié)果。其中，圖A為pET_3C_Λ 23的測(cè)序報(bào)告，其中的第35位至第454位為Λ 23 hKGF- I的cDNA序列；圖B為pET_3C_Δ 23 S79測(cè)序報(bào)告，其中的第46位至第465位為Λ 23 S79 hKGF- I的cDNA序列。附圖11 : Λ 23 S79 hKGF_Mニ硫鍵變構(gòu)體的胰蛋白酶酶切質(zhì)量肽圖色譜圖。其中，圖A為非還原肽圖，圖B為還原肽圖。附圖12 :家兔角膜損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)中各組的角膜病理顯微照片圖(HE染色)。其中，圖A為模型對(duì)照組，圖B為bFGF對(duì)照組，圖C為Λ 23 S79-M變構(gòu)體組。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一編碼人野生型KGF- I的cDNA序列的獲得根據(jù)天然野生型hKGF- I的氨基酸和cDNA序列(GI 186738)，并按照大腸桿菌偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)以下Seq ID No 3的堿基序列(共489bp)，委托寶生物(大連)有限公司(TAKARA，大連)進(jìn)行全基因合成，嵌入pUC18載體且命名為pUC18_KGF。TGCAATGACATGACTCCTGAACAAATGGCTACCAATGTCAACTGTTCCTCTCCGGAGCGCCACACCCGGAGTTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACCGTTGCTGTTGGTATCGTTGCTATCAAAGGTGTTGAATCTGAGTTCTACCTGGCTATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCTAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCTTCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCTATCACC。實(shí)施例ニ 缺失型Λ 23 hKGF- I重組質(zhì)粒和工程菌株的構(gòu)建根據(jù)Λ 23 hKGF- I的氨基酸序列(Seq ID No 1)設(shè)計(jì)并合成引物Pl和P2
Pl 5/ -gCA TAT gTA CgA CTA CAT ggA Agg Tgg TgA C-3/ (Seq ID No :4)P2 5/ -ggg ATC CTC Agg TgA Tag CCA TCg g_3' (Seq ID No :5)Pl為Λ 23正向引物，其中g(shù)為保護(hù)堿基，CATATg為Nde I酶切位點(diǎn)；P2為Λ 23反向引物，其中g(shù)為保護(hù)堿基，ggATCC為BamH I酶切位點(diǎn)。以pUC18-KGF質(zhì)粒為模板，用引物Pl和P2擴(kuò)增Λ 23 hKGF- I基因片段。PCR反 應(yīng)條件為94°C lmin,56°C lmin,72°C lmin，共30個(gè)循環(huán),第一個(gè)循環(huán)94°C變性lOmin，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin，結(jié)果顯示獲得了 420bp的擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖回收后，用Nde I和BamH I雙酶切，回收目的片段，再用T4 DNA連接酶與質(zhì)粒pET_3C (購(gòu)于Invitrogen)同樣經(jīng)Nde I和BamH I酶切回收的片段連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆宿主菌ToplO，用酶切和PCR驗(yàn)證的方法篩選重組質(zhì)粒pET-3C- Λ 23。經(jīng)DNA測(cè)序(TAKARA，大連)證明重組質(zhì)粒中Λ 23 hKGF- I的cDNA序列正確后(附圖IOA圖)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌 BL21 Star (DE3) plysS (Novagen)，成功構(gòu)建 pET_3C_ Δ 23/BL21 Star (DE3) plysS 重組表達(dá)工程菌。實(shí)施例三突變型Λ 23 S79 hKGF- I重組質(zhì)粒和工程菌株的構(gòu)建根據(jù)Λ 23 S79 hKGF- I的氨基酸序列(Seq ID No 2)設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)引物P3 5/ -gCA TAT gTA CgA CTA CAT ggA Agg Tgg TgA C_3' (Seq ID No 4)P4 5/ -ggg ATC CTC Agg TgA Tag CCA TCg g_3' (Seq ID No :5)P5 5/ -gCT AAA AAA gAA TCC AAC gAA gAC C-3/ (Seq ID No :6)P6 5/ -TTC gTT ggA TTC TTT TTT AgC gTA_3' (Seq ID No :7)P3為正向引物，與Pl相同；P4為反向引物，與P2相同；P5為正向引物，用于對(duì)應(yīng)于天然序列第102位Ser點(diǎn)突變的擴(kuò)增；P6為反向引物，用于對(duì)應(yīng)于天然序列第102位Ser點(diǎn)突變的擴(kuò)増。以pET-3C- Δ 23質(zhì)粒為模板，用引物P3和P6擴(kuò)增含突變點(diǎn)的5'端的cDNA片段，用引物P4和P5擴(kuò)增含突變點(diǎn)的3'端的cDNA片段。再將擴(kuò)增后得到的兩個(gè)片段混合后作為模板，用引物P3和P6擴(kuò)增含Ser突變位點(diǎn)的Λ 23 S79 hKGF- I基因片段(420bp)。PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖回收后，用Nde I和BamH I雙酶切，回收目的片段，再用T4 DNA連接酶與質(zhì)粒PET-3C (購(gòu)于Invitrogen)同樣經(jīng)Nde I和BamH I酶切回收的片段連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆宿主菌ToplO，用酶切和PCR驗(yàn)證的方法篩選重組質(zhì)粒pET-3C- Δ 23 S79。經(jīng)DNA測(cè)序(TAKARA，大連)證明重組質(zhì)粒中Λ 23 S79 hKGF- I的cDNA序列正確后(附圖10B圖)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 Star (DE3) plysS (Novagen),成功構(gòu)建pET_3C_A 23S79/BL21 Star (DE3)plysS 重組表達(dá)工程菌。實(shí)施例四缺失型突變體Λ 23和Λ 23 S79 hKGF- I的微生物大規(guī)模培養(yǎng)將表達(dá)最佳的pET-3C- Δ 23/BL21 Star (DE3) plysS 和 pET_3C_ Δ 23 S79/BL21Star (DE3) plysS重組工程菌劃線接種于LA瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。從過(guò)夜培養(yǎng)的LA平板上挑取菌苔接種于含LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容至1000ml，121 °C，高壓滅菌30min)試管中，37°C培養(yǎng)12小吋，然后按1%的比例轉(zhuǎn)接到含200ml LB培養(yǎng)液的1000ml三角瓶中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜即成為上罐種子液。將上罐種子液按5%的比例接種于含YT培養(yǎng)液(胰蛋白胨4g/L，酵母提取物3g/L，Na2HPO4 · 12H20 30g/L,KH2P043g/L，NaCl lg/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，葡萄糖 8g/L，121°C，高壓滅菌 30min)的 30L 發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通空氣量、通純氧量來(lái)保持溶氧在30%以上，用28%的氨水調(diào)節(jié)pH并保持在7. O。至菌液0D_達(dá)到10 14時(shí)，加入終濃度為O. 2mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后停止發(fā)酵，收集菌液，8000rpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體放入_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?shí)施例五缺失型突變體Λ 23和Λ 23 S79 hKGF- I重組蛋白的分離純化(I)破菌從_20°C冰箱中取出菌體，放入細(xì)菌裂解液(50mM PB, pH 7. O, IOmM EDTA,0. 2g/L溶菌酶)，37°C低速攪拌I小時(shí)，冷卻后超聲(400W，工作時(shí)間5s，間歇5s，超聲40個(gè)循環(huán))，12000rpm離心10分鐘,棄沉淀,取上清。

(2)粗純化將破菌上清用CM-S印harose FF柱層析進(jìn)行粗純化。用平衡液(50mM PB,pH 7. O)平衡后，破菌上清上樣，復(fù)平衡。用含50mM PB的O 500mM的NaCl線性梯度洗脫，收集含目的蛋白的洗脫峰。(3)精純化將粗純化收集的目的蛋白洗脫峰，用！feparin CL-6B親和柱層析進(jìn)行精純化。用平衡液(50mM PB, pH 7.0)平衡后，上CM-S印harose FF分離純化的目的蛋白，用含50mM PB的O IOOOmM的NaCl線性梯度洗脫，收集含目的蛋白的洗脫峰。將純化后的ニ種重組蛋白經(jīng)12%的聚丙酰胺凝膠電泳后，考馬斯亮藍(lán)顯示分子量約為16KD的單一條帶，純度均大于95%，C18柱RP-HPLC檢測(cè)均為單一色譜峰。純化制備的Λ 23和Λ 23 S79 hKGF- I重組蛋白經(jīng)過(guò)N端序列分析，其N端15個(gè)氨基酸序列均為 Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met-Glu-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg-Val-Arg-Arg-Leu,與理論序列一致；MALDI-T0F質(zhì)譜測(cè)定的分子量分別為16279. 8和16263. 7，與理論分子量一致。實(shí)施例六含Cysl7-Cys83非天然ニ硫鍵的Λ 23-Μ和Λ 23 S79-M變構(gòu)體的制備將純度達(dá)95%以上的Λ 23和Λ 23 S79 hKGF- I重組蛋白溶液Ofeparin親和層析后)，調(diào)節(jié)PH至10. 5，加入終濃度5mM的DTT，4°C反應(yīng)2h。再透析過(guò)夜(透析液為20mMこ醇胺，ρΗΙΟ. 5)后，補(bǔ)入終濃度O. 2mM的菲洛林銅離子復(fù)性液，25°C攪拌反應(yīng)2h，補(bǔ)入IOmM的EDTA，25°C攪拌反應(yīng)Ih。復(fù)性液經(jīng)過(guò)C18制備型RP-HPLC(流動(dòng)相A液為5%こ臆、O. 1%三氟こ酸；流動(dòng)相B液為95%こ腈、O. I %三氟こ酸；洗脫條件為A液從100%至0%，B液從O至100% )，分離除去未形成Cysl7-Cys83 ニ硫鍵的其它蛋白，得到純度95%以上的ニ硫鍵變構(gòu)體Λ 23-M和Λ 23 S79-M重組蛋白。

實(shí)施例七ニ硫鍵變構(gòu)體Λ 23 S79-M和Λ 23-Μ的ニ硫鍵配對(duì)分析原理缺失型hKGF- I ニ硫鍵變構(gòu)體Λ 23 S79-M蛋白的氨基酸序列中僅含有兩個(gè)Cys殘基(第17位和第83位)，本發(fā)明通過(guò)特有的ニ硫鍵配對(duì)復(fù)性方法，促使第17位與第83位的Cys之間形成ー對(duì)非天然ニ硫鍵，即Cysl7_Cys83 ニ硫鍵(對(duì)應(yīng)于天然野生型hKGF- I的Cys40_Cysl06 ニ硫鍵)。為了證明Cysl7_Cys83非天然ニ硫鍵已正確形成,通過(guò)選用專ー性強(qiáng)的胰蛋白酶進(jìn)行酶切后，再用還原劑(TCEP)進(jìn)行酶切后肽段的還原處理。采用液質(zhì)聯(lián)用的質(zhì)譜分析還原處理前后的各個(gè)肽段的差異，從而確定其中參與ニ硫鍵形成的肽段以及Cys的配對(duì)形式。Λ 23 S79 hKGF_M經(jīng)胰蛋白酶酶切的理論肽段序列表
權(quán)利要求
1.ー種具有新的生物學(xué)作用的缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I ニ硫鍵變構(gòu)體，其特征在于含有對(duì)應(yīng)于天然人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I第40位和第106位半胱氨酸間的非天然ニ硫鍵結(jié)構(gòu)。
2.權(quán)利要求I中所述缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I是指在天然野生型的氨基末端缺失23個(gè)氨基酸的缺失突變體，具有Seq ID No 1的氨基酸序列特征。
3.權(quán)利要求2中所述缺失突變體，同時(shí)包含在SeqID No :I序列的基礎(chǔ)上氨基末端增加或減少1-5個(gè)氨基酸的類似突變體。
4.權(quán)利要求2-3中所述缺失突變體，優(yōu)選同時(shí)包含在SeqID No :1序列的基礎(chǔ)上氨基末端增加I個(gè)甲硫氨酸(Met)。
5.權(quán)利要求2-4中所述缺失突變體，優(yōu)選SeqID No : I序列中第79位(對(duì)應(yīng)于天然人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I的第102位)的半胱氨酸(Cys)突變?yōu)榉菢O性氨基酸的突變體。
6.權(quán)利要求5中所述非極性氨基酸,主要指Ser、Ala、Gly、Thr>Leu或He。
7.權(quán)利要求5-6中所述非極性氨基酸，優(yōu)選Ser，具有SeqID No 2的氨基酸序列特征。
8.權(quán)利要求1-7中所述新型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I缺失型突變體適用重組DNA技術(shù)制備而成。
9.權(quán)利要求8中所述重組DNA技術(shù)適用原核和真核表達(dá)系統(tǒng)，其中的原核表達(dá)系統(tǒng)可以是大腸桿菌，真核表達(dá)系統(tǒng)可以是酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
10.權(quán)利要求I中所述缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I的ニ硫鍵變構(gòu)體是含一對(duì)非天然ニ硫鍵的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I變構(gòu)體。
11.權(quán)利要求10中所述ニ硫鍵變構(gòu)體，通過(guò)特有的ニ硫鍵配對(duì)復(fù)性方法而實(shí)現(xiàn)，其主要步驟為 ①在堿性條件下用還原劑處理，使缺失型突變體第17位和第83位的Cys的巰基(-SH)均處于游離狀態(tài)； ②在堿性條件下經(jīng)菲洛林和銅離子配對(duì)復(fù)性，促進(jìn)形成第17位和第83位Cys間非天然_■硫鍵； ③采用色譜層析手段，從復(fù)性樣品中分離并得到具有第17位和第83位Cys間非天然ニ硫鍵的變構(gòu)體重組蛋白。
12.權(quán)利要求I中所述新的生物學(xué)作用是指缺失型突變體第17位和第83位Cys間形成非天然ニ硫鍵后，變構(gòu)體分子構(gòu)象發(fā)生顯著變化，除保留原有促上皮細(xì)胞増殖的生物學(xué)活性外，還出現(xiàn)了新的生物學(xué)作用。
13.權(quán)利要求I和12中所述新的生物學(xué)作用包含抑制纖維增生和抑制新生血管生長(zhǎng)。
14.權(quán)利要求13中所述新的抑制纖維增生的生物學(xué)作用適用于預(yù)防和治療纖維化增生性疾病，包含但不限于慢性肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、角膜纖維化和皮膚纖維化。
15.權(quán)利要求13中所述新的抑制新生血管生長(zhǎng)的生物學(xué)作用適用于預(yù)防和治療血管增生性疾病，包含但不限于視網(wǎng)膜黃斑、新生血管瘤以及腫瘤的血管增生。
16.權(quán)利要求14-15中的特征是含缺失型人角質(zhì)生長(zhǎng)因子-Iニ硫鍵變構(gòu)體重組蛋白的藥物組合，該藥物組合為在有效劑量下制備而成的藥物制劑。
17.權(quán)利要求16中所述藥物制劑主要指液體水針、凍干粉針、緩控釋劑、滴眼藥劑、透皮制劑、粘膜噴劑、外用藥劑以及 脂質(zhì)體藥劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅰ二硫鍵變構(gòu)體及其制備和應(yīng)用，其特征為該二硫鍵變構(gòu)體含有對(duì)應(yīng)于天然人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅰ第40位和第106位半胱氨酸間的非天然二硫鍵結(jié)構(gòu)。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)制備獲得重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅰ缺失型突變體后，通過(guò)特有的二硫鍵配對(duì)復(fù)性方法促使形成缺失型突變體第17位和第83位半胱氨酸間的非天然二硫鍵。該二硫鍵變構(gòu)體具有抑制纖維增生、抑制新生血管生長(zhǎng)的生物學(xué)作用，臨床上有望開發(fā)成預(yù)防和治療纖維化增生性疾病和血管增生性疾病的藥物。
文檔編號(hào)C07K14/475GK102675449SQ20111006381
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者萬(wàn)穎, 何建軍, 張?jiān)鰸? 李祥, 范開, 謝敏, 陳勇 申請(qǐng)人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司